Multicolor Citometria a Flusso di analisi Cellular risposta immunitaria in macachi Rhesus
22 aprile 2010
Abbiamo dimostrato l'utilità di citometria a flusso multicolore per informazioni dettagliate caratterizzazione fenotipica e funzionale del totale così come sottoinsiemi memoria di CD4 + e CD8 + T nei macachi rhesus, il modello ideale per l'HIV / AIDS studi vaccino.
Questo video mostra una procedura per stimolare e colorare le cellule mononucleate del sangue periferico o pbmc. Per l'analisi della citometria a flusso multicolore, Alec Watts di pbmc isolato da sangue intero viene inserito in piastre di coltura tissutale. Le cellule sono stimolate chimicamente o biologicamente per produrre una risposta immunitaria.
Dopo la stimolazione, viene aggiunto un cocktail di anticorpi per identificare i tipi di cellule in base ai marcatori di superficie espressi. Le cellule vengono quindi permeate e viene aggiunto un diverso cocktail di anticorpi per rilevare l'espressione delle citochine intracellulari, le cellule vengono quindi analizzate dai fatti per determinare i profili delle citochine per specifici sottogruppi di pbmc. Ciao, sono Amy Courtney del laboratorio del Dr.Jagan SAS nel Dipartimento di Immunologia dell'Università del Texas MB Anderson Cancer Center.
Ciao, sono Hong anche lei del laboratorio. Oggi vi mostreremo un'analisi multicitometrica delle risposte delle cellule T. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare le risposte immunitarie cellulari nella Maca di Reus.
Quindi iniziamo. Iniziare questo protocollo utilizzando un emocitometro per determinare la conta cellulare vitale di pbmc da Reuss Maca con il metodo di esclusione del colorante blu Trian. Lavorazione in cappa a flusso laminare reus.
Sospendere le cellule in terreno completo a una concentrazione di 10 milioni di cellule per millilitro per una stimolazione non specifica a 100 microlitri di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti. Quindi aggiungere 100 microlitri di terreno contenente PMA e CIN per portare il volume totale a 0,2 millilitri con una concentrazione finale di 50 nanogrammi per millilitro di PMA e 500 nanogrammi per millilitro di CIN per pozzetti di controllo negativo, aggiungere 100 microlitri di terreno completo da solo a ciascuno. Incubare bene le cellule a 37 gradi Celsius nell'atmosfera umidificata al 5% di anidride carbonica dopo 1,5 ore.
A felden A alla coltura ad una concentrazione finale di 10 microgrammi per millilitro e incubare per ulteriori 4,5 ore. Il felden A viene aggiunto alle citochine trapp nell'apparato G d'oro per aumentare la visibilità con l'immunocolorazione, dopo la centrifuga di stimolazione per rimuovere il terreno e quindi lavare aggiungendo 200 microlitri di lavaggio a flusso freddo, tampone e centrifugare a bassa velocità. Ripetere questo lavaggio, quindi inviare nuovamente 50 microlitri di tampone di lavaggio a flusso.
Le cellule sono ora pronte per essere colorate per l'espressione dei marcatori di superficie in ciascun pozzetto delle cellule risospese. Aggiungere un microlitro di colorante reattivo fluorescente all'acqua riparabile vivo morto preparato secondo le istruzioni del produttore e S. Incubare a quattro gradi Celsius al buio per 30 minuti mentre le cellule sono in incubazione.
Preparare le soluzioni coloranti che verranno utilizzate per i fatti in microprovette. Per prima cosa, prepara un cocktail in piedi per includere quanto segue in modo appropriato. Anticorpi monoclonali marcati con fluorescenza titolata, anti CD tre PE SCI sette, anti CD otto Alexa 700 anti CD 28 per CCP SCI 5.5, anti CD 95 A PC e anti CD quattro Pacific Blue Inflow Wash Buffer.
Successivamente, preparare i controlli di compensazione, che verranno utilizzati per determinare i coefficienti di spillover di ogni singola colorazione in altri rivelatori preparando una provetta di ciascun anticorpo coniugato fluorescente individualmente come una singola colorazione di colore. Infine, preparare le colorazioni di fluorescenza meno uno o FMO combinando tutti i reagenti tranne quello di interesse. Questo sarà utilizzato per determinare il confine tra una popolazione positiva e negativa duplicando i livelli di autofluorescenza e i dati presenti in campioni completamente colorati.
