Realizzazione e di funzionamento di un Inserto di ossigeno per colture cellulari aderenti

Il dispositivo di inserimento ipossico ha sei pilastri che si annidano nei pozzetti di un sei. Il gas della piastra del pozzo scorre attraverso la rete microfluidica alla base del pilastro e può diffondersi attraverso la membrana PDMS permeabile ai gas, separando la rete del gas e i terreni di coltura. Questo dispositivo riduce al minimo la lunghezza del percorso di diffusione tra la sorgente di ossigeno, la rete microfluidica alla base del pilastro e le celle, consentendo una più rapida concentrazione di ossigeno. Equilibrio.

Il dispositivo consente anche un controllo molto maggiore sul modello spaziale dell'ossigeno esposto alle cellule, che è determinato dal design della rete di gas microfluidica realizzata con la fotolitografia standard utilizzando maschere fotografiche. Ciao, sono Sean Ard del laboratorio Dr.David Edington del Dipartimento di Bioingegneria dell'Università dell'Illinois a Chicago. Ciao, sono Ellie, anch'io dell'Edington Lab.

Oggi vi mostreremo come fabbricare, convalidare e utilizzare un dispositivo personalizzato per esporre colture cellulari in vitro in una piastra a sei pieghe a diverse concentrazioni di ossigeno. Abbiamo utilizzato questa procedura nel nostro laboratorio per studiare l'effetto dell'ossigeno sulla guarigione delle ferite, sulla generazione e sulla migrazione delle specie reattive dell'ossigeno. Quindi iniziamo.

Per iniziare la fabbricazione dell'inserto ossigenante, preparare il polimetilsloane o PDMS in un rapporto di 10 a uno tra prepolimero e agente indurente. Secondo le istruzioni del produttore, la miscela PDMS viene aggiunta a uno stampo Dell ran precedentemente lavorato per imitare la forma di una piastra di coltura standard a sei pozzetti. Una volta polimerizzato a 75 gradi Celsius durante la notte, l'array di pilastri modellato replica risultante formerà il primo dei tre componenti che compongono l'inserto ossigenante per fabbricare il secondo componente chiave dell'inserto ossigenante.

Un SU eight master viene preparato filando prima SU 8 21 50. Su un wafer di silicio, al wafer viene applicata una maschera fotografica e l'otto SU viene esposto ai raggi UV attraverso la maschera fotografica per creare uno stampo master con uno spessore del microcanale di 300 micrometri. Versare il PDMS sopra il SU eight Master e polimerizzare per due ore a 75 gradi Celsius per ottenere uno stampo positivo che alla fine formerà i microcanali nella parte inferiore di ciascun pilastro.

Il terzo componente del dispositivo è fabbricato facendo girare il PDMS su un wafer di silicio a 500 RPM per 10 secondi, seguito da 900 RPM per 30 secondi per ottenere un cervello a membrana spesso 100 micrometri. Poiché il PDM è permeabile ai gas, l'ossigeno può essere erogato nei microcanali direttamente attraverso questa membrana. Una volta preparati tutti i componenti, ogni superficie di incollaggio viene sottoposta a trattamento al plasma di ossigeno per un minuto.

Utilizzando un dispositivo al plasma portatile, per prima cosa incollare i sei componenti a microcanali all'array di pilastri, quindi praticare due fori in ciascun pilastro per fungere da ingressi e uscite del gas. Infine incollare la membrana al fondo del microcanale per facilitare l'incollaggio ed espellere eventuali bolle. Le superfici trattate al plasma vengono premute insieme per circa un minuto utilizzando la miscela, l'estremità di un paio di pinzette, attendere un'ora tra ogni incollaggio per assicurarsi che il dispositivo sia completamente incollato e possa essere calibrato.

Una volta che un dispositivo completo è stato fabbricato, è necessario calibrare il livello di ossigeno ricevuto dalle cellule quando si utilizza l'inserto ossigenante negli esperimenti reali. Per la taratura utilizzare un sensore di ossigeno fluorescente o un vetrino volpe, che contiene un rivestimento colorante fluorescente al rutenio che viene spento dall'ossigeno. I vetrini Foxy sono pretagliati per adattarsi al fondo di una piastra a sei pozzetti.

