Finestra su un micromondo: Sistemi Microfluidic semplice per studiare il trasporto microbica in mezzi porosi

Dimostreremo che, mediante l'utilizzo di dispositivi eco chip, è possibile mantenere costanti o variare le strutture fisiche e le teste di pressione. Mentre l'influenza della chimica superficiale, delle proprietà del fluido o delle caratteristiche delle particelle o dei microrganismi viene studiata sistematicamente attraverso esperimenti di trasporto usando una ceppia batterica non patogena di VIO esprimente una proteina verde fluorescente, illustriamo l'importanza della struttura dell'habitat, delle condizioni di flusso e delle dimensioni dell'inoculo sui fenomeni fondamentali di trasporto. Software microfluidico: una visione avvincente di un mondo nascosto.

Ciao, sono Dimitri Marker dell'Istituto Vanderbilt per la Formazione sulla Restaurazione di Biosistemi Integrati presso la Vanderbilt University. E io sono David Schafer, ingegnere per la ricerca e lo sviluppo presso i Viro Laboratories. Ciao, sono Leslie Sho del Dipartimento di Ingegneria Chimica, dei Materiali e Biotecnologie Molecolari del Centro per le Scienze e l'Ingegneria Ambientale presso l'Università del Connecticut, e io sono aggiunto Dicot, anch'io proveniente da Zebra.

Oggi vi mostreremo un procedimento per creare array modulari di habitat microfluidici per ricerche fondamentali in scienze ambientali e ingegneria. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare gli effetti di strutture su scala micrometrica sulle interazioni di trasporto microbico in mezzi porosi. Cominciamo dunque.

Il primo passo nella creazione di un dispositivo microfluidico consiste nel disegnare un layout bidimensionale del dispositivo mediante un programma di disegno assistito da computer o programma CAD. Abbiamo utilizzato AutoCAD, ma sono disponibili anche altri programmi di disegno, come Clue in o Corel Draw. Il software consente al progettista di riprodurre fedelmente strutture fisiche su un'area macroscopica, mentre le singole caratteristiche sono definite con una risoluzione inferiore a cinque micron.

Partendo dal disegno CAD, viene creata una maschera fotografica. Utilizziamo una maschera al cromo prodotta da Advanced Reproductions Corporation, nel nord del Massachusetts. I prossimi passaggi della produzione del dispositivo microfluidico si svolgono in una camera bianca per creare un master.

Un wafer di silicio pulito viene ricoperto con resist foto-sensibile in uno spin coater. Innanzitutto, il wafer viene fissato sulla piattaforma dello spin coater e alcuni grammi di resist foto-sensibile SU 8 20 25 vengono versati al centro del wafer. Successivamente, il wafer viene fatto ruotare per un ciclo iniziale di spalmatura della durata di 15 secondi a 500 giri al minuto, seguito da un ciclo di rivestimento sottile a 4.000 giri al minuto per 35 secondi.

Dopo la centrifugazione, la piastrina viene posta su una piastra riscaldata per 10 minuti a 95 gradi Celsius per volatilizzare il solvente in eccesso. L'ultimo passaggio nella preparazione della piastrina consiste nell'eliminare il bordo residuo. Questo viene fatto riposizionando la piastrina sullo spin coater e applicando un flusso costante di rimuovi bordo SUA sull'estremità esterna della piastrina rivestita.

Il passo successivo consiste nel definire il fotoresist mediante esposizione selettiva alla luce UV. Innanzitutto, il wafer rivestito viene posizionato su una superficie piana e la maschera al cromo viene posta direttamente sopra. Il film mascherante rosso in Rubylith impedisce il trasferimento dei pattern al di fuori dell'area desiderata.

Successivamente, viene applicata una dose di luce UV di 300 milli JUUL per centimetro quadrato sulla wafer rivestita attraverso una maschera, utilizzando un sistema a fascio localizzato. Infine, la wafer viene riscaldata per 15 minuti a 95 gradi Celsius per favorire il reticolaggio delle regioni del photoresist esposte alla luce, rendendole insolubili. L'ultimo passaggio nella creazione del master consiste nell'eliminare le regioni del photoresist non reticolate, lasciando strutture in rilievo.

Prima di tutto, la piastrina viene riportata nuovamente al rivestitore centrifugo e ricoperta con la soluzione sviluppatrice. Lo sviluppatore viene lasciato sulla piastrina rivestita per circa cinque minuti, quindi viene eliminato mediante centrifugazione, ottenendo un modello chiaramente visibile sulla piastrina. Eventuali residui rimanenti vengono rimossi spruzzando alcol isopropilico sulla piastrina in rotazione.

Utilizziamo una velocità di rotazione di 2200 giri/min per questa fase per circa cinque-dieci secondi. Infine, il master finito viene asciugato utilizzando un flusso di gas azoto e conservato in una capsula fino al momento dell'utilizzo per la realizzazione di un dispositivo. Realizziamo dispositivi microfluidici utilizzando l'elastomero al silicone polimetil alano.

