Name: Unicellulari registrazioni di aspirazione da Fotorecettori Cone mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-01-05T20:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 35 s
Description: Impara a registrare risposte flash da singoli coni di topo usando elettrodi a aspirazione. Questo metodo elettrofisiologico permette di studiare le proprietà dei fotorecettori coni in neuroscienza visiva.

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Supportato da Career Development Award da ricerca per prevenire la cecità, NIH concedere EY 019312, e sovvenzione illimitata di ricerca per prevenire la cecità e EY 02687 (Department of Ophthalmology &amp; Visual Sciences alla Washington University).

Fare elettrodi <ol><li> Rendere gli elettrodi di registrazione con un estrattore micropipetta e lucidare gli elettrodi con filamento di riscaldamento sotto il microscopio. Per la registrazione cono di aspirazione del mouse singola cellula, il diametro interno sulla punta dell&#39;elettrodo è di circa 6-7 micron. </li><li> Preparare elettrodi di riferimento. Pesare 1% agar-agar in acqua distillata. Sciogliete la soluzione agar in bagno d&#39;acqua calda. Riempire le pipette di vetro (L = 100 mm, OD / ID = 1/0.75 mm) con l&#39;1% agar con siringa. Solidificare l&#39;agar a temperatura ambiente per 10 minuti. </li><li> Tagliare le pipette a metà con un coltello di diamante. </li><li> Immergere gli elettrodi di riferimento nella soluzione di riferimento per almeno 24 ore a 4 ° C. </li></ol> Di iniziare l&#39;esperimento <ol start="5"><li> Scuro adattare un topo in una gabbia nera durante la notte. </li><li> La preparazione di 100 ml soluzione di riferimento e soluzione 1 perfusione L (vedi sotto) e filtrare la soluzione. </li><li> Sciogliere 0,1% BSA e 10 mM glucosio in 20 mL di soluzione di riferimento. </li><li> Calibrare l&#39;intensità della luce dello stimolatore ottico con fotometro. </li><li> Montare la camera di registrazione sul palco del microscopio invertito. </li><li> Bolla la soluzione di perfusione con il 95% O 2 / 5% di CO 2, incubare a 40 ° C acqua del bagno per aumentare la solubilità di CO 2. La soluzione fluisce dalla bottiglia alla camera di registrazione passa attraverso una resistenza ceramica riscaldamento a 36-38 ° C. Il riscaldatore deve essere posizionato più vicino alla camera di registrazione possibile, idealmente nella fase del microscopio. </li><li> Regolare il regolatore di flusso per una portata di circa 1-1,5 ml / min. </li><li> Riempire l&#39;elettrodo di registrazione con la soluzione di riferimento. Inserire l&#39;elettrodo in una porta elettrodo. Assicurarsi che non vi siano bolle in dell&#39;elettrodo. Montare il supporto sulla headstage dell&#39;amplificatore. Collegare il titolare di un dispositivo di aspirazione, che è costruito da collegamento di tubi parzialmente riempito con olio minerale al side-port del titolare elettrodo. L&#39;altra estremità del tubo è collegato ad un piccolo serbatoio di olio minerale, a cui la pressione può essere applicata per via orale. </li><li> Collegare l&#39;elettrodo di riferimento per l&#39;altro polo del headstage. Associare la coppia termica (TC) per l&#39;elettrodo di riferimento. Assicurarsi che le punte degli elettrodi e TC sono vicini tra loro in modo che la lettura della temperatura è presa il più vicino alla cella possibile. </li><li> Accendere l&#39;illuminazione a infrarossi per visualizzare l&#39;elettrodo. L&#39;elettrodo è vista da telecamera a infrarossi collegata a un monitor. Centrare l&#39;immagine elettrodo sul campo visivo e del monitor utilizzando