Lo scivolo volpe deve essere tagliato in modo da coprire il più possibile la superficie del pozzo. Poiché il vetrino volpe ha uno spessore di circa un millimetro, modificare il dispositivo per mantenere la distanza desiderata per una membrana adeguata. Diffusione dei vetrini.

Questa distanza dipende dall'esperimento, ma per la maggior parte dei casi dovrebbe essere inferiore a un millimetro utilizzando il microscopio portatile al plasma a quattro tagli di un millimetro di spessore. Far scorrere i montanti di circa sei millimetri di lunghezza e quattro millimetri di larghezza verso la parte inferiore del dispositivo. Il dispositivo poggerà su montanti sopra il taglio della slitta.

I vetrini coprioggetto possono essere utilizzati anche per una fessura di diffusione di 0,17 millimetri per convalidare l'utilizzo dell'ossigeno. A tre millilitri di acqua deionizzata a temperatura ambiente nei pozzetti della piastra a sei pozzetti dove verrà misurato l'ossigeno. Posizionare il dispositivo nella piastra e, utilizzando il software metamorph, selezionare il numero e la posizione delle posizioni desiderate sul sensore foxy.

Scivolo per dosare le concentrazioni di ossigeno. Collegare il tubo della pistola tai tra il serbatoio del gas di ossigeno e il dispositivo di inserimento ipossico. Per il controllo preciso del gas erogato viene utilizzato un regolatore di flusso di precisione impostato su una portata da 50 a 100 millilitri al minuto.

Assicurarsi che il regolatore di flusso di precisione sia chiuso. Aprire prima il regolatore della parte superiore del serbatoio, seguito dal regolatore di precisione. Ridurre la portata tra 10 e 20 al minuto dopo 15 minuti.

Per evitare di creare bolle nell'acqua, osservare attentamente il valore della portata nell'ora successiva e apportare le regolazioni necessarie, poiché la caduta di pressione cambierà mentre il sistema si equilibra, alterando la portata per acquisire immagini della piastra e dei sensori foxy. Vengono utilizzati un microscopio Olympus IX 71 dotato di fluorescenza, una fotocamera con dispositivo di carica a coppia di Q Imaging, i software di acquisizione immagini Tiga, SRV e Metamorpho. Il microscopio è dotato di un Olympus 3 1 0 2 0, un filtro fluorescente compatibile con foxy con una lunghezza d'onda di eccitazione di 475 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 600 nanometri.

Per verificare il tempo di equilibrio e l'entità dell'ossigenazione del dispositivo, scegliere tre punti sul vetrino foxy in cui misurare la concentrazione di ossigeno. Acquisire un'immagine del vetrino immediatamente prima di iniziare il flusso di gas. Acquisisci immagini e intervalli di 10 secondi nell'arco di 30 minuti mentre il gas scorre attraverso il dispositivo per verificare l'eterogeneità e l'erogazione di ossigeno.

Stabilisci più punti a intervalli di un millimetro che coprono la larghezza del canale e misura la concentrazione di ossigeno sulla superficie del pozzo utilizzando la metamorfazione. Esporta l'intensità media dell'immagine per ogni posizione e traccia la concentrazione di ossigenazione in base all'intensità della fluorescenza. Genera una curva di calibrazione adattando le curve lineari alla linea da zero a 10% e dal 10 al 21% che mette in relazione l'intensità della fluorescenza con la concentrazione di ossigeno Per ogni posizione misurata, i dati grezzi di intensità possono essere esportati da metamorph e analizzati ulteriormente con Microsoft Excel o altri software statistici.