Prima, il materiale di base e l'agente indurente vengono dosati in un rapporto ponderale di 10 a 1 in un bicchiere di plastica. Successivamente, la miscela viene mescolata. Andy ha eliminato le bolle utilizzando un mescolatore condizionatore Thinky AR 100.

Una volta completato il ciclo, il PDMS liquido viene versato uniformemente sul master. La piastra contenente il master e il PDMS non polimerizzato viene quindi posta in una camera a vuoto per la degasificazione. Le bolle nel polimero compaiono quasi immediatamente.

La degasificazione prosegue fino alla scomparsa di tutte le bolle. La piastra viene posta in un forno livellato a 65 gradi Celsius per almeno quattro ore, per consentire completamente il reticolaggio del polimero. Successivamente, il PDMS polimerizzato viene rimosso con attenzione dallo stampo riutilizzabile.

I primi quattro bordi vengono tagliati ben al di fuori della regione strutturata utilizzando un bisturi, quindi il dispositivo viene staccato dalla wafer strutturata mediante pinzette. I bordi del dispositivo possono essere rifiniti con delle cesoie, se necessario. Una sottosezione del dispositivo può essere separata dal resto del dispositivo in PDMS stampato.

Successivamente, si praticano fori di accesso attraverso il PDMS. Utilizziamo punzoni per biopsia disponibili in commercio in diverse misure, montati su un piccolo albero. I nuclei di PDMS vengono rimossi utilizzando pinzette.

Infine, il dispositivo tagliato e forato viene pulito utilizzando alcol isopropilico e un bastoncino di polipropilene con punta in schiuma. Il dispositivo viene asciugato con azoto e quindi collocato in forno per rimuovere ogni traccia di solvente. L'ultimo passaggio nella realizzazione di un dispositivo microfluidico consiste nell'incollare il PDMS a un substrato in vetrino, per poi riempirlo prima con un fluido.

Il dispositivo in PDMS e un vetrino di vetro vengono posizionati con la superficie da incollare rivolta verso l'alto all'interno di un pulitore al plasma. In questo esperimento, utilizziamo un pulitore al plasma Herrick PDC 32 G. Una volta raggiunto il vuoto e quando il plasma di colore blu violetto diventa visibile, si imposta un timer per 30 secondi.

Il generatore di plasma viene spento. La camera viene riportata alla pressione atmosferica e il dispositivo e lo slider vengono estratti dalla camera, quindi le superfici da saldare vengono poste a contatto. Durante l'estrazione dei componenti attivati dalla camera, è importante agire rapidamente in modo che le superfici rimangano attivate.

Una pressione delicata aiuta a garantire un buon legame. La qualità del legame viene verificata tirando un angolo con una pinzetta. L'interno idrofilo può quindi essere facilmente riempito con una soluzione acquosa come un mezzo tampone o acqua deionizzata.

Del fluido acquoso viene somministrato in ciascun pozzetto sorgente e attraverso la corrispondente cella di flusso microporosa. Una volta che tutte le camere sono piene, uno strato sottile di PDMS polimerizzato viene posizionato su tutto il dispositivo per aiutare a ridurre l'evaporazione e mantenere la sterilità. Per calibrare il flusso generato dalla pressione nel dispositivo, preriempi le celle di flusso microstrutturate con acqua deionizzata, quindi posiziona un modulo di flusso, che funge da interfaccia di somministrazione del fluido e da sigillo sterile, sulla parte superiore del dispositivo.

Questo modulo di flusso può essere utilizzato autonomamente o collegato a un serbatoio esterno contenente fluido, ad esempio una siringa di plastica. Collegare un serbatoio contenente liquido, come una siringa di plastica o il modulo di flusso, all'ingresso a monte. Mantenere costantemente l'altezza del fluido nel serbatoio superiore rispetto all'altezza a valle.

La differenza di altezza tra il serbatoio a monte e ciascun pozzetto di uscita a valle definisce la forza motrice per il flusso dovuto alla pressione, necessaria per quantificare le portate attraverso i dispositivi. Per raccogliere campioni dai pozzetti a valle a intervalli regolari si utilizza un ago da 25 gauge a punta smussata. Ad esempio, raccogliamo campioni ogni 15-20 minuti, annotando con attenzione il tempo effettivo trascorso tra un campione e l'altro.

Il peso della siringa viene registrato prima e dopo il campionamento su una bilancia analitica. Il volume cumulativo viene riportato in funzione del tempo cumulativo, con una pendenza pari alla portata massica media. L'ampia sezione trasversale del serbatoio di ingresso rispetto ai pozzetti di uscita contribuisce a impedire variazioni significative delle portate mentre il fluido attraversa i dispositivi; riportare il volume campionato sull'asse Y in funzione del tempo di campionamento sull'asse X.

In un semplice programma di grafica come Excel, per ottenere la pendenza della retta, la pendenza viene utilizzata per determinare la portata volumetrica media. Viene utilizzata una soluzione diluita di microsfere di lattice fluorescenti a tre micromoli con superfici carbossiliche, YG e YG semplici per visualizzare il flusso e studiare le interazioni superficiali. In primo luogo, viene preparata una soluzione di microsfere in acqua deionizzata a una concentrazione dello 0,01% di solidi.