un micro-manipolatore. </li><li> Regolare la posizione della punta stretta elettrodo di riferimento (2-4 mm) per l&#39;elettrodo di registrazione. </li><li> Regolare la tensione continua per il riscaldamento in modo che la temperatura della soluzione è di circa 36-38 ° C. </li><li> Eseguire un test di tenuta per verificare la resistenza di elettrodo di registrazione, di solito circa 900 kΩ. </li></ol> Isolare la retina del mouse <ol start="18"><li> Sotto fioca luce rossa, eutanasia il mouse adattato all&#39;oscurità con CO 2 e dislocazione cervicale. Segna i bulbi oculari usando la punta di una torcia metallo caldo da cauterizzare il punto più dorsale della sclera leggermente. Enucleare i bulbi oculari con le forbici. Tutte le procedure successive sono eseguite sotto la luce a infrarossi. </li><li> Hemisect i bulbi oculari sotto microscopio con illuminazione a infrarossi e convertitori di immagini. </li><li> Togliere la cornea e la lente. Rimuovere la maggior quantità di vitreo possibile. </li><li> Per registrare M-cono risposte, rimuovere la parte ventrale della conchiglia oculare 4 con una lametta a giudicare dal punto cauterizzazione. </li><li> Sbucciare la retina dallo strato dell&#39;epitelio pigmentato. </li><li> Appiattire la retina e posizionarlo sul fondo della scatola di Petri riempite con 1-2 mL di soluzione di riferimento. </li><li> Tagliate la retina in piccoli pezzi sottili con una lametta e incubare la preparazione in una scatola a tenuta di luce satura di ossigeno puro. </li></ol> Registrazioni <ol start="25"><li> Spegnere il riscaldatore temporaneamente. Accendere il flusso di perfusione ad una tubazione di bypass per evitare che la camera di essiccazione. </li><li> Scolate la maggior parte della soluzione nella camera con un pezzo di tessuto Kimwipe. Trasferire la sospensione retina alla camera di registrazione usando una pipetta di vetro. </li><li> Attendere circa 2 minuti fino a quando le fette retina stabilirsi. Accendere la perfusione indietro. Accendere il riscaldamento. </li><li> Accendere l&#39;illuminazione a infrarossi per visualizzare la preparazione. Ricerca di un pezzo di retina sdraiato sul da camera con segmenti esterni dei fotorecettori sporgenti (vedi figura esempio). Disegnare i segmenti interni dolcemente verso l&#39;elettrodo di aspirazione. In questa configurazione, i nuclei numerosi e segmenti interni deve essere aspirato nella dell&#39;elettrodo. Registrare il fotorisposta di un lampo luminoso per verificare se un segmento di cono interno è l&#39;elettrodo e se la cella è guariretua, a giudicare dalla risposta cinetica e ampiezza. </li><li> Abbassare il serbatoio minerale di applicare una leggera pressione negativa per la punta di un elettrodo per contribuire a tenere il segmento interno nella elettrodo. </li><li> Record di prova-flash risposte dim all&#39;intensità luminosa una volta una cella buona è stata trovata. Lampi di prova sono forniti da un calibrato stimolatore ottico 5. L&#39;intensità del flash e lunghezza d&#39;onda sono controllati da una serie di filtri a densità neutra e filtri di interferenza a banda stretta, rispettivamente. Test di durata del flash (20 ms) è controllato da computer-guidata persiane. </li></ol> Soluzioni <ol><li> Topo soluzione perfusione: 112,5 mM NaCl, 3.6 mM KCl, 2,4 mM MgCl 2, 1.2 mM CaCl 2, 10 HEPES mM (pH 7,4), 20 mM NaHCO 3, 3 mM Na succinato, 0,5 mM Na glutammato, 0.02 mM EDTA, e 10 mM glucosio. </li><li> Topo elettrodo soluzione di registrazione: 140 mM NaCl, 3.6 mM KCl, 2,4 mM MgCl 2, 1.2 mM CaCl 2, 3 HEPES mM (pH 7,4), 0,02 mM EDTA. </li></ol>

