Name: Quantitativa Real-Time PCR utilizzando il Thermo Scientific Solaris qPCR Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-17T17:04:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Impara la PCR quantitativa in tempo reale con gli assay Solaris per l'analisi dell'espressione genica. Questo metodo rileva tutte le varianti di splicing note con elevata specificità e sensibilità.

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1. La Thermo Scientific Solaris qPCR analisi la progettazione di algoritmi <ol><li> L'algoritmo utilizzato nella progettazione di Solaris qPCR sonda / primer coppie regola la Tm di ogni componente consentendo in tal modo condizioni di ciclismo universale. Scanalatura incorporazione della MGB, o minore vincolante, molecola nella sonda aumenta il Tm e permette di brevi sonde devono essere progettati per una maggiore flessibilità di analisi e prestazioni. Come il loro nome, MGBs sono una classe di antibiotici che possono adattarsi al solco minore della doppia elica del DNA. MGBs sono attaccati fino alla fine 3 o 5 di una sonda di DNA. In soluzione, la fluorescenza giornalista FAM della sonda si spegne da Quencher Eclipse Oscuro. Quando la sonda si lega ad una sequenza bersaglio, con conseguente cambiamento di sonda s 3-D conformazione permette un forte segnale fluorescente. Legame della sonda alla sequenza del DNA bersaglio è stabilizzata dal MGB, che consente l'utilizzo di altamente specifico, sonde brevi mantenendo la temperatura adeguata di fusione per la PCR. Così, il rilevamento del segnale si verifica durante la fase di ricottura di amplificazione di destinazione. Durante la fase di estensione, la sonda MGB dissocia e la fluorescenza è di nuovo spenta. Poiché la sonda dissocia, non influenza l'efficienza della PCR. </li><li> Un'altra caratteristica dell'algoritmo Solaris è l'uso di Superbases. Superbases vengono modificati basi che hanno migliorato le capacità vincolante per migliorare la stabilità di AT titoli ed eliminare GG auto-associazione di sequenze ricche in guanina. Inoltre, non spegnere fluorofori adiacente attaccato al capolinea 5. Queste basi sono selettivamente posto, secondo l'algoritmo, per ampliare la disponibilità di sequenze bersaglio. Questo rende possibile l'utilizzo di sequenze, come le regioni ricche in GC, che altrimenti sarebbero evitati nella progettazione di primer e sonde. </li><li> Quando possibile, l'algoritmo di Solaris incorpora regioni di giunzione esone estende nel sito di destinazione. Questo aumenta la specificità, evitando l'amplificazione del DNA genomico contaminante. </li><li> È importante sottolineare che l'algoritmo individua inoltre una sequenza consenso per tutte le varianti di splicing conosciuti, in modo tale che tutti sono coperti da una singola sonda / set primer. Quindi, solo un test è necessario per un particolare gene di interesse. </li><li> Infine, il saggio di Solaris qPCR algoritmo design utilizza dei parametri molto rigorosi per considerazioni di progettazione critici compresi i contenuti GC, lunghezza, Tm, e tratti di nucleotidi omogenea. Le sequenze risultanti sono BLAST analizzati per specificità utilizzando 3 diversi database: genomica, trascrizione, e pseudogene. </li></ol> 2. Ottenere Reagenti Solaris <ol><li> Per ottenere il appropriati reagenti Solaris, visitare <a href="http://dharmacon.com">www.thermo.com / solaris</a> </li><li> Una volta sul sito clicca su "Ricerca prodotti GENEius". Per andare direttamente alla ricerca dei prodotti GENEius, andare a <a href="http://www.dharmacon.com/catalogsearch/consolidatedsearch.aspx">www.thermo.com / SolarisSearch</a> </li><li> Fare clic nella casella richiesta di ricerca e scegliere l'organismo di destinazione appropriata. </li><li> La ricerca dei prodotti GENEius in grado di elaborare molti geni diversi identificativi. Qui, inserire uno dei termini di ricerca ha suggerito di trovare il gene di interesse, tra cui Rif. Seq adesione, l'ID del gene, la sigla del gene, una descrizione Gene, l'ID o il numero di Sanger di adesione, o un numero di catalogo. Quindi, fare clic su "Cerca". </li><li> Identificare il gene di interesse e cliccare su "Seleziona" sul lato sinistro. Si aprirà una finestra che mostra i diversi prodotti Thermo Scientific disponibile per il gene di interesse. Nella sezione "Prodotti" selezionare l'opzione "Rilevazione qPCR" Tab. </li><li> Sotto il "Saggio di espressione genica Solaris" voce, vedrete uno ottimamente progettato Solaris sonda / test primer. Questo saggio sarà coprire tutte le varianti di splicing note del gene bersaglio. Scegli la quantità desiderata. Sono disponibili in 100, 200, 400 e 1000 X 25 microlitri reazioni (se il test è identificato come made-to-order, i 100 confezioni non saranno disponibili). Clicca su "Aggiungi al carrello". </li><li> Quindi, selezionare la combinazione appropriata master per il termociclatore che verrà utilizzato. Per determinare quale master mix funzionano meglio con la macchina a disposizione, clicca su "Scopri quali Master Mix funziona meglio con il vostro Cycler PCR!" </li><li> Trova la cycler qPCR che verrà utilizzato nel menu per determinare quale mix da usare. </li><li> Tornare alla finestra di ricerca dei prodotti GENEius, e selezionare il mix appropriato master. Il master mix è disponibile in 100, 200, 400 e 1000 misure di reazione. Fare clic su "Aggiungi al carrello". </li><li> Geni di riferimento proposti e kit di sintesi verso cDNA possono essere ordinati anche per un completo qRT-PCR. </li><li> Quando i reagenti qPCR Solaris arrivare, conservarli a -20 ° C fino al momento dell'utilizzo. I seguenti reagenti devono essere ricevuti: A 20X soluzione contenente due primer fornito a 800 nm ciascuno e una sonda gene specifico fornito a 200 nm, sequinformazioni di riferimento sia per la sonda e il primer, e Solaris Mix Gene qPCR Espressione Maestro ad una concentrazione 2X. Solaris qPCR saggi di espressione genica sono stabili per un minimo di 12 mesi. Evitare di congelare e scongelare ripetuti. </li></ol> 3. qPCR configurazione <ol><li> Iniziare il protocollo qPCR con cDNA. L'RNA totale dovrebbe essere estratti utilizzando un metodo di colonna. La Thermo Scientific kit di sintesi Verso cDNA è raccomandato per la trascrizione inversa per generare cDNA. </li><li> Preparati per qPCR da scongelamento del primer, sonde e master mix su ghiaccio. Anche avere a disposizione acqua di qualità PCR e opaco qPCR piatti bianchi, che può migliorare la sensibilità di PCR in tempo reale. </li><li> Il master mix contiene tutti i componenti per PCR in tempo reale tra cui: 1) Termo-Start DNA polimerasi, un hot-start versione di DNA polimerasi Thermoprime. Questo tipo di polimerasi è usato per prevenire le non-specifica amplificazione durante la reazione di set-up e richiede fase di attivazione a 95 ° C 15 min. 2) dNTP nel mix Solaris Maestro, dTTP sostituisce dUTP per massimizzare l'efficienza dell'amplificazione 3) tampone di reazione di proprietà, ottimizzato per lavorare con Solaris primer / sonda test. Questo tampone di reazione contiene colorante blu per aumentare il contrasto tra il reagente e plastica. 