Quantitativa Real-Time PCR utilizzando il Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

In questo articolo video, viene dimostrato il PCR in tempo reale utilizzando saggi Solaris QPCR. I saggi Solaris QPCR sono kit di sonde e primer specifici per gene progettati per rilevare tutte le varianti di splicing note di un determinato gene. In condizioni universali di termociclaggio, la sonda Solaris presenta un legante del solco minore, un gruppo funzionale e un marcatore FA all'estremità cinque primaria e un quencher scuro eclissato all'estremità tre primaria.

Nella fase di denaturazione della PCR in tempo reale, la sonda rimane in soluzione e la fluorescenza del marcatore FAM è soppressa. Durante le fasi di annealing ed estensione, i primer nella sonda si legano alla sequenza bersaglio e il soppressore viene separato dal FAM. Il FAM emette quindi un segnale fluorescente intenso; quando la sonda si dissocia, la fluorescenza viene nuovamente soppressa.

I risultati della PCR in tempo reale dimostrano la sensibilità, specificità e riproducibilità di questo saggio efficiente. Ciao, sono James Covino del team di Ricerca e Sviluppo di Thermo Fisher Scientific di Lafayette, in Colorado. Oggi vi mostreremo una procedura per l'allestimento di una reazione QPCR standard utilizzando i reagenti per l'espressione genica Lars QPCR.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare l'abbattimento di geni bersaglio mediante tecnologie di interferenza dell'RNA. Cominciamo dunque. Il test qPCR Solaris STEM si distingue per un algoritmo unico che sfrutta le tecnologie MGB e basi superiore per fornire un singolo test pratico per il 98% dei geni annotati di uomo e topo.

Normalmente, la progettazione di sonde e primer per il DNA è limitata dalla temperatura di fusione della sonda, che è determinata dal numero e dal tipo di basi. Le sequenze più lunghe e quelle ricche in GC presentano temperature di fusione più elevate. La porzione legante del solco minore utilizzata nelle sonde Solaris si inserisce nel solco minore dell'elica del DNA e stabilizza l'interazione tra la sonda e la sequenza bersaglio.

Questo aumenta la temperatura di fusione, consentendo l'uso di sonde più corte. L'algoritmo Solaris incorpora inoltre selettivamente nucleotidi modificati chiamati super basi per migliorare la stabilità dei legami AT ed eliminare l'associazione autocomplementare GG in sequenze ricche di guanina. Ciò permette l'uso di sequenze bersaglio che altrimenti verrebbero evitate.

La maggiore flessibilità di sequenza conferita dall'utilizzo di queste tecnologie consente la progettazione di set di primer e sonde in grado di riconoscere tutte le varianti di splicing note di un singolo gene. Si noti che, ogni volta che possibile, sono state incluse nelle regioni bersaglio aree che attraversano i giunti degli esoni, al fine di aumentare la specificità evitando l'amplificazione del DNA genomico contaminante; i set di primer e sonde risultanti vengono analizzati mediante blast su tre database diversi: genoma, trascritto e pseudogeni, per garantire specificità. Inoltre, i set di primer e sonde Solaris sono stati completamente ottimizzati in modo tale che le condizioni di ciclatura per tutti i saggi di QPCR siano identiche, consentendo così la valutazione dell'espressione di diversi trascritti in un'unica corsa di PCR.

Per iniziare a pianificare l'esperimento di qPCR R, identificare i reagenti necessari per eseguire la qPCR per il gene di interesse utilizzando la ricerca prodotti Genius, disponibile su thermo.com/solaris. Fare clic nella casella di ricerca e selezionare l'organismo bersaglio appropriato. La ricerca prodotti Genius può elaborare diversi tipi di identificatori genici. Qui.

Inserire uno dei termini di ricerca suggeriti per il gene di interesse, quindi fare clic su "search", identificare il gene di interesse e fare clic su "select" sul lato sinistro. Verrà aperta una finestra che mostra i diversi reagenti disponibili per il gene di interesse. Fare clic sulla scheda di rilevamento QPCR sotto il saggio di espressione genica Solaris.

Viene mostrato un saggio ottimizzato con primer e sonda Solaris. Questo singolo saggio rileverà tutte le varianti di splicing note del gene di interesse. Una volta identificato il primer appropriato, individuare il termociclatore QPCR che verrà utilizzato nel menu e identificare il master mix compatibile, ovvero il master mix con una provetta separata del colorante passivo di riferimento rocks, il rocks mix o il low rocks mix.

Qui utilizzeremo il Roche Light Cycler 480, quindi verrà impiegato il master mix più il vial di rock. È inoltre fondamentale assicurarsi che nello studio venga incluso un gene di riferimento appropriato. Il B2M verrà utilizzato una volta ricevuti tutti i reagenti Solaris QP CR.