La soluzione viene aggiunta ai pozzetti a monte e il modulo di flusso viene riattaccato a zu. Il flusso delle perle viene visualizzato nell'arco di un'ora e registrato approssimativamente ogni 10 minuti mediante un microscopio fluorescente Zeiss AIOt 25, dotato di una telecamera monocromatica MITx BCEB 0 1 3 U. Singoli fotogrammi vengono acquisiti in rapida successione e assemblati in filmati utilizzando un programma software come Image J, con illuminazione a fluorescenza e illuminazione a luce trasmessa.

I granuli e le strutture sono entrambi visibili. Quando la luce trasmessa è bloccata, sono visibili soltanto i granuli fluorescenti luminosi. I granuli stazionari depositati lungo la superficie inferiore o attaccati ai collettori sono evidenti in tutta l'apparecchiatura.

Per esperimenti che utilizzano batteri vivi, viene preparata una coltura come una specie di Vibrio, un batterio non patogeno che esprime la proteina verde fluorescente. Innanzitutto, una coltura stock viene prelevata dal congelamento profondo. Un flacone contenente mezzo di crescita LB sterile viene inoculato con la coltura stock.

Utilizzando un’ansa monouso, il matraccio viene incubato tutta la notte con agitazione per ottenere una coltura in fase stazionaria con una concentrazione di circa 10 alla nona cellule per millilitro. A seconda dell'applicazione, la concentrazione iniziale di batteri può essere quantificata con maggiore precisione. Viene preparato un dispositivo microfluidico riempito con tampone sterile.

Successivamente, il liquido sterile nei pozzetti a monte viene svuotato e sostituito con 20 microlitri di coltura batterica. Utilizzando una pipetta, i batteri vengono seminati nel dispositivo applicando una leggera aspirazione con una siringa sui pozzetti di uscita. Dopo l'incubazione, la quantità di batteri nei pozzetti può essere determinata quantificando l'intensità di fluorescenza di ciascun pozzetto a seguito della colonizzazione. Il pozzetto di ingresso a monte viene svuotato come in precedenza e sostituito con un tampone lavato con sali al 25 parti per mille.

Viene applicata una pressione leggera di acqua marina artificiale alle camere a monte mediante una siringa, che risciacqua singole celle di flusso con 20-40 microlitri di soluzione tampone. Questo volume corrisponde approssimativamente a 100-200 volte il volume ridotto della porzione di suolo microfluidico della cella di flusso dopo il risciacquo iniziale. La perfusione a lungo termine di batteri attraverso il mezzo poroso viene ottenuta utilizzando il modulo di flusso esattamente come mostrato in precedenza.

Le immagini in luce fluorescente e in luce bianca della crescita e del trasporto batterico possono essere misurate nel tempo. In questo esperimento, le immagini vengono acquisite ogni 15-20 ore per un periodo di sette giorni mediante una fotocamera CCD a colori raffreddata modello Five della Q imaging ink. I nostri dispositivi possono inoltre essere utilizzati per studiare gli effetti della struttura fisica dell'habitat nel fornire ai batteri un rifugio dalla predazione da parte di protozoi.

Qui sono presenti batteri in una cella a flusso microporosa con i protozoi ciliati molto più grandi, Eulo, visibili nel dispositivo mentre si nutrono dei batteri. Nell'analisi del flusso del fluido nel dispositivo microfluidico, si osserva che la portata media è di 0,71 microlitri al minuto con una colonna d'acqua di 40 millimetri. Aumentando la colonna d'acqua a 60 millimetri, la portata aumenta proporzionalmente a 1,04 microlitri al minuto.

Quando si utilizzano perle con diverse chimiche superficiali nel dispositivo, si osserva un maggiore accumulo di perle non carbossilate sulle superfici del dispositivo. Le perle con un diametro compreso tra sei e 10 millimetri avevano invece molte più probabilità di essere trattenute nelle aperture dei pori più piccoli. Velocità di flusso più elevate, causate da una pressione idrostatica maggiore, hanno portato a una riduzione del trattenimento e della cattura delle perle, come ci si aspetterebbe nell'analisi della crescita batterica nel dispositivo microfluidico eco chipp.

Osserviamo le differenze qualitative nell'intensità dell'immagine in diversi settori del dispositivo. L'intensità della fluorescenza può essere quantificata come indicatore della biomassa microbica nel canale. In esperimenti in corso, osserviamo che le forze di taglio continue in condizioni di flusso basso sembrano causare l'aggregazione batterica e la formazione di fiocchi, come evidente in queste immagini. Vi abbiamo appena mostrato come creare e utilizzare semplici dispositivi microfluidici per misurare la scala delle particelle, il trasporto di collisioni attraverso mezzi porosi, oppure per studiare le interazioni microbiche in habitat microstrutturati.

Quando si eseguono studi utilizzando celle a flusso, è importante considerare la spinta di Archimede delle perle e la chimica superficiale dei colloidi e dei collettori. Quando si passa al regime microfluidico, gli effetti superficiali possono dominare i fenomeni osservati. Praticamente qualsiasi struttura fisica può essere incorporata nel design delle celle a flusso microfluidiche.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.