4) ROX, se il vostro strumento qPCR richiede ROX. </li><li> Una volta che le soluzioni sono scongelati, mescolare sfogliando il tubo (non vortex). Spin giù per evitare perdite di reagente. </li><li> Successivamente, preparare una provetta sterile 15 ml Falcon per impostare la miscela di reazione per il gene di interesse, più uno per il gene di riferimento, scaling up a seconda del numero di campioni. Preparare sufficiente tale che tre repliche possono essere preparati per ogni campione, tra cui un modello di alcun controllo (NTC) e campioni curva standard, se il metodo di curva standard verrà utilizzato per l'analisi. </li><li> Per ogni campione eseguito su una piastra da 96 pozzetti, mescolare i seguenti: 5 ml di Mix Solaris 2X qPCR Maestro, 0,5 l di Primer / sonda di Solaris (20X), e l'acqua PCR grado tale che il volume di reazione finale, una volta il cDNA viene aggiunta saranno 25 microlitri. Per ogni campione eseguito su un piatto ben 384 mescolare le seguenti: 12,5 ml di Mix Solaris 2X qPCR Maestro, 1,25 l di Primer / sonda di Solaris (20X), e l'acqua PCR grado tale che il volume di reazione finale, una volta che il cDNA si aggiunge saranno 10 L. </li><li> Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire il master mix nei rispettivi pozzetti della piastra. Il colorante blu inclusi nel master mix sarà di aiuto in corso pipettaggio monitoraggio sui piatti bianchi. Quindi, aggiungere il modello 1-5 microlitri cDNA (per una piastra 96 ​​pozzetti) o 1-2 ml di modello di cDNA (per un piatto ben 384). Pipetta su e giù per mescolare. Porre la piastra in una centrifuga e spin giù per rimuovere eventuali bolle, in quanto questi interferiscono con le letture fluorescenza. </li><li> Programmare il termociclatore: L'enzima deve essere attivato con un 95 ° C 15 minuti (1 ciclo). Poi 40 cicli di 95 ° C, denaturazione per 15 secondi, e la ricottura e l'estensione a 60 ° C per 60 secondi. </li><li> Posizionare la piastra nello strumento qPCR. Avviare il programma. </li></ol> Rappresentante risultati qPCR con Solaris <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Test Solaris dare un rilevamento affidabile anche a concentrazioni molto basse di ingresso, a giudizio l'efficienza della PCR e dei valori r2. Dieci 10-diluizioni di cDNA sintetizzato da sintetici sequenza amplicone RNA o amplicon sequenza di DNA è stato amplificato su uno strumento ABI 7900HT utilizza Solaris saggio qPCR espressione genica per F2RL1 o CDC20, rispettivamente. Il registro su scala curve di amplificazione e curve standard sono indicati con le prestazioni di ciascun saggio tra cui l'efficienza, il valore r2, gamma dinamica su 10 log10 diluizioni, e il limite inferiore di rilevamento. <img src="/files/ftp_upload/1700/1700fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Saggi Solaris dare risultati consistenti anche tra diversi ricercatori e laboratori. siRNA targeting ALDOA e PPIB, così come un controllo non-targeting (NTC), sono state trasfettate in cellule HeLa a nM 100, 10, 1 e 0,1 concentrazioni finali. Le cellule sono state raccolte e RNA totale isolato 48 ore post-trattamento. cDNA è stato sintetizzato con Thermo Scientific cDNA Synthesis Kit Verso. Un'aliquota del cDNA è stato amplificato in due laboratori geograficamente separati usando Solaris qPCR saggi di espressione genica per il rilevamento di ALDOA, PPIB, e GAPDH su un LightCycler Roche 480 (384 pozzetti) piattaforma. Knockdown è stato calcolato con il metodo ΔΔCq (normalizzata a GAPDH di riferimento dei geni e cellule trattate con NTC). Gli stessi livelli di knockdown sono state dimostrate per entrambi i target genico tra le due ricercatori in entrambi i siti.

Gli autori di questo articolo sono dipendenti di Thermo Scientific.