Devono essere conservati a meno 20 gradi Celsius fino al momento dell'uso. I reagenti sono stabili per almeno 12 mesi. È consigliabile evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento.

Preparare il CDNA per la QPCR eseguendo reazioni di trascrizione inversa sull'RNA del campione. Una volta preparato il CDNA, scongelare l'assay Solaris e la master mix sul ghiaccio. La master mix contiene tutti i componenti per la PCR quantitativa tranne l'assay specifico per il gene e i componenti del template, che includono termostato, DNA polimerasi dn, TPS rocks.

Se lo strumento di QPCR richiede rocce e un buffer di reazione proprietario contenente un colorante blu interno, tenere a disposizione anche acqua di grado PCR e piastre per QPCR. Una volta che le soluzioni sono state scongelate, mescolarle agitando leggermente, quindi centrifugarle brevemente per evitare perdite di reagente. Successivamente, in un tubo da 15 millilitri, preparare un mix master e un saggio di QPCR Solaris a concentrazione 1x.

Combinare, per il numero desiderato di campioni da analizzare in una piastra da 384 pozzetti, cinque microlitri di mix master 2x, 0,5 microlitri di sonda Solaris 20x e acqua di grado PCR in modo che il volume finale in ciascun pozzetto sia di 10 microlitri. Dopo l'aggiunta del cDNA, assicurarsi di preparare un quantitativo sufficiente per tre replicati di ciascun campione, inclusi un controllo senza stampo (NTC) e un controllo senza trascrittasi inversa (no RT), per verificare rispettivamente la presenza di reagenti contaminati o di DNA genomico contaminante. Successivamente, trasferire il mix in un serbatoio sterile.

Quindi, utilizzando una pipetta multicanale, trasferire il volume appropriato di un master mix x nelle pozzette corrispondenti della piastra PCR. Se si utilizzano piastre bianche, il colorante blu interno incluso nel master mix aiuterà a monitorare l'avanzamento della pipettaggio. Su una stessa piastra è possibile analizzare più librerie di cDNA e geni di riferimento, poiché tutte le condizioni di ciclaggio sono identiche.

Dopo aver aggiunto il master mix 1x nelle pozzette appropriate, aggiungere il template di DNA diluito in ciascuna pozzetta in modo che il volume finale sia di 10 microlitri; aspirare e dispensare più volte con la pipetta per mescolare. Sigillare la piastra con un sigillo adesivo o con un sigillo termico, come mostrato qui.

Posizionare la piastra in una centrifuga ed eseguire una breve centrifugazione per far scendere i reagenti in fondo al pozzetto ed eliminare eventuali bolle d'aria che potrebbero interferire con le letture di fluorescenza. Il termociclatore deve attivare la polimerasi hot-start presente nel master mix Solaris QPCR a 95 gradi Celsius per 15 minuti (un ciclo), seguito da 40 cicli di denaturazione a 95 gradi Celsius per 15 secondi e un'annealing e un'estensione a 60 gradi Celsius per 60 secondi. Questo protocollo è identico per tutti i saggi Soliris QPCR, indipendentemente dal gene che viene amplificato.

Infine, posizionare la piastra nell'apparecchio di QPCR e avviare il programma. Questa figura dimostra l'elevata prestazione dei saggi Solaris: 10 diluizioni decimali di DNA sintetico o cDNA sono state amplificate utilizzando i saggi di espressione genica Solaris QPCR per CDC 20 e F two RL one. Le curve di amplificazione in scala logaritmica e le curve standard per 10 diluizioni logaritmiche in base 10 dimostrano l'elevata prestazione del saggio anche a basse concentrazioni di input.

Le prestazioni di ogni saggio vengono misurate in base all'efficienza, al valore quadrato, all'intervallo dinamico su 10, alle diluizioni logaritmiche in base 10 e al limite inferiore di rilevamento. I dati qui mostrati dimostrano la riproducibilità dei saggi Solaris. In questo caso, aliquote di DNA CD sono state amplificate in due laboratori situati in aree geografiche distinte, utilizzando i saggi Solaris per l'espressione genica mediante qPCR e il master mix.

Sono stati calcolati gli stessi livelli di espressione per due bersagli genici in entrambi i laboratori. Vi abbiamo appena mostrato come impostare una reazione QPCR standard utilizzando i reagenti per l'espressione genica Solaris QPCR. Quando si esegue questo esperimento, è importante ricordare di preparare miscele master con la concentrazione finale corretta dei reagenti e di includere replicati biologici e/o tecnici appropriati.

Inoltre, è fondamentale configurare lo strumento di QPCR con le corrette condizioni di termociclaggio per Solaris. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.