<ol><li>Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+fluctuations+in+membrane+current+of+single+toad+rod+outer+segments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments.</a> Nature. 269, 78-80 (1977).</li>
<li>Nikonov, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptors+of+Nrl+-%2F-+mice+coexpress+functional+S-+and+M-cone+opsins+having+distinct+inactivation+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Photoreceptors of Nrl -/- mice coexpress functional S- and M-cone opsins having distinct inactivation mechanisms.</a> J Gen Physiol. 125, 287-304 (2005).</li>
<li>Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. JR <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+features+of+the+S-+and+M-cone+photoreceptors+of+wild-type+mice+from+single-cell+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiological features of the S- and M-cone photoreceptors of wild-type mice from single-cell recordings.</a> J Gen Physiol. 127, 359-374 (2006).</li>
<li>Applebury, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+cone+photoreceptor%3A+a+single+cone+type+expresses+both+S+and+M+opsins+with+retinal+spatial+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The murine cone photoreceptor: a single cone type expresses both S and M opsins with retinal spatial patterning.</a> Neuron. 27, 513-523 (2000).</li>
<li>Cornwall, M. C., Fein, A., MacNichol, E. F. JR <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+that+underlie+bleaching+and+background+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms that underlie bleaching and background adaptation.</a> J Gen Physiol. 96, 345-372 (1990).</li>
<li>Calvert, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+in+transgenic+mice+after+targeted+deletion+of+the+rod+transducin+alpha+-subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Phototransduction in transgenic mice after targeted deletion of the rod transducin alpha -subunit.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 13913-13918 (2000).</li>
</ol>

Cella singola registrazione di aspirazione da fotorecettori è stato sviluppato 3 decenni fa. Essa ci permette di registrare trans-membrana variazione di corrente indotta dalla stimolazione luminosa senza penetrare la membrana cellulare. A causa della elevata adesione cellula-cellula, è difficile isolare sano singola asta e il cono di retina del mouse come retina anfibi ed è difficile trovare coni singoli a causa della bassa percentuale (3%) e piccole dimensioni. L&#39;interno-in-segmento (IS-in) metodo di registrazione ...

unicellulari registrazioni di aspirazione da fotorecettori cone mouse

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Bastoncelli e coni della retina sono responsabili per la rilevazione della luce. Nel buio, nucleotidi ciclici-dipendenti (CNG) canali nel segmento esterno sono aperte e permettono il flusso di cationi costantemente verso l&#39;interno attraverso la membrana, la cellula depolarizzanti. Esposizione alla luce provoca la chiusura dei canali CNG, blocca il flusso di corrente verso l&#39;interno zione e, quindi, si traduce in iperpolarizzazione delle cellule. Sulla base della polarità di fotorecettori, un metodo di registrazione di aspirazione è stato sviluppato nel 1970 che, a differenza del classico patch-clamp, non necessita di penetrare la membrana plasmatica<sup&gt; 1</sup&gt;. Disegnare il segmento esterno in una pipetta di vetro stretto raccordo riempito con soluzione extracellulare permette la registrazione dei cambiamenti in atto nelle singole cellule su test-esposizione flash. Tuttavia, questa ben consolidata &quot;esterno-in-segmento (OS-in)&quot; registrazione di aspirazione non è adatto per le registrazioni del cono del mouse, a causa della bassa percentuale di coni nella retina del mouse (3%) e le difficoltà nell&#39;identificare il cono segmenti esterni. Recentemente, un interno-in-segmento (IS-in) la registrazione di configurazione è stato sviluppato per disegnare il segmento interno / regione nucleare del fotorecettore nella pipetta di registrazione<sup&gt; 2,3</sup&gt;. In questo video, ci mostrerà come registrare da fotorisposte singoli cono del mouse utilizzando una singola cella di elettrodi di aspirazione.

Mostreremo come registrare le risposte flash da coni del mouse utilizzando un elettrodo di aspirazione.

Unicellulari registrazioni di aspirazione da Fotorecettori Cone mouse

I fotorecettori a bastoncello e a cono della retina sono responsabili della rilevazione della luce. Al buio, i canali regolati da nucleotidi ciclici (CNG) nel segmento esterno...

