Name: Dissezione di organi dal Zebrafish adulti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-04T16:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Scopri la dissezione degli organi interni dello zebrafish adulto per studi di biologia dello sviluppo e anatomia comparata. Questo metodo dettagliato permette di isolare cuore, fegato, intestino e gonadi.

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Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere R01 HD050901 di MCM e americana Cancer Society Postdoctoral Fellowship # PF-05-041-01-DDC al TG.

<ol><li> Un pesce zebra maschio sarà sezionato per primo, seguito da un pesce femmina. Prima di iniziare la dissezione, anestetizzare un pesce nello 0,2% Tricaine e poi l'eutanasia dalla incubazione in acqua ghiacciata per 15 minuti. </li><li> Iniziare con una leggera accarezzando il pesce secco su un tovagliolo di carta e posizionarlo su una stuoia dissezione. Esternamente, pesce zebra hanno un'unica dorsale, pinna caudale e anale e associato pinne pettorali e pelviche (Figura 1). <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Adulto pesci di sesso maschile con le pinne etichettati. </li><li> Pin il pesce al tappeto dissezione attraverso la parte carnosa della coda e la parte ventrale della cavità oculare. </li><li> Tagliare la pelle del ventre del pesce appena anteriormente alla pinna anale. Tagliare la pelle e il muscolo sottostante lungo il ventre dalla pinna anale per l'opercolo (il rivestimento duro sopra la branchia) (Figura 2, punto 1). <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Passi nella rimozione della pelle e la parete muscolare del corpo per esporre gli organi interni. </li><li> Quindi, rimuovere l'opercolo e la pinna pettorale, tra cui la cintura pettorale (la spessa, regione ossea alla base della pinna) (Figura 2, punto 2). Tagliare la pelle e l'inizio del muscolo sottostante dall'alto del ora esposti branchie posteriormente lungo il lato del pesce e poi giù per la pinna anale (Figura 2, punto 3). </li><li> Rimuovere con cura la pelle e muscolo sottostante dal lato del pesce. Molti degli organi interni sono ora visibili (Figura 3). <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Pesci adulti di sesso maschile con la parete del corpo e dei muscoli rimossi permettendo la visualizzazione degli organi interni. </li><li> I testicoli sono lunghe, bianche, organi accoppiati che sono attaccate alla parete dorsale del corpo. Rimuovere un testicolo e mettetelo in un piatto di PBS. Esaminare il testicolo di luce riflessa di visualizzare i tubuli seminiferi (Figura 4), che contengono le cisti con varie fasi di sviluppo di cellule germinali da spermatagonia a spermatidi (Leal et al., 2009). <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Dissezione di un testicolo. Le strutture bianche tondeggianti sono i tubuli seminiferi. </li><li> Quindi, rimuovere il sistema gastrointestinale dalla cavità del corpo del pesce. Il fegato può essere identificato per le grandi dimensioni, morfologia lobi, colore tannish, e la vascolarizzazione estesa. La colecisti, un verde traslucido sacco pieno di liquido, e la milza, che appare rosso vivo, si trovano all'interno del viscere. </li><li> Separare l'intestino dal resto degli organi e tratto fuori. L'anteriore, le regioni a metà, e posteriore dell'intestino sono definiti da l'altezza delle pieghe epiteliali (Wallace et al., 2005). </li><li> Posizionare un pezzo di intestino in PBS e osservare le pieghe epiteliali a luce trasmessa. </li><li> Successivamente, esaminare la vescica natatoria. La vescica natatoria è costituito da una camera posteriore, che è collegato all'esofago attraverso il dotto pneumatico, e una camera anteriore, che è collegata all'orecchio interno attraverso l'apparato weberiano (Finney et al., 2006). </li><li> Rimuovere e gettare la vescica natatoria. Sblocca il pesce e ri-pin che lato ventrale fino a sezionare il rene, che si trova lungo la parete del corpo dorsale. Il rene è una struttura trasparente rosa, associata con l'aorta dorsale e cellule pigmentate. Il rene è suddiviso in regioni della testa, corpo e coda (Figura 5). Sezionare un pezzo del rene e metterlo in PBS. Prendere in giro a parte il tessuto renale per rivelare i tubuli renali. <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Posizione testa, corpo, e rene coda lungo la parete dorsale del corpo. </li><li> Sezionare un pesce femmina. Come descritto in precedenza, l'eutanasia il pesce in acqua ghiacciata e pat asciugare prima di pinning al tappeto dissezione. Togliere la pelle dal lato del pesce come precedentemente dimostrato. L'ovaio è una struttura bilobata che è sospeso nella cavità del corpo da un mesovarium vascolarizzato. </li><li> Rimuovere un lobo delle ovaie, è posto in PBS, ed esaminarlo con luce trasmessa. Gli ovociti possono essere presi in giro a parte utilizzando aghi sottili e poi messo in scena (Figura 6, Selman et al., 1993). Stadio I ovociti sono circa 10 - 150 micron di dimensione e traslucido. Ovociti fase II sono circa 150 - 350 micron nel formato e definito dalla comparsa di granuli corticali. Ovociti stadio III sono 350-750 micron e sono opachi a causa dell'accumulo di tuorlo. Ovociti maturi stadio IV e V sono trasparenti e generalmente non si trovano nelle ovaie delle femmine che hanno recentemente accoppiato. <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Palco dal vivo I, II, III e ovociti osservati sotto undissezione microscopio a luce trasmessa. </li><li> Successivamente, sezionare il cuore dal pesce. Il cuore si trova posteriore e ventrale alla branchia. Iniziate tagliando fuori il cuore e tutto il tessuto circostante e mettendolo in PBS. Con attenzione sezionare via il tessuto che circonda il cuore, facendo attenzione a non danneggiare l'atrio delicato. </li><li> Mettere il cuore sezionato in soluzione di Ringer per osservare il battito cardiaco. Identificare l'atrio, ventricolo e bulbo arterioso (Figura 7, Hu et al., 2001). <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig7.jpg" alt="Figura 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 7"> Figura 7. Dissected cuore adulto. </li><li> Completa la dissezione rimuovendo il cervello dal pesce. Inizia unpinning il pesce e la rimozione della testa con una lama di rasoio. Rimuovere il più possibile i tessuti molli dal lato ventrale del cranio con una pinza. Rimuovere gli occhi con le forbici piccola sorgente. Rompere il cranio e togliere l'osso dalla parte ventrale del cervello. Ora posto la testa in un piatto di PBS e togliere la pelle e le ossa del cranio dal lato dorsale del cervello. </li><li> Identificare i bulbi olfattivi, telencefalo, habenula, tetto ottico, cervelletto e midollo (Figura 8, Wullimann et al, 1996;. Schilling, 2002). <img src="/files/ftp_upload/1717/1717fig8.jpg" alt="Figura 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 8"> Figura 8. Dissected zebrafish cervello adulto. Vista dorsale, anteriore verso l'alto. </li></ol>