Thermo Scientific Solaris saggi qPCR forniscono un metodo semplice e migliore per l&#39;esecuzione di analisi qPCR. Utilizzando un algoritmo di alto rigore, incorporando la tecnologia e MGB Superbases, questi set di primer e sonda massimizzare la fedeltà e la robustezza degli esperimenti qPCR. Un set di primer e sonda riconosce tutte le varianti di splicing nota di un dato gene. Il sito di destinazione, quando possibile, comprende le regioni esone spanning, per garantire che il DNA genomico non è amplificato. Queste caratteristiche permettono di eseguire numerosi campioni contemporaneamente, riducendo notevolmente la quantità di tempo necessario per eseguire esperimenti complessi. Poiché il master mix è blu, è possibile utilizzare piatti bianchi opachi, che migliorano la sensibilità del qPCR, senza perdere di pipettaggio. Presi tutti insieme, le caratteristiche di progettazione del saggio Solaris qPCR rendono questo saggio qPCR romanzo un test semplice, ma ad alte prestazioni che è specifica e robusto.

quantitativa real-time pcr utilizzando il thermo scientific solaris qpcr assay

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Il gene Solaris qPCR analisi di espressione è un nuovo tipo di primer / sonda set, progettato per semplificare il processo di qPCR pur mantenendo la sensibilità e la precisione del dosaggio. Questi primer / probe set sono già progettati per&gt; 98% del genoma umano e del mouse e miglioramenti caratteristica significativa dalle tecnologie disponibili in precedenza. Questi miglioramenti sono stati resi possibili in virtù di un algoritmo di design innovativo, sviluppato da Thermo Scientific esperti di bioinformatica. Diverse funzioni utili sono state incorporate nel saggio Solaris qPCR per snellire il processo di esecuzione quantitativa real-time PCR. In primo luogo, il protocollo è simile a quello comunemente impiegato alternative, per cui i metodi utilizzati durante qPCR sono suscettibili di essere a conoscenza. In secondo luogo, la master mix è blu, il che rende l&#39;impostazione delle reazioni qPCR più facile da monitorare. In terzo luogo, le condizioni cicli termici sono gli stessi per tutte le analisi (geni), che consente di eseguire molti campioni alla volta e riducendo il rischio di errore. Infine, la sonda e la sequenza di innesco informazioni vengono fornite, semplificando il processo di pubblicazione. Qui, dimostriamo come ottenere i reagenti appropriati di Solaris utilizzando la funzione di ricerca GENEius prodotto trovato sul sito web di ordinazione (www.thermo.com / Solaris) e come utilizzare i reagenti per l&#39;esecuzione di Solaris qPCR usando il metodo standard di curva.

Il Solaris qPCR saggi di espressione genica sono nuovi pre-progettati qPCR primer / sonda combinazioni progettato per semplificare il processo di qPCR senza sacrificare la specificità e la robustezza del test.

Quantitativa Real-Time PCR utilizzando il Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Il saggio di espressione genica qPCR Solaris è un nuovo tipo di set primer/sonda, progettato per semplificare il processo di qPCR mantenendo al contempo la sensibilità e la...

In questo articolo video, viene dimostrato il PCR in tempo reale utilizzando saggi Solaris QPCR. I saggi Solaris QPCR sono kit di sonde e primer specifici per gene progettati per rilevare tutte le varianti di splicing note di un determinato gene. In condizioni universali di termociclaggio, la sonda Solaris presenta un legante del solco minore, un gruppo funzionale e un marcatore FA all'estremità cinque primaria e un quencher scuro eclissato all'estremità tre primaria.Nella fase di denaturazione della PCR in tempo reale, la sonda rimane in soluzione e la fluorescenza del marcatore FAM è soppressa. Durante le fasi di annealing ed estensione, i primer nella sonda si legano alla sequenza bersaglio e il soppressore viene separato dal FAM. Il FAM emette quindi un segnale fluorescente intenso; quando la sonda si dissocia, la fluorescenza viene nuovamente soppressa.I risultati della PCR in tempo reale dimostrano la sensibilità, specificità e riproducibilità di questo saggio efficiente. Ciao, sono James Covino del team di Ricerca e Sviluppo di Thermo Fisher Scientific di Lafayette, in Colorado. Oggi vi mostreremo una procedura per l'allestimento di una reazione QPCR standard utilizzando i reagenti per l'espressione genica Lars QPCR.Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare l'abbattimento di geni bersaglio mediante tecnologie di interferenza dell'RNA. Cominciamo dunque. Il test qPCR Solaris STEM si distingue per un algoritmo unico che sfrutta le tecnologie MGB e basi superiore per fornire un singolo test pratico per il 98% dei geni annotati di uomo e topo.Normalmente, la progettazione di sonde e primer per il DNA è limitata dalla temperatura di fusione della sonda, che è determinata dal numero e dal tipo di basi. Le sequenze più lunghe e quelle ricche in GC presentano temperature di fusione più elevate. La porzione legante del solco minore utilizzata nelle sonde Solaris si inserisce nel solco minore dell'elica del DNA e stabilizza l'interazione tra la sonda e la sequenza bersaglio.Questo aumenta la temperatura di fusione, consentendo l'uso di sonde più corte. L'algoritmo Solaris incorpora inoltre selettivamente nucleotidi modificati chiamati super basi per migliorare la stabilità dei legami AT ed eliminare l'associazione autocomplementare GG in sequenze ricche di guanina. Ciò permette l'uso di sequenze bersaglio che altrimenti verrebbero evitate.La maggiore flessibilità di sequenza conferita dall'utilizzo di queste tecnologie consente la progettazione di set di primer e sonde in grado di riconoscere tutte le varianti di splicing note di un singolo gene. Si noti che, ogni volta che possibile, sono state incluse nelle regioni bersaglio aree che attraversano i giunti degli esoni, al fine di aumentare la specificità evitando l'amplificazione del DNA genomico contaminante; i set di primer e sonde risultanti vengono analizzati mediante blast su tre database diversi: genoma, trascritto e pseudogeni, per garantire specificità. Inoltre, i set di primer e sonde Solaris sono stati completamente ottimizzati in modo tale che le condizioni di ciclatura per tutti i saggi di QPCR siano identiche, consentendo così la valutazione dell'espressione di diversi trascritti in un'unica corsa di PCR.Per iniziare a pianificare l'esperimento di qPCR R, identificare i reagenti necessari per eseguire la qPCR per il gene di interesse utilizzando la ricerca prodotti Genius, disponibile su thermo.com/solaris. Fare clic nella casella di ricerca e selezionare l'organismo bersaglio appropriato. La ricerca prodotti Genius può elaborare diversi tipi di identificatori genici. Qui.Inserire uno dei termini di ricerca suggeriti per il gene di interesse, quindi fare clic su "search", identificare il gene di interesse e fare clic su "select" sul lato sinistro. Verrà aperta una finestra che mostra i diversi reagenti disponibili per il gene di interesse. Fare clic sulla scheda di rilevamento QPCR sotto il saggio di espressione genica Solaris.Viene mostrato un saggio ottimizzato con primer e sonda Solaris. Questo singolo saggio rileverà tutte le varianti di splicing note del gene di interesse. Una volta identificato il primer appropriato, individuare il termociclatore QPCR che verrà utilizzato nel menu e identificare il master mix compatibile, ovvero il master mix con una provetta separata del colorante passivo di riferimento rocks, il rocks mix o il low rocks mix.Qui utilizzeremo il Roche Light Cycler 480, quindi verrà impiegato il master mix più il vial di rock. È inoltre fondamentale assicurarsi che nello studio venga incluso un gene di riferimento appropriato. Il B2M verrà utilizzato una volta ricevuti tutti i reagenti Solaris QP CR.Devono essere conservati a meno 20 gradi Celsius fino al momento dell'uso. I reagenti sono stabili per almeno 12 mesi. È consigliabile evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento.Preparare il CDNA per la QPCR eseguendo reazioni di trascrizione inversa sull'RNA del campione. Una volta preparato il CDNA, scongelare l'assay Solaris e la master mix sul ghiaccio. La master mix contiene tutti i componenti per la PCR quantitativa tranne l'assay