Finestra su un micromondo: Sistemi Microfluidic semplice per studiare il trasporto microbica in mezzi porosi

Dimostriamo che, attraverso l'uso di dispositivi eco chip, le strutture fisiche e le teste di pressione possono essere mantenute costanti o variate. Mentre l'influenza della chimica di superficie, le proprietà dei fluidi o le caratteristiche delle particelle o dei microbi vengono studiate sistematicamente attraverso esperimenti di trasporto utilizzando una proteina fluorescente verde non patogena che esprime un ceppo batterico VIO, illustriamo l'importanza della struttura dell'habitat, delle condizioni di flusso e delle dimensioni dell'inoculo sui fenomeni fondamentali del trasporto. Software microfluidico avvincente visione di un mondo nascosto.

Ciao, il nostro Dimitri Marker del Vanderbilt Institute for Integrative Biosystem Restoration Education presso la Vanderbilt University. E io sono David Schafer, un ingegnere di ricerca e sviluppo qui ai Laboratori Viro. Ciao, sono Leslie Sho del Dipartimento di Materiali Chimici e Ingegneria Biomolecolare del Centro per le Scienze Ambientali e l'Ingegneria dell'Università del Connecticut, e mi sono aggiunto Dicot anche da Zebra.

Oggi vi mostreremo una procedura per la creazione di array modulari di habitat microfluidici per la scienza ambientale di base e la ricerca ingegneristica. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare gli effetti delle strutture su scala micrometrica sulle interazioni di trasporto microbico nei terreni forestali. Quindi iniziamo.

Il primo passo nella creazione di un dispositivo microfluidico consiste nel disegnare un layout bidimensionale del dispositivo in un disegno assistito da computer o in un programma CAD. Abbiamo usato AutoCAD, ma sono disponibili anche altri programmi di disegno, come clue in o coral draw. Il software consente al progettista di replicare fedelmente le strutture fisiche in un campo macroscopico, mentre le singole caratteristiche sono definite con una risoluzione inferiore a cinque micron.

Dal disegno CAD viene creata una maschera fotografica. Utilizziamo una maschera cromata prodotta da Advanced Reproductions Corporation, all'estremità nord del Massachusetts. Le fasi successive della produzione di dispositivi microfluidici si svolgono in una camera bianca per creare un master.

Un wafer di silicio pulito è rivestito con fotoresist in uno spin coder. Innanzitutto, il wafer viene attaccato alla piattaforma dello spin coder e alcuni grammi di fotoresist SU 8 20 25 vengono versati al centro del wafer. Quindi il wafer viene centrifugato per un ciclo iniziale di spalmatura di 15 secondi a 500 giri/min, seguito da un ciclo di rivestimento sottile di 4.000 giri/min per 35 secondi.

Dopo la centrifuga, il wafer viene posto su una piastra calda per 10 minuti a 95 gradi Celsius per volatilizzare il solvente in eccesso. L'ultimo passaggio nella preparazione del wafer consiste nel rimuovere la perlina del bordo. Questa operazione viene eseguita restituendo il wafer allo spin coder e applicando un flusso costante di dispositivo di rimozione della velocità del bordo SUA sul bordo esterno del wafer rivestito.

Il passo successivo consiste nel modellare il fotoresist mediante esposizione selettiva alla luce UV. Innanzitutto, il wafer rivestito viene posizionato su una superficie piana e la maschera cromata viene posizionata direttamente sopra. La pellicola di mascheratura rossa Rubylith blocca il trasferimento dei motivi al di fuori dell'area desiderata.

Successivamente, una dose di 300 milli JUUL per centimetro quadrato di luce UV viene erogata al wafer rivestito attraverso la maschera utilizzando un sistema di trasporto spot. Infine, il wafer viene cotto per 15 minuti a 95 gradi Celsius per reticolare le regioni esposte alla luce del fotoresist rendendole insolubili. L'ultimo passo nella creazione del master consiste nel rimuovere le regioni non reticolate del fotoresist lasciando dietro di sé strutture in rilievo.

Innanzitutto, il wafer viene restituito ancora una volta allo spin coder e viene coperto con la soluzione di sviluppo. Lo sviluppatore viene lasciato sul wafer rivestito per circa cinque minuti e poi viene centrifugato, ottenendo un disegno chiaramente evidente sul wafer. Eventuali residui rimanenti vengono lavati via spruzzando alcol isopropilico sul wafer rotante.

Utilizziamo una velocità di centrifuga di 2200 giri/min per questo passaggio per circa cinque-10 secondi. Infine, il master finito viene essiccato utilizzando un flusso di azoto gassoso e conservato in un piatto fino a quando non è necessario per la fusione di un dispositivo. Fabbrichiamo dispositivi microfluidici utilizzando l'elastomero siliconico polimetilalano.

Innanzitutto, il materiale di base e l'agente indurente vengono consegnati in un rapporto di peso di 10 a uno in un bicchiere di plastica. Successivamente, la miscela viene mescolata. Andy ha fatto le bolle usando un mixer per condizionamento AR 100.