<ol><li>Finney, J. L., Robertson, G. N., McGee, C. A., Smith, F. M., Croll, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Autonomic+Innervation+of+the+Swim+Bladder+in+the+Zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Structure and Autonomic Innervation of the Swim Bladder in the Zebrafish (Danio rerio).</a> J Comp Neurol. 495, 587-606 (2006).</li>
<li>Hu, N., Yost, H. J., Clark, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+morphology+and+blood+pressure+in+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Cardiac morphology and blood pressure in the adult zebrafish.</a> Anat Rec. 264, 1-12 (2001).</li>
<li>Leal, M. C., Cardoso, E. R., Nóbrega, R. H., Batlouni, S. R., Bogerd, J., França, L. R., Schulz, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+and+stereological+evaluation+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+spermatogenesis+with+an+emphasis+on+spermatogonial+generations%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Histological and stereological evaluation of zebrafish (Danio rerio) spermatogenesis with an emphasis on spermatogonial generations.</a> Biol Reprod. 81, 177-187 (2009).</li>
<li>Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphology+of+larval+and+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%3A+A+Practical+Approach+%28The+Practical+Approach+Series%29%22%5BJournal%5D)">The morphology of larval and adult zebrafish.</a> Zebrafish: A Practical Approach (The Practical Approach Series). Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Selman, K., Wallace, R., Sarka, A., Qi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+oocyte+development+in+the+Zebrafish%2C+Brachydanio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Stages of oocyte development in the Zebrafish, Brachydanio rerio.</a> J. Morphol. 218, 203-224 (1993).</li>
<li>Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+growth+and+differentiation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Intestinal growth and differentiation in zebrafish.</a> Mech Dev. 122, 157-173 (2005).</li>
<li>Wullimann, M. F., Rupp, B., Reichert, H. Neuroanatomy of the zebrafish brain : a topological atlas. , Birkhäuser Verlag. (1996).</li>
</ol>