specifico per il gene e i componenti del template, che includono termostato, DNA polimerasi dn, TPS rocks.Se lo strumento di QPCR richiede rocce e un buffer di reazione proprietario contenente un colorante blu interno, tenere a disposizione anche acqua di grado PCR e piastre per QPCR. Una volta che le soluzioni sono state scongelate, mescolarle agitando leggermente, quindi centrifugarle brevemente per evitare perdite di reagente. Successivamente, in un tubo da 15 millilitri, preparare un mix master e un saggio di QPCR Solaris a concentrazione 1x.Combinare, per il numero desiderato di campioni da analizzare in una piastra da 384 pozzetti, cinque microlitri di mix master 2x, 0,5 microlitri di sonda Solaris 20x e acqua di grado PCR in modo che il volume finale in ciascun pozzetto sia di 10 microlitri. Dopo l'aggiunta del cDNA, assicurarsi di preparare un quantitativo sufficiente per tre replicati di ciascun campione, inclusi un controllo senza stampo (NTC) e un controllo senza trascrittasi inversa (no RT), per verificare rispettivamente la presenza di reagenti contaminati o di DNA genomico contaminante. Successivamente, trasferire il mix in un serbatoio sterile.Quindi, utilizzando una pipetta multicanale, trasferire il volume appropriato di un master mix x nelle pozzette corrispondenti della piastra PCR. Se si utilizzano piastre bianche, il colorante blu interno incluso nel master mix aiuterà a monitorare l'avanzamento della pipettaggio. Su una stessa piastra è possibile analizzare più librerie di cDNA e geni di riferimento, poiché tutte le condizioni di ciclaggio sono identiche.Dopo aver aggiunto il master mix 1x nelle pozzette appropriate, aggiungere il template di DNA diluito in ciascuna pozzetta in modo che il volume finale sia di 10 microlitri; aspirare e dispensare più volte con la pipetta per mescolare. Sigillare la piastra con un sigillo adesivo o con un sigillo termico, come mostrato qui.Posizionare la piastra in una centrifuga ed eseguire una breve centrifugazione per far scendere i reagenti in fondo al pozzetto ed eliminare eventuali bolle d'aria che potrebbero interferire con le letture di fluorescenza. Il termociclatore deve attivare la polimerasi hot-start presente nel master mix Solaris QPCR a 95 gradi Celsius per 15 minuti (un ciclo), seguito da 40 cicli di denaturazione a 95 gradi Celsius per 15 secondi e un'annealing e un'estensione a 60 gradi Celsius per 60 secondi. Questo protocollo è identico per tutti i saggi Soliris QPCR, indipendentemente dal gene che viene amplificato.Infine, posizionare la piastra nell'apparecchio di QPCR e avviare il programma. Questa figura dimostra l'elevata prestazione dei saggi Solaris: 10 diluizioni decimali di DNA sintetico o cDNA sono state amplificate utilizzando i saggi di espressione genica Solaris QPCR per CDC 20 e F two RL one. Le curve di amplificazione in scala logaritmica e le curve standard per 10 diluizioni logaritmiche in base 10 dimostrano l'elevata prestazione del saggio anche a basse concentrazioni di input.Le prestazioni di ogni saggio vengono misurate in base all'efficienza, al valore quadrato, all'intervallo dinamico su 10, alle diluizioni logaritmiche in base 10 e al limite inferiore di rilevamento. I dati qui mostrati dimostrano la riproducibilità dei saggi Solaris. In questo caso, aliquote di DNA CD sono state amplificate in due laboratori situati in aree geografiche distinte, utilizzando i saggi Solaris per l'espressione genica mediante qPCR e il master mix.Sono stati calcolati gli stessi livelli di espressione per due bersagli genici in entrambi i laboratori. Vi abbiamo appena mostrato come impostare una reazione QPCR standard utilizzando i reagenti per l'espressione genica Solaris QPCR. Quando si esegue questo esperimento, è importante ricordare di preparare miscele master con la concentrazione finale corretta dei reagenti e di includere replicati biologici e/o tecnici appropriati.Inoltre, è fondamentale configurare lo strumento di QPCR con le corrette condizioni di termociclaggio per Solaris. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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