Dopo che le cellule sono state incubate nella colorazione morta viva, lavarle una volta con un tampone di lavaggio a flusso freddo per rimuovere il colorante in eccesso, aspirare il tampone di lavaggio. Quindi aggiungere le soluzioni coloranti preparate. Incubare le cellule a quattro gradi Celsius al buio per 30 minuti.
Lavare le cellule colorate con un tampone di lavaggio a flusso freddo per rimuovere l'anticorpo in eccesso. Quindi aggiungere 100 microlitri di soluzione di permeazione di fissazione BD per almeno 10 minuti. Conservare le cellule a quattro gradi Celsius al buio fino a 24 ore fino a quando non vengono utilizzate o continuare a marcare le citochine intracellulari per marcare le citochine intracellulari.
Per prima cosa permeare le cellule in 100 microlitri di una X permanente. Lavare, tampone, incubare per 10 minuti a quattro gradi Celsius al buio mentre le cellule sono in incubazione. Preparare gli anticorpi di colorazione, i controlli di compensazione e i controlli FMO in un tampone di lavaggio x permanente come prima.
Dopo che le cellule sono state incubate per 10 minuti, centrifugare e rimuovere il tampone di lavaggio one x perm. Aggiungere gli anticorpi di colorazione appropriati. Quindi incubare le cellule e gli anticorpi per 60 minuti a quattro gradi Celsius al buio dopo l'incubazione.
Lavare le celle due volte con la soluzione di permeazione. Dopo il lavaggio finale, sospendere nuovamente le cellule in aldeide paraforme all'1% in DPBS per fissare le cellule. Conservare le celle a quattro gradi Celsius al buio fino a quando non vengono utilizzate per un massimo di 24 ore.
Una volta che le cellule sono state colorate, utilizzare un citometro a flusso LSR a due o un citometro a flusso DP per eseguire i fatti. Quindi analizza i dati utilizzando FlowJo o un software simile. La composizione della PBMC nella reuss Maca è stata determinata utilizzando l'analisi fax.
Questa figura mostra lo schema di gating utilizzato per l'analisi dei diversi sottogruppi di cellule T di un animale rappresentativo. I linfociti sono stati prima gated tramite FSC a dispersione diretta rispetto a SSC a dispersione laterale e quindi sono stati identificati i linfociti vivi in base alla popolazione SSC e AQUA negativa. Le cellule T sono state quindi identificate da CD tre espressione, CD quattro positive, CD otto negative e CD quattro negative, sono state determinate anche le popolazioni di tre cellule T positive all'interno della CD, sono state determinate anche tre popolazioni di cellule T positive.
Le cellule T CD quattro positive e CD otto positive sono state ulteriormente distinte in diversi sottogruppi sulla base dell'espressione di CD 28 e CD 95 come cellule naive della memoria centrale e della memoria effettrice. Questa figura mostra la produzione di interferone gamma e IL due in Unstimulated e pma. CIN ha stimolato CD quattro cellule T positive e sottogruppi.
Si notino i distinti profili di citochine suscitati dalla stimolazione. In ogni sottoinsieme. Dobbiamo mostrarti come eseguire l'analisi citometrica a flusso multiplo di pbmc.
Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di impostare sia i controlli di compensazione del colore singolo che i controlli fluorescenti meno uno. Entrambi questi controlli sono necessari per una corretta analisi dei dati della citometria a flusso. Si prega di fare riferimento al nostro protocollo scritto per ulteriori informazioni sulla scelta dei controlli di compensazione.
Inoltre, ricorda che quando si utilizzano anticorpi marcati con fluorescenza, è importante coprire i campioni per proteggerli dall'esposizione alla luce. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.
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Panoramica
Questo video dimostra una procedura per stimolare e colorare le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) per l'analisi mediante citometria a flusso multicolore. Lo studio si concentra sulla caratterizzazione fenotipica e funzionale dei sottogruppi di cellule T CD4+ e CD8+ nei macachi rinoceronte, un modello per la ricerca sul vaccino contro l'HIV/AIDS.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Immunologia
- Citometria a flusso
- Ricerca sull'HIV/AIDS
Sfondo
- I macachi rinoceronte sono utilizzati come modello per studiare l'HIV/AIDS.
