Ottenere ematociti concentrati dal hawaiano Bobtail Squid Euprymna scolopes L'osservazione e la loro aderenza ai batteri simbionti e non Symbiotic

Dopo aver rimosso gli adulti di seppia bobtail dai loro acquari e averli anestetizzati con una soluzione di acqua di mare filtrata al 2% di etanolo, vengono sottoposti a prelievo ematico attraverso il vaso sanguigno cefalico. Con una siringa da 26 e mezzo di calibro, l'emolinfa estratta appare di colore blu.

A causa della presenza di emo cianina, gli eritrociti vengono diluiti a una concentrazione desiderata e suddivisi in aliquote su un cover slip a otto camere. Una volta che gli eritrociti si sono aderiti al cover slip, vengono colorati con un tracciante cellulare arancione, un colorante fluorescente, e sottoposti a sfida con batteri marcati con GFP, che possono essere visualizzati al microscopio fluorescente. Ciao, sono Spencer Olm del Dipartimento di Biologia Molecolare e Cellulare dell'Università del Connecticut.

E io sono Andrew Collins del NY Home Lab. Oggi vi mostreremo un procedimento per estrarre l'emolinfa o il sangue dal calamaro bobtail hawaiano. Si prepara questo opis.

Ora, i calamari bobtail sono animali notturni che si trovano al largo della costa delle Hawaii vicino alle barriere coralline e utilizzano la luce prodotta dalla loro simbiosi per camuffarsi durante la notte, quando escono a caccia del loro alimento preferito, ovvero i gamberi. Utilizziamo questa associazione in laboratorio per studiare come i batteri benefici colonizzino i tessuti animali. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare le interazioni tra i componenti del sistema immunitario innato dell'ospite e il suo partner batterico bioluminescente VIO ide.

Iniziamo. Prima di estrarre l'emolinfa, anestetizzare un calamaro adulto in un becher da un litro contenente una soluzione appena preparata di etanolo al 2% in 500 millilitri di acqua di mare artificiale filtrata e sterilizzata. Dopo 10 minuti, il calamaro smetterà di nuotare e non risponderà attivamente al contatto.

Tuttavia, si dovrebbe comunque osservare una respirazione persistente, indicata dal movimento del mantello e dall'attività dei cromatofori, che segnala l'attività delle cellule pigmentate. Versare parte della soluzione sterile di acqua di mare ed etanolo dal becher in un vassoio standard per dissezione in cera e immergervi il calamaro con la superficie ventrale rivolta verso l'alto. Utilizzando una punta standard da 200 microlitri per pipetta, tirare indietro il mantello e il sifone per esporre il principale vaso sanguigno cefalico situato tra i due occhi.

Utilizzare una siringa sterile con un ago da 26 e mezzo di calibro per punzionare il vaso sanguigno cefalico ed estrarre da 50 a 100 microlitri di emolinfa oppure da 10 a 20 microlitri. Se l'animale dovrà essere utilizzato più volte come donatore, collocare l'emolinfa in una provetta sterile da 1,5 millilitri posta sul ghiaccio. Si noti che, se questo passaggio viene eseguito correttamente, il sangue del calamaro dovrà apparire blu scuro.

Sostituire l'animale in un serbatoio con acqua di mare normale per farlo riprendere, quindi centrifugare l'emolinfa in una microcentrifuga a temperatura ambiente per formare il pellet degli emociti ed eliminare il soprannatante. Ri-sospendere gli emociti in 500 microlitri di soluzione di Ringer per calamaro per lavarli. Quindi centrifugare nuovamente per formare il pellet cellulare ed eliminare il soprannatante.

Infine, risospendere gli emi e la soluzione ringer per calamaro. Determinare la concentrazione cellulare mediante emocitometro. Quindi aggiungere circa 2000 cellule a ogni camera di un coprioggetto di vetro.

Lasciare che le cellule aderiscano al vetro per circa 10 minuti. A questa densità, gli hemos dovrebbero formare un monostrato uniforme sulla superficie del vetro. Mantenere gli hemos sul ghiaccio durante la preparazione dei batteri in un agitatore orbitale a 28 gradi Celsius.

Coltivare una o più ceppi di batteri Vireo contenenti un gene reporter fluorescente verde fino alla fase logaritmica intermedia in un mezzo di coltura marino con tritone. Utilizzando uno spettrofotometro, misurare la densità ottica della coltura a 600 nm per determinare la densità cellulare; centrifugare la coltura, scartare il soprannatante e risospendere il pellet. In un millilitro di soluzione ringer per seppia, aggiungere i batteri agli emociti.

Nelle camere delle lamelle di vetro con 100.000 batteri per camera. Incubare le lamelle a temperatura ambiente per un'ora. Per ottenere un legame massimo, aggiungere il colorante orange per il tracciamento cellulare, aggiungendo una concentrazione finale dello 0,005% per colorare il citoplasma ematico.

Incubare per 30 minuti, quindi lavare con 150 microlitri di soluzione fresca di ringer per calamaro. Aggiungere un microscopio confocale, osservare gli eiciti colorati e i batteri associati ed enumerare i batteri su tutta la superficie dell'eicita. Ora vi mostreremo alcune immagini rappresentative di eiciti sottoposti a sfida con il batterio non simbiotico marcato con GFP Filio Harvey Eye e con il batterio simbiotico naturale del calamaro Filio fii.

Questa è un'immagine di un sito ematico che non è stato esposto a nessun batterio. La cellula appare rossa e si è attivata. Si possono osservare le sue estensioni simili a pseudopodi.

Quando la cellula è esposta al batterio simbionte filio fii, si osserva un numero ridotto di batteri legati alla superficie della cellula. Tuttavia, quando il batterio non simbionte filio Harvey Harveyi è messo a contatto con gli hemos, un numero significativamente maggiore di batteri si lega. Vi abbiamo appena mostrato come estrarre l'emolinfa da un calamaro bobtail, isolare gli hemos e utilizzarli in esperimenti per caratterizzare l'adesione batterica a queste cellule del calamaro.

Questo protocollo potrebbe essere modificato per l'immunochimica fissando gli emo citi dopo che si sono aderiti alla superficie del vetrino. L'R-N-A-D-N-A e le proteine possono anche essere estratti una volta che gli emo citi sono stati ottenuti dall'animale. Ecco tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.