Una volta completato il ciclo, il PDMS liquido viene versato uniformemente sul master. La piastra contenente il master e il PDMS non polimerizzato viene quindi posta in una camera a vuoto per il degasaggio. Le bolle di polimero compaiono quasi immediatamente.

Il degasaggio continua fino alla scomparsa di tutte le bolle. La pirofila viene posta in un forno a livello a 65 gradi Celsius per almeno quattro ore per consentire completamente la reticolazione del polimero. Quindi il PDMS polimerizzato viene accuratamente rimosso dal master riutilizzabile.

I primi quattro bordi vengono tagliati ben al di fuori della regione modellata utilizzando un bisturi, il dispositivo viene staccato dalla cialda modellata utilizzando una pinzetta. I bordi del dispositivo possono essere tagliati utilizzando delle cesoie, se lo si desidera. Una sottosezione del dispositivo può essere separata dal resto del dispositivo PDMS stampato.

Successivamente, i fori di accesso vengono perforati attraverso il PDMS. Utilizziamo punzoni per biopsia disponibili in commercio in diverse dimensioni montate su un piccolo pergolato. I nuclei PDMS della pressa vengono rimossi utilizzando una pinza.

Infine, il dispositivo rifilato e perforato viene pulito utilizzando alcol isopropilico e un tampone in polipropilene con punta in schiuma. Il dispositivo viene essiccato con azoto e poi messo in forno per rimuovere ogni traccia di solvente. L'ultimo passaggio nella realizzazione di un dispositivo microfluidico consiste nell'incollare il PDMS a un substrato di vetrino, quindi riempirlo prima con il fluido.

Il dispositivo PDMS e una slitta di vetro vengono posizionati con la distanza tra le superfici di incollaggio in un pulitore al plasma. In questo esperimento, utilizziamo un pulitore al plasma di Herrick PDC 32 G. Una volta stabilito il vuoto e visibile il plasma blu viola, viene impostato un timer per 30 secondi.

Il generatore di plasma è spento. La camera viene ripressurizzata e il dispositivo e il cursore prelevati dalla camera e le superfici di incollaggio vengono messi in contatto. Nella rimozione dei componenti attivati dalla camera, è importante muoversi rapidamente in modo che le superfici rimangano attivate.

Una leggera pressione aiuta a garantire un buon legame. La qualità del legame viene controllata tirando un angolo con una pinza. L'interno idrofilo può quindi essere facilmente riempito con una soluzione acquosa come un mezzo tampone o deionizzato.

Il fluido acquoso viene somministrato in ciascun pozzetto sorgente e attraverso la corrispondente cella di flusso microporosa. Una volta che tutte le camere sono piene, un sottile strato di PDMS polimerizzato viene posizionato sull'intero dispositivo per ritardare l'evaporazione e mantenere la sterilità. Per calibrare il flusso azionato dalla pressione nel dispositivo, precaricare le celle di flusso microstrutturate con acqua deionizzata, posizionare un modulo di flusso, che funge da interfaccia di erogazione del fluido e una guarnizione sterile sulla parte superiore del dispositivo.

Questo modulo di flusso può essere utilizzato da solo o collegato a un serbatoio esterno contenente fluido, come una siringa di plastica. Collegare un serbatoio contenente liquido, come una siringa di plastica o il modulo di flusso, all'ingresso a monte. Mantenere bene l'altezza del fluido nel serbatoio al di sopra dell'altezza del downstream.

Ebbene, la differenza di altezza tra il serbatoio a monte e ogni uscita a valle definisce bene la forza motrice per il flusso azionato dalla pressione per quantificare le portate attraverso i dispositivi. Un ago smussato da 25 gauge viene utilizzato per raccogliere campioni dai pozzi a valle a intervalli regolari. Ad esempio, raccogliamo campioni ogni 15-20 minuti, annotando attentamente il tempo effettivo trascorso tra i campioni.

Il peso della siringa viene registrato prima e dopo il campionamento su una bilancia analitica. Il volume aggregato rispetto al tempo aggregato è rappresentato graficamente con la pendenza uguale alla portata massica media. L'ampia sezione trasversale del serbatoio di ingresso rispetto ai pozzetti di uscita aiuta a prevenire che le portate cambino in modo significativo quando il fluido si muove attraverso i dispositivi: tracciare il volume campionato sull'asse Y rispetto al tempo di campionamento sull'asse x.

In un semplice programma grafico come Excel per ottenere la pendenza della linea, la pendenza viene utilizzata per la portata volumetrica media. Una soluzione diluita di tre perle di lattice fluorescenti micromolari con superfici carbossiliche, YG e YG semplici viene utilizzata per visualizzare il flusso e studiare le interazioni della superficie. Innanzitutto, viene preparata una soluzione di perle in acqua deionizzata a una concentrazione di solidi dello 0,01%.

