L'importanza della concentrazione della proteina corretta per Cinetica e determinazione affinità nella struttura-funzione di analisi

L'obiettivo generale di questo articolo video è fornire risposte alle due domande seguenti. Uno, gli studi sulle interazioni proteiche possono essere fatti in modo più affidabile misurando la frazione di un campione proteico che è effettivamente in grado di legarsi a un'altra proteina? Due, in che modo l'analisi cinetica può darci una migliore comprensione della struttura e delle relazioni di funzione?

Entrambe queste domande saranno affrontate in un esperimento che coinvolge Corp X 100, uno strumento che rileva le interazioni proteiche in tempo reale senza l'uso di etichette. Questo esperimento esaminerà l'interazione della cistatina B bovina con la cistina proteasi papaina, la struttura cristallina delle due proteine in complesso indica diversi residui coinvolti nel legame con la proteasi per determinare come ciascuno dei residui interagenti influenza l'interazione della cistatina B papina. Diverse varianti della cistatina B sono prodotte tramite mutagenesi sito-specifica.

In tali esperimenti, c'è sempre la possibilità che le proteine ricombinanti non si pieghino correttamente, si aggreghino o si deteriorino, portando a risultati errati e irriproducibili. VIACORE X 100 è in grado di determinare la frazione di proteina disponibile per il legame mediante analisi della concentrazione senza calibrazione abbreviata CFCA. Questo approccio consente di determinare la concentrazione di proteine con attività di legame trattenuta anche quando non sono disponibili standard di calibrazione.

Il CFCA sarà utilizzato qui per determinare la concentrazione delle varianti della cistatina B. Questi dati saranno poi utilizzati come input nella determinazione della cinetica di legame delle varianti di cistatina B a Pepin, che viene valutata anche utilizzando BOR X 100. Ciao, sono CLA gram di GE Healthcare in Svezia.

Oggi la mia collega Eva Pool vi mostrerà come eseguire l'analisi delle relazioni struttura-funzione utilizzando BOR X 100 Le proteine ricombinanti possono mostrare un ripiegamento improprio o un'attività di loose bin nel tempo e questo comportamento non può essere rilevato con metodi che si basano sulla misurazione della concentrazione totale. Ciò può in effetti portare a dati cinetici errati dopo le misurazioni della concentrazione mediante analisi della concentrazione senza taratura. B.A core X 100 viene utilizzato per analizzare la cinetica e l'affinità dell'interazione delle varianti della cistatina B con il pepane.

Questi parametri daranno un'idea del meccanismo di legame. Iniziamo con una breve spiegazione del disegno sperimentale, quindi iniziamo. L'interazione tra la cistina, la proteasi, la papina e l'inibitore della cistatina B è dominata dai contatti idrofobici, come rivelato dalla struttura cristallina delle due proteine in complesso.

Dal lato dell'inibitore, le aree di contatto sono i terminali N e C N e due anelli a forcina. In questo studio, sono stati esaminati quattro mutanti, ognuno dei quali contiene cisteina tre alla mutazione siriana introdotta al fine di prevenire la dimerizzazione della cistatina B.Sulla base del contesto rivelato nella struttura cristallina, la leucina 73 è stata mutata in glicina istamina 75 in glicina e la tirosina 97 è stata cambiata in alanina. Le due mutazioni della glicina sono state introdotte per esaminare l'importanza delle catene laterali dell'istidina 75 e della leucina 73 per il legame con Pepin, il residuo di tirosina è stato mutato in alanina per studiare l'interazione tra il C terminale della cistatina B e Pepin.

I tre doppi mutanti, così come l'INE tre, il singolo mutante siriano, sono stati testati per la loro interazione con una variante cataliticamente inattiva della papaina S metil popina. Questa forma catalmente inattiva del Proteus ha un gruppo metilico attaccato al CYS 25 nella fessura attiva. Per semplicità, chiameremo questa variante propan in tutto il protocollo.

Il CFCA si basa sulla misurazione della velocità di legame in condizioni in cui la velocità è limitata dalla diffusione delle molecole dell'analita sulla superficie. Ciò è favorito da alti livelli di immobilizzazione del ligando. Prima di iniziare la procedura di immobilizzazione, posizionare il tampone HEPs utilizzato negli esperimenti sul vassoio sinistro e inserire entrambi i tubi.

Posizionare anche una bottiglia di rifiuti vuota sul vassoio destro. Quindi inserire un nuovo sensore di gesso cinque nell'inizializzazione dello strumento tramite il software Core X 100 e, nella schermata iniziale, fare clic sull'elemento dello strumento chip dock. Fare clic su avvia documento nel software.