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dalla University of Animal Care Pennsylvania e del Comitato Istituzionale Usa.

Reagenti: 0,2% Tricaine (3-etil aminobenzoate) 200 mg polvere tricaine 97,9 ml di acqua DD ~ 1 ml di 1 M Tris (pH 9) Regolare il pH a 7,0 Tampone fosfato (PBS) 4,0 g di NaCl 0,1 g KCl 100 ml PO 4 0,1 M tampone, pH 7,3 150 ml di dH 2 O Soluzione di Ringer 6.7g di NaCl 0,2 g KCl 0,2 g CaCl 2 1.2g Hepes 1 LH 2 O Regolare il pH a 7,2 Attrezzatura: Dissezione piatto con tappetino Electron Microscopy Sciences Catalogo # 70540 Vännäs primavera forbici Strumenti Scienza multa Catalogo # 91500-09

dissezione di organi dal zebrafish adulti

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Negli ultimi 20 anni, il pesce zebra è diventato un organismo modello potente per la comprensione dello sviluppo dei vertebrati e le malattie. Anche se l&#39;analisi sperimentale degli embrioni e larve è ampia e la morfologia è stato ben documentato, descrizioni di anatomia zebrafish adulti e studi di sviluppo delle strutture per adulti e degli organi, insieme alle tecniche per lavorare con gli adulti sono carenti. Gli organi della larva subire importanti cambiamenti nella loro struttura complessiva, la morfologia e la posizione anatomica durante le larve di transizione per adulti. Esternamente, la larva trasparente sviluppa il suo modello caratteristico pigmento strisce adulti e coppie pinne pelviche, mentre internamente, gli organi subiscono un&#39;enorme crescita e rimodellamento. Inoltre, il primordio bipotential gonade si sviluppa in entrambi i testicoli o ovaie. Questo protocollo identifica molti degli organi degli adulti e vengono utilizzati dei metodi per la dissezione del cervello, gonadi, apparato gastrointestinale, cuore, reni e del pesce zebra adulto. Gli organi sezionati può essere utilizzato per l&#39;ibridazione in situ, tecniche di immunoistochimica, istologia, estrazione di RNA, analisi delle proteine, e altri molecolare. Questo protocollo aiuterà a l&#39;ampliamento di studi nel zebrafish per includere la ristrutturazione degli organi larvali, la morfogenesi degli organi specifici per le indagini adulti e altri sistemi di organi adulti.

Questo protocollo descrive una procedura per l&#39;individuazione e organi da sezionare il pesce zebra adulto.

Dissezione di organi dal Zebrafish adulti

Negli ultimi 20 anni, il pesce zebra è diventato un potente organismo modello per la comprensione dello sviluppo e delle patologie dei vertebrati. Sebbene l'approccio sperimentale...