- Comprendere i sottogruppi di cellule T è cruciale per lo sviluppo del vaccino.
- La citometria a flusso multicolore consente un'analisi dettagliata delle cellule immunitarie.
- Le PBMC sono componenti chiave nello studio delle risposte immunitarie.
Obiettivo dello studio
- Caratterizzare i sottogruppi totali e di memoria delle cellule T.
- Utilizzare la citometria a flusso multicolore per un profilo immunitario dettagliato.
- Migliorare la comprensione delle risposte immunitarie nel contesto dell'HIV/AIDS.
Metodi utilizzati
- Isolamento delle PBMC dal sangue intero.
- Stimolazione chimica o biologica delle PBMC.
- Utilizzo di cocktail di anticorpi per identificare tipi cellulari e marcatori di superficie.
- Analisi dei profili di citochine mediante citometria a flusso.
Risultati principali
- Stimolazione e colorazione riuscita delle PBMC per l'analisi.
- Identificazione di specifici sottogruppi di cellule T basata sui marcatori di superficie.
- Caratterizzazione dell'espressione intracellulare delle citochine.
- Approfondimenti sulle risposte immunitarie rilevanti per l'HIV/AIDS.
Conclusioni
- La citometria a flusso multicolore è efficace per l'analisi delle cellule T.
- I macachi rinoceronte forniscono preziose informazioni per la ricerca sul vaccino contro l'HIV.
- Comprendere la dinamica delle cellule T è essenziale per sviluppare terapie efficaci.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Multicolor flow cytometry enables precise phenotypic and functional profiling of T-cell subsets in rhesus macaques, a critical preclinical model for HIV vaccine development. This approach supports target validation by quantifying cytokine-producing immune responses, informing go/no-go decisions in early discovery. The method enhances predictive confidence by linking antigen-specific stimulation to measurable intracellular cytokine outputs in defined memory populations.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring IFN-γ and IL-2 production in CD4+ and CD8+ T-cell subsets following stimulation.
- Operational Value: Provides qualitative and quantitative measures of intracellular cytokine expression to de-risk mechanistic ambiguity in immune target validation.
- Scientific Value: Supports biological de-risking through sensitive detection of minor antigen-specific T-cell fractions in PBMC samples from vaccinated animals.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing standardized staining and stimulation protocols for reproducible immune profiling.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through use of compensation controls and FMO controls to ensure accurate population gating.
- Scientific Value: Highlights screening readiness by enabling detection of cytokine profiles across naive, central memory, and effector memory T-cell subsets.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by aligning intracellular cytokine measurements in rhesus macaques with HIV pathogenesis and vaccine-induced immune responses.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by linking PBMC stimulation outcomes to functional T-cell characterization.
- Scientific Value: Focuses on predictive de-risking value by using cytokine production as a functional readout for vaccine immunogenicity assessment.
Pipeline & Workflow Integration
The method positions within the discovery continuum from early immune profiling to lead identification, supporting hypothesis testing and pathway clarification in infectious disease models.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing by quantifying cytokine production in specific T-cell subsets following PMA/ionomycin or antigen-specific stimulation.
- Screening: Describes assay readiness through standardized stimulation, surface and intracellular staining, and flow cytometric analysis of PBMC samples.
- Analytics: Highlights measurements such as IFN-γ and IL-2 production frequencies that enable comparison of immune responses across conditions and subsets.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by linking vaccine-induced T-cell responses in rhesus macaques to functional immune profiling relevant to HIV vaccine development.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for longitudinal immune monitoring across vaccine candidates and adjuvant formulations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in T-cell-mediated immune responses.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of multicolor flow cytometry assays for immune profiling.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in vaccine development programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative cytokine profiles in preclinical models.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in flow cytometry panel design, compensation, and gating strategy for multicolor immunophenotyping.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including flow cytometer (e.g., LSR II) and software (e.g., FlowJo) for high-dimensional data analysis.
- Cross-team standardization requirements for stimulation conditions, antibody titration, and control setup (single-color and FMO) across laboratories.
- Adaptation considerations across model systems, including optimization of stimulation concentrations and incubation times for non-human primate PBMC.
- Practical limitations supported by source material: necessity of light protection for fluorescent antibodies and careful titration to minimize spillover in multicolor panels.