Una volta che il dispositivo è stato calibrato, esperimenti come i saggi di guarigione delle ferite possono iniziare in autoclave l'inserto calibrato a 121 gradi Celsius per 15 minuti entro 24 ore prima dell'esperimento e lavorare con esso in una cappa di coltura a flusso laminare per prevenire la successiva contaminazione. Immergere l'inserto PDMS sterilizzato in un terreno privo di siero per 24 ore per inibire le bolle di gas quando si inseriscono nei pozzetti della piastra colture di cellule, cellule MDCK o altre cellule aderenti al 100% di fluenza in una piastra a sei pozzetti per creare graffi dritti nei monostrati con una punta per pipetta P 200. I graffi simulano ferite nel monostrato aderente.

Aspirare il terreno cellulare senza disturbare il monostrato e risciacquare con cinque millilitri di terreno. Aspirare nuovamente e riempire i pozzetti con tre millilitri di siero gratuito. Inserire delicatamente il dispositivo nella piastra, assicurandosi di evitare bolle.

L'angolazione del dispositivo durante l'inserimento aiuta a espellere le bolle da un lato. Fare attenzione a evitare di esercitare una pressione eccessiva sul dispositivo, che potrebbe deformare il PDMS abbastanza da schiacciare le celle sottostanti. Posizionare la piastra e il dispositivo su un tavolino per microscopio riscaldato a 37 gradi Celsius e collegare il tubo dal serbatoio del gas sorgente alle porte di ingresso e uscita del dispositivo.

L'incubatore di coltura deve avere un foro per consentire l'ingresso del tubo e il tubo deve essere collegato Dopo aver posizionato il dispositivo nell'incubatore, seguire la stessa procedura per avviare il flusso di gas come descritto in precedenza per valutare la guarigione delle ferite acquisire immagini time-lapse delle cellule ogni 20 minuti per 15-18 ore utilizzando apparecchiature e software di imaging come descritto in precedenza, L'algoritmo di misurazione del graffio a ferita può essere utilizzato per analizzare l'area superficiale non guarita dopo una durata sperimentale desiderata. Interrompere il flusso di gas, rimuovere la piastra e procedere all'ulteriore lavorazione della cella, se lo si desidera. Il dispositivo di inserimento ipossico richiede meno di due minuti per stabilizzarsi allo 0,5% di ossigeno, come mostrato qui.

La dimensione della fessura inferiore del pozzetto della membrana del dispositivo è stata un fattore critico nel determinare l'efficienza di equilibratura con fessure di dimensioni maggiori che richiedono più tempo per raggiungere i valori di concentrazione di ossigeno allo stato stazionario. Il dispositivo consente inoltre un grande controllo sull'ossigenazione spaziale in un singolo pozzo, consentendo la formazione di molteplici condizioni e persino generando un profilo di ossigeno ciclico sulla superficie del pozzo. I monostrati di cellule MDCK sono stati esposti al 10% o al 21% di ossigeno e l'area superficiale della ferita è stata analizzata nel tempo utilizzando l'algoritmo MATLAB Ts scratch wound tailing.

Dopo 11 ore su 17 ore totali, il 6,87% della ferita originale è rimasto quando esposto al 10% di ossigeno, mentre il 64,4% della ferita è rimasto al di sotto del 21%Come mostrato qui, le concentrazioni di ossigeno sono correlate negativamente con l'area aperta della ferita per entrambe le concentrazioni di ossigeno. Per tutta la durata dell'esperimento, ti abbiamo appena mostrato come fabbricare, convalidare e utilizzare il dispositivo di inserimento ipossico per un test di guarigione delle ferite da graffio. Il dispositivo offre una serie di vantaggi rispetto ad altri sistemi di ossigenazione, come un ingombro ridotto in laboratorio e un controllo molto maggiore sull'ossigenazione spaziale e temporale sulla superficie cellulare.

Il dispositivo può essere utilizzato praticamente da qualsiasi laboratorio che studia l'effetto dell'ossigeno o di altri gas come l'anidride carbonica sulle colture cellulari in vitro. Quando si esegue questa procedura, è importante immergere il dispositivo sterilizzato e il terreno di coltura durante la notte, riducendo al minimo la formazione di bolle durante l'esperimento. Inoltre, consentire al sistema di equiparare prima di iniziare l'esperimento.

Questo perché la portata cambia man mano che la pressione nel sistema si eguaglia. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.