Successivamente, utilizzare la procedura guidata di immobilizzazione per impostare la pappa e l'immobilizzazione mirando all'accoppiamento per censurare CM cinque dalla schermata iniziale, fare clic sul pulsante delle altre opzioni, quindi selezionare le procedure guidate. Verrà visualizzata una finestra con le procedure guidate disponibili. Seleziona l'immobilizzazione e quindi fai clic sul nuovo pulsante In basso a destra, viene visualizzata la prima schermata della procedura guidata di immobilizzazione che mira all'accoppiamento al sensore di gesso cinque è l'impostazione predefinita.

Selezionare la casella sotto la cella di flusso due per immobilizzare nella cella di flusso due. La cella di flusso uno viene lasciata invariata per utilizzarla come superficie di riferimento tra le tre opzioni disponibili di seguito. Selezionare la casella Specifica tempo di contatto sul livello di destinazione corretto cambia in tempo di contatto, specificare un tempo di contatto di 900 secondi.

Quindi, inserire i parametri di immobilizzazione sotto la soluzione di ligando slash della molecola di cattura. Entra in gioco la papaina. Quindi fare clic su Avanti.

La schermata successiva mostra il layout del rack per campioni. La posizione uno terrà et etanolammina utilizzato per disattivare il rimanente attivo dopo l'accoppiamento di puntamento del ligando papaina alla superficie del chip. Inserire la soluzione di etanolammina in posizione uno in posizione due.

Posizionare il ligando, papaina, papaina è conservata in un eccesso di solfato di metile e alluso a 50 microgrammi per millilitro in tampone di acetato di sodio da 10 millimolari. pH 4,5 ricostituire i reagenti di accoppiamento EDC e NHS dal kit di accoppiamento amminico con doppia pipetta di acqua distillata 85 microlitri di EDC in una fiala. Tappalo e mettilo in posizione tre.

Utilizzare lo stesso volume per NHS in posizione quattro. Si noti che il file cinque deve essere chiuso e vuoto in modo che lo strumento possa mescolare ED, C e NHS in questo file. Ricordarsi inoltre di riempire il file di lavaggio in posizione H2O con acqua fresca deionizzata.

Quando il rack è stato riempito in base al contorno sullo schermo, fare clic su carica campioni e caricare il rack nello strumento. Una volta caricato il rack, fare clic su Avanti. Prima dell'avvio della corsa, viene visualizzata una lista di controllo.

Assicurati che tutti i punti elenco siano soddisfatti quando lo sono. La corsa viene avviata premendo il pulsante di avvio. La corsa viene avviata durante la procedura di immobilizzazione.

I dati sono raccolti in tempo reale. Innanzitutto, vengono iniettati i reagenti di accoppiamento. Successivamente la pappa viene accoppiata alla superficie del chip e la procedura termina con la disattivazione degli esteri attivi rimanenti.

Dopo l'esecuzione, una finestra di dialogo riepiloga il risultato dell'esecuzione. In questa finestra viene visualizzato il livello di immobilizzazione. L'intera procedura di accoppiamento dovrebbe portare a circa 3000 RU di papaina immobilizzata.

Una volta che la papaina è stata immobilizzata sul chip del sensore, iniziare l'analisi CFCA diluendo i campioni mutanti di cistatina B a una concentrazione totale di circa 10 nanomolari in almeno 300 microlitri. Registrare il fattore di diluizione poiché lo utilizzeremo più avanti nella configurazione del saggio. Iniziare visualizzando la finestra di dialogo della procedura guidata come descritto nella sezione precedente nella sezione di concentrazione della cartella del saggio.

Scegli senza calibrazione, quindi scegli nuovo. La prima schermata della procedura guidata mostra la sequenza di iniezione. Le impostazioni possono rimanere invariate poiché in questo caso vengono utilizzati il chip sensore CM five e un approccio di test di immobilizzazione diretta.

Fare clic su Avanti nella schermata successiva. Lasciare selezionate le caselle di controllo prime prima dell'esecuzione e l'opzione Esegui cicli di avvio. Inoltre, lasciare invariato il numero predefinito di cicli di avvio a tre.

Immettere heaps buffer nel nome del campo della soluzione. Quindi fare clic su Avanti. Nella schermata successiva, inserire il nome della soluzione di rigenerazione, che è idrossido di sodio da 20 millimolari.

Lasciare invariati gli altri parametri. Fare clic su Avanti per visualizzare la tabella di esempio. Impostare i campioni in base alla tabella dei campioni.