Negli ultimi 20 anni, il pesce zebra si è affermato come un organismo modello fondamentale per comprendere lo sviluppo e le malattie dei vertebrati. Sebbene la morfologia dell'embrione e della larva sia stata ampiamente documentata, mancano descrizioni dell'anatomia del pesce zebra adulto e delle tecniche per lavorare con gli adulti. Il laboratorio di Mary Mullin presso l'Università della Pennsylvania studia lo sviluppo delle gonadi ed esegue regolarmente dissezioni di ovaie e testicoli da pesci adulti.Questo protocollo illustra la dissezione delle gonadi, nonché l'identificazione e la dissezione degli altri principali sistemi organici. Per iniziare, un pesce viene anestetizzato ed eutanasizzato, quindi fissato su un tappetino da dissezione. La pelle e i muscoli sottostanti vengono rimossi dal pesce per esporre il cuore, il fegato, l'intestino, la gonade e la vescica natatoria.Gli organi interni vengono rimossi dalla cavità corporea. Per ulteriori esami o esperimenti, Tripti Gupta del laboratorio di Mary Mullins del dipartimento di biologia cellulare e dello sviluppo dell'Università della Pennsylvania identificherà molti degli organi dell'adulto e dimostrerà come dissezionarli da un pesce zebra adulto. Per chiarezza e facilità di dissezione, il sistema gastrointestinale, i testicoli e il rene verranno dissecati da un pesce zebra maschio e successivamente le ovaie, il cuore e il cervello verranno dissecati da un esemplare femmina.Per ridurre la quantità di cibo nell'intestino. Non somministrare cibo ai pesci il giorno precedente la dissezione. Verrà dissezionato un pesce zebra maschio.Per prima cosa, sarà necessario un tappetino da dissezione, forbici da dissezione Venice Spring, pinzette, una capsula contenente PBS e un pesce che sia stato anestetizzato ed eutanasizzato. Asciugare leggermente il pesce con un tovagliolo di carta e posizionarlo di lato. Sul tappetino da dissezione, i pesci zebra hanno una singola pinna dorsale e una pinna anale, oltre a pinne pelviche e pinne pettorali accoppiate.Usare spilli da dissezione per fissare il pesce al tappetino da dissezione attraverso la parte carnosa della coda e la porzione ventrale dell'orbita oculare. Con le forbici a molla, fare un'incisione sulla pelle del ventre del pesce appena anteriormente alla pinna anale. Tagliare la pelle e il muscolo sottostante lungo il ventre, dalla pinna anale fino alla copertura rigida delle branchie chiamata opercolo.Utilizzare le forbici e le pinzette per asportare l'opercolo e la pinna pettorale, inclusa la regione ossea spessa alla base della pinna chiamata cintura pettorale. Rimuoverli per esporre le branchie. Tagliare la pelle e il muscolo sottostante a partire dalla zona sopra la branchia esposta, in direzione posteriore lungo il fianco del pesce, quindi proseguire fino alla pinna anale.Rimuovere con attenzione la pelle e il muscolo sottostante dal fianco del pesce per esporre gli organi interni. I testicoli sono organi bianchi, allungati e pari, attaccati alla parete corporea dorsale. Rimuovere un testicolo e collocarlo in una capsula contenente PBS a temperatura ambiente. Eliminare il tessuto adiposo associato al testicolo.Esaminare il testicolo con luce riflessa al microscopio stereoscopico per visualizzare i tubuli seminiferi, che contengono cisti con stadi diversi di cellule germinali in via di sviluppo, dai spermatogoni agli spermatidi. Successivamente, rimuovere dal cavità corporea del pesce l'apparato digerente, la colecisti, una sacca verde traslucida piena di liquido, e la milza, che appare di colore rosso brillante ed è presente tra le viscere. Il fegato può essere identificato per la sua grande dimensione, la morfologia lobulata, il colore tendente al marrone chiaro e la