Unicellulari registrazioni di aspirazione da Fotorecettori Cone mouse

In questo video viene mostrata la dissezione della retina del topo e il successivo ottenimento di registrazioni singole mediante aspirazione cellulare per i coni. I bulbi oculari di un topo adattato al buio e sottoposto a eutanasia vengono cauterizzati nella parte dorsale e nucleati sotto luce rossa fioca. Successivamente, i bulbi oculari vengono divisi in emisettori.

Lungo l'equatore, vengono rimossi la cornea e le parti ventrali dei bulbi oculari. La retina dorsale viene isolata dallo strato dell'epitelio pigmentato e tagliata in piccoli pezzi sottili utilizzando una lametta da rasoio. Le fette di retina vengono quindi posizionate nella camera di registrazione adatta al piatto del microscopio.

Vengono aspirati nell'elettrodo di registrazione diversi corpi cellulari di fotoricettori. Quando un fotoricettore cono viene aspirato nell'elettrodo, un lampo di prova intenso indurrà una risposta fotoelettrica con un'ampiezza superiore a quattro picoampere. Ciao. Ciao. Sono Jin del laboratorio del Dottor Mir Kops del Dipartimento di Oftalmologia e del centro per il senso visivo presso l'Università di Washington a St. Louis.

Oggi vi mostreremo un procedimento per registrare le risposte fotoelettriche da singoli fotoricettori di Moscon. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare le proprietà di adattamento dei coni dei mammiferi, i fotoricettori responsabili della nostra visione diurna. Cominciamo dunque.

Un giorno prima della registrazione, eseguire l'esperimento al buio. Adattare un topo collocandolo per tutta la notte in una gabbia ermetica alla luce. Utilizzare un tiratore di micropipette per fabbricare elettrodi di registrazione a partire da tubi di vetro borosilicato al microscopio composto.

Utilizzare un filamento riscaldante per tirare. Lucidare la punta di ogni elettrodo per renderla liscia e ridurre l'apertura al diametro desiderato. Per la registrazione da singola cellula conica del mouse mediante aspirazione, il diametro interno della punta dell'elettrodo dovrebbe essere di circa sei-sette micrometri.

Preparare una soluzione al 1% di agar in acqua distillata. Riscaldare la soluzione in acqua bollente per sciogliere l'agar. Una volta sciolto l'agar, trasferirlo in una siringa e riempire le pipette di vetro con la soluzione.

Per preparare gli elettrodi di riferimento, lasciarli solidificare per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo che l'agarosio si è solidificato, utilizzare un coltello a diamante per tagliare ogni pipetta a metà e ottenere due elettrodi di riferimento. Posizionare gli elettrodi di riferimento in un vial per scintillazione riempito con soluzione di riferimento e lasciarli in ammollo per almeno 24 ore a quattro gradi Celsius, in modo che la soluzione penetri nel gel di agarosio.

Gli elettrodi di riferimento possono essere utilizzati per un massimo di tre mesi a partire dalla data di preparazione. Gli elettrodi usati vengono smaltiti al termine dell'esperimento. Il sistema di registrazione è composto da un microscopio invertito montato su un tavolo a sospensione pneumatica per ridurre al minimo il rumore vibrazionale, schermato da una gabbia di Faraday per ridurre al minimo il rumore elettromagnetico.

Un micromanipolatore motorizzato viene utilizzato per posizionare l'elettrodo di registrazione. Lo stimolatore ottico è composto da un filamento al tungsteno, otturatori controllati dal computer e filtri ottici per regolare lunghezza d'onda e intensità della luce. Un amplificatore per la tecnica del patch clamp viene utilizzato per rilevare le correnti di membrana da singole cellule fotoricettori.

Durante le registrazioni, il tessuto verrà perfuso. Posizionare un litro di soluzione di perfusione preparata in un bagno d'acqua a 40 gradi Celsius vicino al sistema di registrazione. Successivamente, utilizzando dei tubicini, collegare la soluzione di perfusione a una miscela di 95%ossigeno e 5%anidride carbonica in modo che continui a formare bolle.

