Visualizzazione RNA localizzazione in Xenopus Gli oociti
14 gennaio 2010
Visualizzazione di In vivo RNA di trasporto si ottiene microiniezione di fluorescente trascrizioni di RNA in Xenopus Ovociti, seguito dalla microscopia confocale.
In questa procedura, RNA marcato in fluorescenza. I trascritti vengono iniettati in XUS Cytes e la loro localizzazione viene monitorata. In primo luogo, l'RNA viene marcato con nucleotidi fluorescenti.
In una reazione di trascrizione in vitro, l'RNA viene quindi caricato in un apparato di microiniezione. Gli ovociti vengono posti su una piastra per iniezione e microiniettati con cura. Infine, gli ovociti vengono coltivati per consentire la localizzazione dell'RNA prima dell'imaging al microscopio confocale.
Ciao, sono James Gagnan del laboratorio della Dott.ssa Kimberly Mallory presso il Dipartimento di Biologia Molecolare, Biologia Cellulare e Biochimica della Brown University. Oggi vi mostreremo una procedura per visualizzare la localizzazione dell'RNA subcellulare negli ovociti Xap. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare l'architettura dell'RNA e i fattori proteici necessari per la localizzazione dell'RNA durante lo sviluppo precoce dei vertebrati.
Quindi iniziamo. Per iniziare questa procedura, trascrivere l'mRNA, che è sia marcato radioattivamente che fluorescentemente come descritto nel protocollo scritto allegato. Aggiungere DS per degradare il DNA stampo, quindi arrestare la reazione aggiungendo EDTA.
Rimuovere i nucleotidi non incorporati e altre piccole molecole ruotando attraverso una colonna G 50. L'RNA viene quindi concentrato mediante precipitazione di etanolo, lavato e risospeso. Dopo aver determinato la concentrazione mediante conteggio a scintillazione, diluire l'RNA a 50 nano molari e conservarlo in aliquote da cinque microlitri a meno 80 gradi Celsius.
Quando sei pronto per eseguire la microiniezione, scongelare un Eloqua dell'RNA marcato denaturato a 70 gradi Celsius per cinque minuti. Centrifugare quindi per 10 minuti alla massima velocità in una microcentrifuga a temperatura ambiente per eliminare le polveri sottili e mantenere in ghiaccio. Successivamente, isolare i pezzi di rifinitura dei citi dell'ovaio xap post lavu in un due conico da 50 millilitri contenente 25 millilitri di tre milligrammi per millilitro.
Collagenasi in un tampone fosfato di potassio 0,1 molare a pH 7,4. Agitare delicatamente a 18 gradi Celsius a seconda della variazione da lotto a lotto. Il tempo di trattamento con collagenasi può variare e deve essere monitorato attentamente attraverso un'ispezione visiva.
Per garantire la defogliazione, continuare ad agitare per 15 minuti o fino a quando gli ovociti non sono visibilmente separati dall'ovaio, lasciare che gli ovociti si depositino sul fondo della tuba conica. Rimuovere la soluzione e sostituirla con il tampone MBSH. Ripeti l'operazione, lava altre due volte per un totale di tre lavaggi.
Successivamente, ordinare manualmente il terzo o quattro stadio, il tampone CYTES e MBSH con un microscopio ottico standard. I citi del terzo stadio sono completamente opachi, ma bianchi. Mentre i citi del quarto stadio sono leggermente più grandi e punteggiati di pigmento.
I citi leggermente trasparenti sono troppo giovani e i citi completamente pigmentati o che mostrano una distribuzione polarizzata del pigmento sono troppo vecchi. Infine, preparare gli aghi per la microiniezione utilizzando capillari da tre pollici e mezzo tirando e smussando per realizzare aghi con un diametro esterno di circa 0,05 millimetri. Ora che gli ovociti e gli aghi dell'mRNA sono pronti, procedere alla microiniezione.
Inizia calibrando l'ago con acqua di desy per erogare due nanometri per iniezione di iniezione. Fronte. Caricare l'ago utilizzando un microiniettore controllato a gas e calibrare la dimensione della goccia utilizzando un micrometro, dopo la calibrazione caricare frontalmente l'RNA da iniettare nell'ago. Quindi posizionare gli ovociti selezionati su una piastra per iniezione Nel tampone MBSH, la piastra contiene uno strato di gommapiuma nera.
Il cyte bianco risalta bene su uno sfondo nero. Quindi iniettare con cura ogni ovocita con due litri di RNA a 50 nanomolari. Assicurati di iniettare ogni ovocita solo una volta e controlla regolarmente che l'ago non sia ostruito quando l'iniezione è completa.