In questo video viene mostrata la dissezione della retina del topo e il successivo ottenimento di registrazioni singole mediante aspirazione cellulare per i coni. I bulbi oculari di un topo adattato al buio e sottoposto a eutanasia vengono cauterizzati nella parte dorsale e nucleati sotto luce rossa fioca. Successivamente, i bulbi oculari vengono divisi in emisettori.Lungo l'equatore, vengono rimossi la cornea e le parti ventrali dei bulbi oculari. La retina dorsale viene isolata dallo strato dell'epitelio pigmentato e tagliata in piccoli pezzi sottili utilizzando una lametta da rasoio. Le fette di retina vengono quindi posizionate nella camera di registrazione adatta al piatto del microscopio.Vengono aspirati nell'elettrodo di registrazione diversi corpi cellulari di fotoricettori. Quando un fotoricettore cono viene aspirato nell'elettrodo, un lampo di prova intenso indurrà una risposta fotoelettrica con un'ampiezza superiore a quattro picoampere. Ciao. Ciao. Sono Jin del laboratorio del Dottor Mir Kops del Dipartimento di Oftalmologia e del centro per il senso visivo presso l'Università di Washington a St. Louis.Oggi vi mostreremo un procedimento per registrare le risposte fotoelettriche da singoli fotoricettori di Moscon. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare le proprietà di adattamento dei coni dei mammiferi, i fotoricettori responsabili della nostra visione diurna. Cominciamo dunque.Un giorno prima della registrazione, eseguire l'esperimento al buio. Adattare un topo collocandolo per tutta la notte in una gabbia ermetica alla luce. Utilizzare un tiratore di micropipette per fabbricare elettrodi di registrazione a partire da tubi di vetro borosilicato al microscopio composto.Utilizzare un filamento riscaldante per tirare. Lucidare la punta di ogni elettrodo per renderla liscia e ridurre l'apertura al diametro desiderato. Per la registrazione da singola cellula conica del mouse mediante aspirazione, il diametro interno della punta dell'elettrodo dovrebbe essere di circa sei-sette micrometri.Preparare una soluzione al 1% di agar in acqua distillata. Riscaldare la soluzione in acqua bollente per sciogliere l'agar. Una volta sciolto l'agar, trasferirlo in una siringa e riempire le pipette di vetro con la soluzione.Per preparare gli elettrodi di riferimento, lasciarli solidificare per 10 minuti a temperatura ambiente. Dopo che l'agarosio si è solidificato, utilizzare un coltello a diamante per tagliare ogni pipetta a metà e ottenere due elettrodi di riferimento. Posizionare gli elettrodi di riferimento in un vial per scintillazione riempito con soluzione di riferimento e lasciarli in ammollo per almeno 24 ore a quattro gradi Celsius, in modo che la soluzione penetri nel gel di agarosio.Gli elettrodi di riferimento possono essere utilizzati per un massimo di tre mesi a partire dalla data di preparazione. Gli elettrodi usati vengono smaltiti al termine dell'esperimento. Il sistema di registrazione è composto da un microscopio invertito montato su un tavolo a sospensione pneumatica per ridurre al minimo il rumore vibrazionale, schermato da una gabbia di Faraday per ridurre al minimo il rumore elettromagnetico.Un micromanipolatore motorizzato viene utilizzato per posizionare l'elettrodo di registrazione. Lo stimolatore ottico è composto da un filamento al tungsteno, otturatori controllati dal computer e filtri ottici per regolare lunghezza d'onda e intensità della luce. Un amplificatore per la tecnica del patch clamp viene utilizzato per rilevare le correnti di membrana da singole cellule fotoricettori.Durante le registrazioni, il tessuto verrà perfuso. Posizionare un litro di soluzione di perfusione preparata in un bagno d'acqua a 40 gradi Celsius vicino al sistema di registrazione. Successivamente, utilizzando dei tubicini, collegare la soluzione di perfusione a una miscela di 95%ossigeno e 5%anidride carbonica in modo che continui a formare bolle.Utilizzando un fotometro, misurare la potenza luminosa non attenuata della luce proveniente dallo stimolatore ottico; il rilevatore del fotometro viene posizionato sul piano della piastra del microscopio dove sarà collocato il