Utilizzando un fotometro, misurare la potenza luminosa non attenuata della luce proveniente dallo stimolatore ottico; il rilevatore del fotometro viene posizionato sul piano della piastra del microscopio dove sarà collocato il preparato. Successivamente, convertire la lettura fornita in micro watt in fotoni per micrometro quadrato al secondo per stimare il numero di fotoni per test. Impulsione luminosa tenendo conto dell'attenuazione della luce causata dai filtri neutri di densità.

Dopo aver misurato l'intensità luminosa non attenuata, rimuovere il fotometro dalla piastra e montare sulla piastra del microscopio invertito la camera di registrazione da utilizzare per gli esperimenti. Collegare, mediante tubi, la bottiglia contenente la soluzione di perfusione, attraverso una valvola regolatrice, alla camera di registrazione, facendo passare i tubi attraverso un resistore riscaldante.

Assicurarsi che la resistenza riscaldante sia posizionata immediatamente prima della camera di registrazione. Quindi collegare il tubo di by-pass dalla valvola regolatrice alla camera di registrazione. Avviare la perfusione aprendo e regolando la valvola regolatrice del flusso a una portata di uno a 1,5 millilitri al minuto.

La soluzione di perfusione defluisce dalla camera di registrazione e si riversa in un matraccio di raccolta per gravità. Utilizzare una siringa con ago smussato per riempire i supporti degli elettrodi con la soluzione di riferimento. Con un ago per siringa microfill, riempire e sciacquare l'elettrodo di registrazione con la soluzione di riferimento, assicurandosi che non vi siano bolle d'aria nell'elettrodo.

Inserire l'elettrodo di riferimento in un porta-elettrodi e collegarlo al polo di riferimento dello stadio iniziale dell'amplificatore. Utilizzare un anello di gomma per fissare la termocoppia all'elettrodo di riferimento. Assicurarsi di posizionare le punte dell'elettrodo e della termocoppia il più vicino possibile, in modo che la lettura della temperatura venga effettuata il più vicino possibile alla cellula.

Inserire quindi l'elettrodo di registrazione in un supporto per elettrodi e fissare il supporto allo stadio della testa dell'amplificatore. Utilizzando un tubicino, collegare un piccolo serbatoio di olio minerale alla porta laterale del supporto per elettrodi. Una leggera aspirazione orale attraverso il tubicino collegato al serbatoio permetterà di attirare la cellula all'interno dell'elettrodo.

Utilizzando il software del computer, aprire uno degli otturatori dello stimolatore ottico. Per visualizzare l'area del fascio del lampo di prova sulla piastra del microscopio, mettere a fuoco il microscopio sul fondo della camera di registrazione. Utilizzando il micromanipolatore, spostare l'elettrodo al centro dell'area illuminata dal fascio del lampo di prova.

Posizionare l'elettrodo di riferimento vicino alla punta dell'elettrodo di registrazione. Regolare la tensione del riscaldatore in modo che la temperatura della soluzione nella camera di registrazione sia di circa 36-38 gradi Celsius. Quando si esegue un test di sigillo, che misura la tensione a un'ampiezza di corrente preimpostata, per calcolare la resistenza al fine di verificare la resistenza dell'elettrodo di registrazione, normalmente di circa 900 kiloohm.

Il test di sigillatura permette di rilevare bolle nell'elettrodo di registrazione o in quello di riferimento oppure una dimensione inadeguata della punta dell'elettrodo di registrazione. Il test di sigillatura è controllato via software dal programma di acquisizione Clamp X. Il valore di resistenza viene visualizzato sullo schermo del computer. Se la resistenza è troppo bassa, inferiore a 500 chiloohm, la punta dell'elettrodo è probabilmente troppo grande e sarà necessario installare un nuovo elettrodo.

Se la resistenza è superiore a un milliohm, potrebbe essere presente una bolla nell'elettrodo o la sua punta è troppo stretta, e pertanto l'elettrodo dovrà essere sciacquato o sostituito. Una volta che l'apparato di registrazione è pronto, preparare le sezioni retiniche per l'esperimento sotto una luce rossa fioca; utilizzare la punta dell'ago da dissezione riscaldato per cauterizzare la sclera nel punto più dorsale di ciascun bulbo oculare di un topo adattato al buio e sacrificato. Successivamente, enucleare i bulbi oculari utilizzando le forbici.