La soluzione viene aggiunta ai pozzi a monte e il modulo di flusso viene ricollegato a zu. Il flusso delle microsfere viene visualizzato nel corso di un'ora e registrato circa ogni 10 minuti su un microscopio a fluorescenza Zeiss AIOt 25, dotato di una fotocamera monocromatica MITx BCEB 0 1 3 U. I singoli fotogrammi vengono acquisiti in rapida successione e assemblati in filmati utilizzando un programma software come Image J con illuminazione a fluorescenza e illuminazione a luce trasmessa.

Le perline e le strutture sono entrambe visibili. Quando la luce trasmessa è bloccata, sono visibili solo le perle fluorescenti luminose. Le perle fisse depositate lungo la superficie inferiore o attaccate ai collettori sono evidenti in tutto il dispositivo.

Per gli esperimenti con batteri vivi, viene preparata una coltura come la specie Vibrio, un batterio fluorescente verde non patogeno che esprime proteine. Innanzitutto, una coltura stock viene rimossa dall'archiviazione gratuita profonda. Un matraccio con terreno di crescita LB sterile viene inoculato con la coltura madre.

Utilizzando un circuito di inoculazione monouso, il pallone viene incubato durante la notte con agitazione per ottenere una coltura in fase stazionaria con una concentrazione di circa 10 al nono di cellule per millilitro. A seconda dell'applicazione, la concentrazione iniziale di batteri può essere quantificata in modo più preciso. Viene preparato un dispositivo microfluidico riempito con tampone sterile.

Quindi il liquido sterile nei pozzetti a monte viene svuotato e sostituito con 20 microlitri di coltura batterica. Utilizzando una pipetta, i batteri vengono seminati nel dispositivo mediante aspirazione delicata con una siringa sui pozzetti di uscita Dopo l'incubazione, la quantità di batteri nei pozzetti può essere determinata quantificando l'intensità della fluorescenza di ciascun pozzetto dopo la colonizzazione. Il pozzo di ingresso a monte viene svuotato come prima e sostituito con tampone lavato con 25 parti per mille sali.

L'acqua di mare artificiale viene applicata una leggera pressione ai pozzi a monte con una siringa che lava le singole celle di flusso con 20-40 microlitri di soluzione tampone. Questo è circa 100-200 volte il volume scarso della porzione microfluidica del terreno della cella di flusso dopo il lavaggio iniziale. La perfusione a lungo termine dei batteri attraverso il mezzo poroso si ottiene utilizzando il modulo di flusso esattamente come mostrato in precedenza.

Le immagini fluorescenti e a luce bianca della crescita e del trasporto batterico possono essere misurate nel tempo. In questo esperimento, le immagini vengono scattate ogni 15-20 ore per un periodo di sette giorni con una telecamera CCD a cinque colori raffreddata dall'inchiostro Q imaging. I nostri dispositivi possono anche essere utilizzati per studiare gli effetti della struttura fisica dell'habitat nel fornire rifugio ai batteri dalla predazione da parte dei protozoi. Ovvio.

Qui ci sono batteri in una cella a flusso microporosa con il protozoo ciliato molto più grande eulo visibile nel dispositivo che si nutre di batteri. Nell'analisi del flusso del fluido nel dispositivo microfluidico, troviamo che la portata media è di 0,71 microlitri al minuto per una prevalenza di 40 millimetri. Aumentando il carico di pressione a 60 millimetri, la portata è aumentata proporzionalmente a 1,04 microlitri al minuto.

Quando si utilizzano perle con varie sostanze chimiche superficiali nel dispositivo, si osserva un maggiore accumulo di perle non carbossilate sulle superfici del dispositivo. Mentre le perle da 6 a 10 millimetri di diametro avevano molte più probabilità di rimanere intrappolate nelle aperture dei pori più piccole. Le portate più elevate causate da una maggiore pressione idrostatica hanno comportato una diminuzione della ritenzione e del trascinamento delle perle, come ci si aspetterebbe analizzando la crescita batterica nel dispositivo microfluidico eco chipp.

Notiamo le differenze qualitative nell'intensità dell'immagine nei diversi settori del dispositivo. L'intensità della fluorescenza può essere quantificata come proxy della biomassa microbica nel canale. Negli esperimenti in corso, osserviamo che le forze di taglio continue in condizioni di basso flusso sembrano causare l'aggregazione batterica e la formazione di gregge, come è evidente in queste immagini, vi abbiamo appena mostrato come creare e utilizzare semplici dispositivi microfluidici per misurare la scala delle particelle, far collidere il trasporto attraverso mezzi porosi o per studiare le interazioni microbiche in habitat microstrutturati.

Quando si eseguono studi utilizzando celle a flusso, è importante considerare la galleggiabilità delle perle e la chimica della superficie dei colloidi e dei collettori. Quando si riduce al regime microfluidico, gli effetti superficiali possono dominare i fenomeni osservati. Praticamente qualsiasi struttura fisica può essere incorporata nella progettazione di celle a flusso microfluidico.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.