preparato. Successivamente, convertire la lettura fornita in micro watt in fotoni per micrometro quadrato al secondo per stimare il numero di fotoni per test. Impulsione luminosa tenendo conto dell'attenuazione della luce causata dai filtri neutri di densità.Dopo aver misurato l'intensità luminosa non attenuata, rimuovere il fotometro dalla piastra e montare sulla piastra del microscopio invertito la camera di registrazione da utilizzare per gli esperimenti. Collegare, mediante tubi, la bottiglia contenente la soluzione di perfusione, attraverso una valvola regolatrice, alla camera di registrazione, facendo passare i tubi attraverso un resistore riscaldante.Assicurarsi che la resistenza riscaldante sia posizionata immediatamente prima della camera di registrazione. Quindi collegare il tubo di by-pass dalla valvola regolatrice alla camera di registrazione. Avviare la perfusione aprendo e regolando la valvola regolatrice del flusso a una portata di uno a 1,5 millilitri al minuto.La soluzione di perfusione defluisce dalla camera di registrazione e si riversa in un matraccio di raccolta per gravità. Utilizzare una siringa con ago smussato per riempire i supporti degli elettrodi con la soluzione di riferimento. Con un ago per siringa microfill, riempire e sciacquare l'elettrodo di registrazione con la soluzione di riferimento, assicurandosi che non vi siano bolle d'aria nell'elettrodo.Inserire l'elettrodo di riferimento in un porta-elettrodi e collegarlo al polo di riferimento dello stadio iniziale dell'amplificatore. Utilizzare un anello di gomma per fissare la termocoppia all'elettrodo di riferimento. Assicurarsi di posizionare le punte dell'elettrodo e della termocoppia il più vicino possibile, in modo che la lettura della temperatura venga effettuata il più vicino possibile alla cellula.Inserire quindi l'elettrodo di registrazione in un supporto per elettrodi e fissare il supporto allo stadio della testa dell'amplificatore. Utilizzando un tubicino, collegare un piccolo serbatoio di olio minerale alla porta laterale del supporto per elettrodi. Una leggera aspirazione orale attraverso il tubicino collegato al serbatoio permetterà di attirare la cellula all'interno dell'elettrodo.Utilizzando il software del computer, aprire uno degli otturatori dello stimolatore ottico. Per visualizzare l'area del fascio del lampo di prova sulla piastra del microscopio, mettere a fuoco il microscopio sul fondo della camera di registrazione. Utilizzando il micromanipolatore, spostare l'elettrodo al centro dell'area illuminata dal fascio del lampo di prova.Posizionare l'elettrodo di riferimento vicino alla punta dell'elettrodo di registrazione. Regolare la tensione del riscaldatore in modo che la temperatura della soluzione nella camera di registrazione sia di circa 36-38 gradi Celsius. Quando si esegue un test di sigillo, che misura la tensione a un'ampiezza di corrente preimpostata, per calcolare la resistenza al fine di verificare la resistenza dell'elettrodo di registrazione, normalmente di circa 900 kiloohm.Il test di sigillatura permette di rilevare bolle nell'elettrodo di registrazione o in quello di riferimento oppure una dimensione inadeguata della punta dell'elettrodo di registrazione. Il test di sigillatura è controllato via software dal programma di acquisizione Clamp X. Il valore di resistenza viene visualizzato sullo schermo del computer. Se la resistenza è troppo bassa, inferiore a 500 chiloohm, la punta dell'elettrodo è probabilmente troppo grande e sarà necessario installare un nuovo elettrodo.Se la resistenza è superiore a un milliohm, potrebbe essere presente una bolla nell'elettrodo o la sua punta è troppo stretta, e pertanto l'elettrodo dovrà essere sciacquato o sostituito. Una volta che l'apparato di registrazione è pronto, preparare le sezioni retiniche per l'esperimento sotto una luce rossa fioca; utilizzare la punta dell'ago da dissezione riscaldato per cauterizzare la sclera nel punto più dorsale di ciascun bulbo oculare di un topo adattato al buio e sacrificato. Successivamente, enucleare i bulbi oculari utilizzando le forbici.Utilizzare pinzette smussate per trasferire i bulbi oculari su un microscopio stereoscopico