marcata vascolarizzazione.Separare l'intestino dal resto degli organi ed estenderlo. Le regioni anteriore, media e posteriore dell'intestino sono definite dall'altezza delle pieghe epiteliali, essendo la regione anteriore quella con le pieghe più alte. Posizionare un frammento dell'intestino in PBS ed osservare le pieghe epiteliali al microscopio utilizzando luce trasmessa.Ora esaminate la vescica natatoria. La vescica natatoria è composta da una camera posteriore, collegata all'esofago tramite il dotto pneumatico, e da una camera anteriore, collegata all'orecchio interno attraverso l'apparato aricco. Rimuovete e scartate la vescica natatoria, staccate il pesce dai perni e rimettetelo con il lato ventrale rivolto verso l'alto per dissezionare il rene.Il rene è una struttura rosa traslucida situata lungo la parete dorsale del corpo ed è associata all'aorta dorsale e alle cellule pigmentate. Il rene è suddiviso in regioni craniali, corporee e caudali. Ok, quindi c'è la parte craniale, il corpo del rene e la parte caudale.Questa è l'aorta e queste sono le cellule pigmentate. Dissezionare un frammento di rene e posizionarlo in PBS sotto il microscopio. Separare delicatamente il tessuto renale con gli aghi per evidenziare i tubuli renali.Per la dissezione di un pesce femmina, sarai dotato degli stessi strumenti utilizzati in precedenza, a cui si aggiungono alcuni aghi fini, una lametta da rasoio e una capsula contenente soluzione di Ringer. Per la dissezione del cuore, asciuga delicatamente il pesce eutanasizzato e fissalo al tappetino da dissezione. Come in precedenza, utilizza le stesse tecniche già descritte per rimuovere la pelle dal fianco del pesce femmina.L'ovaio è una struttura bilobata sospesa nella cavità corporea da un mesovario vascolarizzato. Rimuovere un lobo dell'ovaio e collocarlo in PBS. Esaminare l'ovaio con luce incidente al microscopio.I citi possono essere separati delicatamente utilizzando aghi fini e quindi assegnati a stadi in base alla loro dimensione e aspetto. Successivamente, dissezionare il cuore dal pesce. Il cuore si trova in posizione posteriore e ventrale rispetto alle branchie.Iniziare rimuovendo il cuore e tutti i tessuti circostanti e posizionandolo in PBS sotto il microscopio. Dissezionare delicatamente i tessuti che circondano il cuore, avendo cura di non danneggiare l'atrio delicato. Posizionare il cuore dissezionato nella soluzione di Ringer e metterlo sotto il microscopio.Per osservare il battito cardiaco, identificare l'atrio, il ventricolo e il bulbo arterioso. Per accedere al cervello, rimuovere le puntine dal pesce ed eliminare la testa con la lama del rasoio. Rimuovere con la pinzetta la maggior quantità possibile di tessuto molle dalla faccia ventrale del cranio.Individuare il chiasma ottico, quindi rimuovere gli occhi utilizzando forbici a molla di piccole dimensioni. Con la pinzetta, rompere e aprire il cranio ed eliminare l'osso dalla faccia ventrale del cervello. Recidere i nervi cranici con le forbici a molla.Se necessario, spostare la testa in una piastra contenente PBS. Girare la testa e rimuovere la pelle e le ossa del cranio dal lato dorsale del cervello sotto il microscopio, identificando i bulbi olfattivi. Individuare il cefalo, l'ULA, il tumore ottico, il cervelletto e la magula.Ecco i bulbi olfattivi, il cefalio di colore turchese, l'ula, il tubercolo ottico, il cervelletto e il midollo allungato, il cuore, l'apparato gastrointestinale, le gonadi, la vescica natatoria, il rene e il cervello, isolati da pesci zebra adulti. Questi organi possono ora essere utilizzati per ibridazione in situ, immunohistochimica, istologia, estrazione di RNA o altre tecniche molecolari.

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