Espellere l'RNA rimanente, sciacquare l'ago con acqua decantata e caricare l'RNA successivo per l'iniezione. Dopo l'iniezione, trasferire i citi iniettati in un pozzetto di una piastra sterile da 24 pozzetti fino a mille. I CYTES possono essere coltivati per pozzetto.
Rimuovere il tampone e sostituirlo con 400 microlitri di terreno di coltura citaria per pozzetto. Quindi posizionare la piastra di coltura all'interno di un contenitore di plastica con un tovagliolo di carta bagnato per mantenere un ambiente umido durante la coltura, incubare gli ovociti a 18 gradi Celsius per punti temporali compresi tra otto e 48 ore dopo il periodo di incubazione desiderato. Gli ovociti possono essere preparati per la microscopia dopo l'incubazione degli ovociti iniettati.
Ordina gli ovociti morti e metti gli ovociti sopravvissuti in fiale di vetro. Viene osservata di routine una sopravvivenza superiore al 90% degli ovociti. Sostituire il tampone con il fissativo M-E-M-F-A e agitare i citi per 20 minuti.
Proteggere gli ovociti dalla luce solare durante la fissazione al termine del periodo di fissazione. Lavare gli ovociti rimuovendo il fissativo e sostituendoli con un volume uguale di tampone MBSH. Ripetere questo lavaggio ancora una volta per un totale di due lavaggi.
Successivamente, lavare gli ovociti in metanolo anidro. Per prima cosa, rimuovere metà del volume e sostituirlo con metanolo. Ripeti l'operazione altre due volte.
Dopo questi lavaggi, rimuovere tutta la soluzione e sostituirla con metanolo. Ripeti questo lavaggio con metanolo ancora una volta. Gli ovociti fissati e disidratati possono essere conservati a meno 20 gradi Celsius fino al momento dell'immagine.
Prima dell'imaging, aggiungere il mezzo di pulizia di Marie a una capsula al fluoro WPI con fondo di vetro per coprire la superficie di imaging. Trasferire con cura gli ovociti dal metanolo alla capsula di fluoro, riducendo al minimo il volume di metanolo trasferito Immagine degli ovociti su un microscopio confocale invertito, sia uno Zeiss LSM five 10 che un aica TCSs P danno buoni risultati. Ora mostreremo alcune immagini rappresentative della localizzazione dell'RNA subcellulare subito dopo la microiniezione: l'RNA fluorescente può essere visto nel nucleo dopo otto ore di coltura del controllo marcato con fluorescenza.
L'RNA può essere visto distribuito uniformemente nel citoplasma dell'ovocita. Tuttavia, un RNA marcato in fluorescenza contenente sequenze che reclutano il meccanismo di trasporto può essere visto nel processo di localizzazione subcellulare al polo vegetale dell'ovocita. Ti abbiamo appena mostrato come microiniettare RNA marcati in fluorescenza nei citi dello zap e osservare la localizzazione dell'RNA mediante microscopia confocale.
Quando si esegue questa procedura, è importante utilizzare soluzioni trattate con deci per evitare la contaminazione degli RNA in coltura, i citi in OCM contenenti antibiotici e proteggere i citi dalla luce solare quando possibile per evitare il fotosbiancamento. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.
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Panoramica
Questo articolo descrive la visualizzazione del trasporto di RNA in vivo mediante trascritti di RNA marcati con fluorescenza, iniettati in ovociti di Xenopus. La localizzazione dell'RNA viene monitorata attraverso microscopia confocale.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Biologia dell'RNA
Sfondo
- Il trasporto dell'RNA è cruciale per diversi processi cellulari.
- Gli oociti di Xenopus costituiscono un sistema modello per lo studio della dinamica dell'RNA.
- La marcatura fluorescente permette la visualizzazione in tempo reale dell'RNA.
- La microscopia confocale offre capacità di imaging ad alta risoluzione.
Scopo dello studio
- Visualizzare il trasporto dell'RNA all'interno di cellule vive.
- Comprendere i meccanismi di localizzazione dell'RNA.
- Utilizzare un metodo affidabile per lo studio della dinamica dell'RNA negli oociti.
Metodi Utilizzati
- Etichettatura fluorescente dei trascritti di RNA mediante nucleotidi.
- Microiniezione di RNA in oociti di Xenopus.
- Coltura degli oociti per consentire la localizzazione dell'RNA.
- Acquisizione di immagini mediante microscopia confocale per monitorare il trasporto dell'RNA.
Risultati principali
- Visualizzazione riuscita del trasporto di RNA negli ovociti.
- Dimostrazione dell'efficacia della marcatura fluorescente.
- Informazioni sui modelli di localizzazione dell'RNA.