dotato di illuminazione a infrarossi e convertitori d'immagine a infrarossi. Tutte le ulteriori manipolazioni di dissezione vengono eseguite sotto luce a infrarossi. Successivamente, utilizzando forbici microchirurgiche, aprire il bulbo oculare lungo l'equatore, fatta eccezione per il punto di cauterizzazione.Utilizzare pinzette affilate per rimuovere il cristallino. Successivamente, rimuovere la maggior quantità possibile del corpo vitreo utilizzando il punto di cauterizzazione come riferimento. Utilizzare una lametta per rimuovere la parte ventrale della coppa oculare.Quindi rimuovere la cornea. Successivamente, utilizzare una pinzetta per staccare la retina dorsale dallo strato dell'epitelio pigmentato. Poi posizionare la retina con il lato dei recettori rivolto verso l'alto sul fondo di una nuova piastra di Petri riempita con uno o due millilitri di una soluzione di riferimento di glucosio 10 millimolare con BSA 0,1%, premendo delicatamente sulla retina con una lametta per appiattirla.Tagliare la retina in piccoli pezzi sottili. Quindi incubare il preparato in una scatola di tipo luminoso continuamente saturata con ossigeno puro prima di aggiungere le fette di retina sulla camera di registrazione. Spegnere temporaneamente il riscaldatore.Passare il flusso di perfusione al tubo di bypass. Quindi, utilizzando un fazzoletto in tessuto non tessuto, rimuovere la maggior parte della soluzione dalla camera. Accendere l'illuminazione a infrarossi.Rimuovere la sospensione della retina dall'incubatrice e trasferire le sezioni nella camera di registrazione. Utilizzando una pipetta di trasferimento con apertura larga, lasciare sedimentare le sezioni per due minuti. Dopo che le sezioni della retina si sono sedimentate, riattivare la perfusione diretta e il riscaldatore.Individuare un frammento di retina con i suoi segmenti esterni dei fotorecettori che sporgono. Posizionare la punta dell'elettrodo di registrazione sopra lo strato nucleare esterno della retina utilizzando l'aspirazione orale. Aspirare delicatamente diversi corpi cellulari dei fotorecettori all'interno dell'elettrodo, facendo entrare le cellule nell'elettrodo.Fornire un lampo di prova della durata di 20 millisecondi a 500 nanometri. La variazione della corrente indotta dalla luce che attraversa il fotoricettore rappresenta la risposta al lampo di prova. Un cono sano produrrà un'ampiezza di risposta massima compresa tra quattro e sette picoampere (pA).Quando stimolato con un lampo di prova non attenuato. Una volta trovata una buona cellula, abbassare delicatamente a mano il serbatoio dell'olio minerale per applicare una leggera pressione negativa alla punta dell'elettrodo, al fine di aiutare a trattenere il segmento interno della cellula all'interno dell'elettrodo. Se la cellula è responsiva, registrare una serie di risposte a lampi di prova con intensità compresa tra la soglia e la saturazione.Utilizzando questa tecnica, possiamo ottenere risposte fotoelettriche dai coni in sezioni retiniche di topo con l'aiuto di un elettrodo a suggente. Qui viene mostrata una sovrapposizione di diverse registrazioni provenienti dalla stessa cellula. Le risposte fotoelettriche di un singolo cono sono state indotte da lampi di prova di intensità crescente, da una luce debole, che genera una risposta soglia di circa un picoampere, fino a un'intensità luminosa elevata, che genera una risposta saturata di circa 5,5 picoampere.All'aumentare dell'intensità del lampo, l'ampiezza della risposta fotoelettrica aumenta fino a raggiungere la saturazione. I lampi vengono somministrati al tempo pari a zero. Mostreremo semplicemente come registrare le risposte fotoelettriche da singoli fotoricettori di moscerino utilizzando un elettrodo a suggente.Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di ottenere la parte do do della retina, di tagliare la retina in sezioni sottili, di mantenere l'elettrodo pulito da bolle e di minimizzare sia i rumori meccanici sia quelli elettromagnetici. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Qui si descrive una procedura per la generazione di dark-adattato fette della retina del mouse per le registrazioni elettrofisiologiche.