Utilizzare pinzette smussate per trasferire i bulbi oculari su un microscopio stereoscopico dotato di illuminazione a infrarossi e convertitori d'immagine a infrarossi. Tutte le ulteriori manipolazioni di dissezione vengono eseguite sotto luce a infrarossi. Successivamente, utilizzando forbici microchirurgiche, aprire il bulbo oculare lungo l'equatore, fatta eccezione per il punto di cauterizzazione.

Utilizzare pinzette affilate per rimuovere il cristallino. Successivamente, rimuovere la maggior quantità possibile del corpo vitreo utilizzando il punto di cauterizzazione come riferimento. Utilizzare una lametta per rimuovere la parte ventrale della coppa oculare.

Quindi rimuovere la cornea. Successivamente, utilizzare una pinzetta per staccare la retina dorsale dallo strato dell'epitelio pigmentato. Poi posizionare la retina con il lato dei recettori rivolto verso l'alto sul fondo di una nuova piastra di Petri riempita con uno o due millilitri di una soluzione di riferimento di glucosio 10 millimolare con BSA 0,1%, premendo delicatamente sulla retina con una lametta per appiattirla.

Tagliare la retina in piccoli pezzi sottili. Quindi incubare il preparato in una scatola di tipo luminoso continuamente saturata con ossigeno puro prima di aggiungere le fette di retina sulla camera di registrazione. Spegnere temporaneamente il riscaldatore.

Passare il flusso di perfusione al tubo di bypass. Quindi, utilizzando un fazzoletto in tessuto non tessuto, rimuovere la maggior parte della soluzione dalla camera. Accendere l'illuminazione a infrarossi.

Rimuovere la sospensione della retina dall'incubatrice e trasferire le sezioni nella camera di registrazione. Utilizzando una pipetta di trasferimento con apertura larga, lasciare sedimentare le sezioni per due minuti. Dopo che le sezioni della retina si sono sedimentate, riattivare la perfusione diretta e il riscaldatore.

Individuare un frammento di retina con i suoi segmenti esterni dei fotorecettori che sporgono. Posizionare la punta dell'elettrodo di registrazione sopra lo strato nucleare esterno della retina utilizzando l'aspirazione orale. Aspirare delicatamente diversi corpi cellulari dei fotorecettori all'interno dell'elettrodo, facendo entrare le cellule nell'elettrodo.

Fornire un lampo di prova della durata di 20 millisecondi a 500 nanometri. La variazione della corrente indotta dalla luce che attraversa il fotoricettore rappresenta la risposta al lampo di prova. Un cono sano produrrà un'ampiezza di risposta massima compresa tra quattro e sette picoampere (pA).

Quando stimolato con un lampo di prova non attenuato. Una volta trovata una buona cellula, abbassare delicatamente a mano il serbatoio dell'olio minerale per applicare una leggera pressione negativa alla punta dell'elettrodo, al fine di aiutare a trattenere il segmento interno della cellula all'interno dell'elettrodo. Se la cellula è responsiva, registrare una serie di risposte a lampi di prova con intensità compresa tra la soglia e la saturazione.

Utilizzando questa tecnica, possiamo ottenere risposte fotoelettriche dai coni in sezioni retiniche di topo con l'aiuto di un elettrodo a suggente. Qui viene mostrata una sovrapposizione di diverse registrazioni provenienti dalla stessa cellula. Le risposte fotoelettriche di un singolo cono sono state indotte da lampi di prova di intensità crescente, da una luce debole, che genera una risposta soglia di circa un picoampere, fino a un'intensità luminosa elevata, che genera una risposta saturata di circa 5,5 picoampere.

All'aumentare dell'intensità del lampo, l'ampiezza della risposta fotoelettrica aumenta fino a raggiungere la saturazione. I lampi vengono somministrati al tempo pari a zero. Mostreremo semplicemente come registrare le risposte fotoelettriche da singoli fotoricettori di moscerino utilizzando un elettrodo a suggente.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di ottenere la parte do do della retina, di tagliare la retina in sezioni sottili, di mantenere l'elettrodo pulito da bolle e di minimizzare sia i rumori meccanici sia quelli elettromagnetici. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.