- Convalida della microscopia confocale come strumento per lo studio dell'RNA.
Conclusioni
- Il metodo fornisce un approccio potente per lo studio della dinamica dell'RNA.
- I risultati contribuiscono alla comprensione dei meccanismi di trasporto dell'RNA.
- Studi futuri possono basarsi su questa metodologia per ulteriori approfondimenti.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La visualizzazione della localizzazione dell'RNA negli oociti di Xenopus permette un'analisi diretta dei meccanismi di trasporto dell'RNA, sostenendo la scoperta precoce e la validazione di bersagli nella biologia della polarità cellulare e dello sviluppo. Questo approccio basato sull'immagine fornisce un'elevata affidabilità predittiva per studi funzionali di elementi cis- e trans-attivatori, guidando decisioni ponderate sui rischi nello sviluppo di modelli preclinici. I risultati quantitativi e riproducibili del metodo facilitano la selezione di portafogli e la riduzione dei rischi meccanicistici nelle strategie terapeutiche mirate all'RNA.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette la visualizzazione diretta della localizzazione dell'RNA per chiarire i percorsi di trasporto e i determinanti molecolari.
- Consente la validazione funzionale di elementi di sequenza e fattori proteici coinvolti nel traffico dell'RNA.
- Fornisce una riduzione del rischio meccanicistica distinguendo eventi di localizzazione specifici da quelli non specifici.
- Semplifica l'indagine guidata da ipotesi sulle interazioni RNA-proteina rilevanti per la polarità cellulare.
Sviluppo di screening e saggi
- Stabilisce un saggio di imaging validato per la quantificazione dei modelli di localizzazione dell'RNA in cellule vive.
- Supporta la standardizzazione e la riproducibilità attraverso protocolli controllati di microiniezione e acquisizione delle immagini.
- Consente la scalabilità per lo screening degli effetti di molecole candidate o di perturbazioni genetiche sul trasporto dell'RNA.
- Fornisce letture quantitative adatte all'analisi comparativa tra diverse condizioni sperimentali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a sistemi rilevanti per le malattie modellando difetti di localizzazione dell'RNA implicati nei disturbi dello sviluppo.
- Garantisce continuità dalla scoperta alla validazione preclinica, permettendo studi meccanicistici in un modello vertebrale.
- Supporta un avanzamento proporzionato al rischio collegando meccanismi molecolari a esiti fenotipici negli ovociti.
- Offre un valore predittivo per l'identificazione di biomarcatori traslazionali basato sulla dinamica della localizzazione dell'RNA.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questa tecnica di imaging si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica permettendo la verifica di ipotesi, la validazione meccanicistica e l'analisi quantitativa della localizzazione dell'RNA in un sistema modello.
- Biologia della Scoperta: Supporta la chiarificazione dei percorsi biologici e la riduzione dei rischi biologici attraverso la visualizzazione diretta del trasporto dell'RNA.
- Screening: Fornisce prontezza e riproducibilità del saggio per valutare l'impatto di interventi molecolari sulla localizzazione dell'RNA.
- Analisi: Fornisce output di imaging quantitativi per un confronto statistico robusto tra gruppi sperimentali.
- Ricerca Translazionale: Collega le informazioni meccanicistiche a fenotipi rilevanti per le malattie nello sviluppo vertebrale precoce.
- Riutilizzo Aziendale: Offre una piattaforma riutilizzabile per lo studio di diversi eventi di localizzazione dell'RNA e dei fattori regolatori.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi sulla localizzazione dell'RNA.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione, la riproducibilità e la scalabilità dei saggi basati sull'immagine.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale fornendo letture funzionali solide.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione corretta per il rischio dei programmi mirati all'RNA sulla base di dati meccanicistici validati.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microiniezione, imaging confocale e manipolazione dell'RNA.
- Necessita dell'accesso a reagenti per l'etichettatura fluorescente e a infrastrutture per microscopia ad alta risoluzione.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro dei protocolli di iniezione e di imaging per garantire la riproducibilità.
- Potrebbe richiedere adattamenti per diverse specie di RNA o sistemi modello, in base alla sequenza e ai meccanismi di trasporto.
- I limiti pratici includono la stabilità dell'RNA, il fotoblanco e le limitazioni di throughput intrinseche alla microiniezione manuale.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
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Title
0:30
Introduction
1:03
Preparing for Microinjection
3:14
Microinjection and Oocyte Culture
4:35
Fixation, Dehydration, and Storage of Oocytes
5:35
Imaging RNA Localization by Confocal Microscopy
5:59
RNA Localization in Xenopus Oocytes: Representative Results
6:28
Conclusion