Bloccare Registrazioni patch da neuroni della retina del mouse in un Dark-adattato Preparazione Slice

Descriviamo un metodo relativamente semplice di transretinal elettroretinogramma (ERG) per l'ottenimento di registrazioni fotorisposte asta e cono da retina di topo intatto. Questo approccio sfrutta il blocco della trasmissione sinaptica da fotorecettori per isolare le loro risposte chiare e registrarli usando elettrodi posizionati sul campo in tutto il isolato piatto montato retina.

Transretinal Recordings ERG di retina di topo: Rod e fotorisposte Cone

Fonte: Laboissonniere, et. al. RNA-seq a singola cellula di sottoinsiemi definiti di cellule gangliari retiniche. J. Vis. Exp. (2017).  Questo video mostra una tecnica di tracciamento fluorescente per identificare i sottotipi di cellule gangliari retiniche (RGC) in una retina di topo transgenico. Il processo prevede il fissaggio della retina isolata in una camera di registrazione, il mantenimento della vitalità cellulare con perfusione ossigenata e il targeting di RGC marcate in fluorescenza...

Identificazione dei sottotipi di cellule gangliari retiniche di topo mediante tracciatura fluorescente

Fonte: Kulkarni, M. et al. Imaging Ca2+ Dinamica nei terminali assonici dei fotorecettori dei coni della retina del topo. J. Vis. Exp. (2015)Questo video dimostra l'uso della microscopia a due fotoni per monitorare la dinamica del calcio nei fotorecettori dei coni di una retina di topo transgenico. Descrive i passaggi per la preparazione delle fette di retina, l'imaging di biosensori di calcio basati su FRET e l'analisi delle variazioni di fluorescenza per quantificare i livelli di calcio in...

Microscopia a due fotoni per il monitoraggio della dinamica del calcio nei fotorecettori dei coni retinici di topo

Descriviamo la preparazione di sottili fettine di retina da acquatico salamandre tigre...

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Vibratome sezionamento mouse Retina preparare Culture fotorecettori

Dimostreremo come preparare fette di retina dall'occhio del topo e registrare le risposte alla luce nei neuroni retinici. L'intera procedura viene eseguita in condizioni adattate al buio.

Registrazione Light-evocato Risposte postsinaptica nei neuroni in Dark-adattati, i preparativi della retina del mouse Slice Utilizzando tecniche di patch clamp

Descriviamo un protocollo per il monitoraggio Ca 2+ dinamiche nei terminali degli assoni dei fotorecettori cono con un ex-vivo la preparazione fetta della retina del mouse. Questo protocollo permette studi completi di cono Ca 2 + Segnalazione di un importante sistema modello mammiferi, il mouse.

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dinamica a cono fotorecettore Axon Terminali della retina di topo

Abbiamo sviluppato una preparazione fetta orizzontale della retina di mammifero adulto con il piano di sezionamento parallelo alla superficie della retina. campi dendritiche di neuroni della retina nonradially orientate non sono stati troncati, consentendo lo studio di elaborazione dei segnali con tecniche di patch-clamp e di imaging.

Preparazione di orizzontali Fette di topo adulto Retina per elettrofisiologiche Studi

Qui presentiamo un approccio combinatorio per la classificazione di tipi di cellule neuronali prima dell'isolamento e per la successiva caratterizzazione di transcriptomi a singola cellula. Questo protocollo ottimizza la preparazione di campioni per il successo RNA Sequencing (RNA-Seq) e descrive una metodologia studiata appositamente per una migliore comprensione della diversità cellulare.

Sequenza RNA a singola cellula di sottogruppi definiti delle cellule del Ganglio retinico

Descriviamo un metodo per ottenere colture primarie di fotorecettori a cono dalla retina degli embrioni di pollo e il suo uso per lo screening ad alto contenuto.

Culture arricchite di coni dalla retina degli embrioni di pollo per studiare le interazioni cellulari tra bastone e cono

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Unicellulari registrazioni di aspirazione da Fotorecettori Cone mouse

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