Ogni riga della tabella di esempio produce due cicli. Uno con una portata di 10 microlitri al minuto e uno con 100 microlitri al minuto. Inizia la corsa con un pezzo grezzo.

Quindi inserire il nome, fattore di diluizione, coefficiente di diffusione a 20 gradi Celsius e peso molecolare. Per ogni mutante il coefficiente di diffusione può essere calcolato utilizzando lo strumento web sul sito web del prodotto. Un collegamento a questo strumento è fornito nel navigatore di supporto del software.

Poiché si consiglia di eseguire ogni esempio e duplicarlo, copiare l'intera tabella dalla riga vuota all'ultimo esempio e incollarla nella parte inferiore della tabella. Fare clic su Avanti per procedere. La schermata successiva mostra il rack per campioni.

Posizionare i campioni e i reagenti nel rack secondo il layout delineato dal software. Caricare il rack nello strumento premendo il pulsante di caricamento dei campioni. Quindi fare clic su Avanti.

Dopo aver caricato i campioni, viene visualizzata una schermata di promemoria con una lista di controllo. Assicurati di controllare tutto e quindi premi start. I dati vengono raccolti in tempo reale durante la corsa.

Al termine dell'esecuzione, chiudere la finestra che visualizza i dati raccolti. Si noti che nella finestra principale è apparso un nuovo elemento del risultato. Per calcolare le concentrazioni dai dati, selezionare la nuova voce di risultato e fare clic sul pulsante.

Valutazione tramite core X 100. Il software di valutazione viene avviato visualizzando tutti i dati raccolti dalla barra degli strumenti, selezionando l'analisi della concentrazione e quindi la calibrazione libera dal menu. Nella prima finestra, scegli i dati da includere nell'analisi.

Scorrere l'elenco e scorrere l'elenco delle visualizzazioni per visualizzare i dati di tutti i campioni. Se si desidera escludere dei dati, rimuovere il segno di spunta dall'elenco. Fare clic su Avanti per avviare il calcolo.

Il modello di interazione CFCA viene adattato automaticamente ai dati sperimentali quando l'adattamento è completato, i risultati vengono riportati per ogni campione nella finestra dei risultati. Passa attraverso gli adattamenti per ogni campione selezionando la riga corrispondente nella tabella. La colonna chiamata concentrazione misurata mostra la concentrazione nel campione analizzato.

La concentrazione nel campione originale viene calcolata utilizzando il fattore di diluizione inserito in precedenza e mostrata nella colonna concentrazione calcolata al termine, fare clic su Fine per salvare il risultato. Ora che conosciamo le concentrazioni delle proteine dall'analisi CFCA, abbiamo un'ottima base per le nostre successive misurazioni cinetiche. L'analisi cinetica ci aiuterà ora a comprendere l'importanza dei residui di amminoacidi chiave per il meccanismo di legame.

Iniziamo con una configurazione dell'analisi cinetica. L'analisi cinetica inizia agganciando un nuovo chip sensore CM 5 allo strumento nella schermata iniziale. Scegliere di creare un flusso di lavoro di analisi per l'affinità di kinetic.

Nell'angolo in alto a sinistra viene visualizzata una finestra di dialogo in cui vengono inserite le informazioni sul ligando. Inserisci il nome papaina nella casella del nome del ligando e scegli un'altra proteina dall'elenco dei tipi di specie. Quindi selezionare immobilizzare il ligando in modo covalente utilizzando il chip sensore CM cinque tra i due approcci alternativi di attacco del ligando presentati, il flusso di lavoro del saggio consigliato è ora delineato sul lato destro della finestra.

Si inizia con una fase di immobilizzazione seguita da una fase di analisi. Premere continua per procedere. Salvare il flusso di lavoro del test come richiesto inserendo un nome e premendo Salva.

Il software ora delinea il flusso di lavoro del saggio con pulsanti associati a ogni fase. Il primo passo nella preparazione della superficie del sensore è trovare un pH di mobilizzazione. Poiché questo pH è noto, premere inserisci valore noto nella finestra di dialogo che appare.

Immettere il nome del tampone acetato e il pH 4,5 e scegliere Salva. Il flusso di lavoro del test viene ora aggiornato con un segno di spunta verde per indicare che questo passaggio è stato completato. Ora è il momento di immobilizzare, premere il pulsante di corsa nel passaggio immobilizzato.

Questo porta alla stessa procedura guidata utilizzata per il propano e l'immobilizzazione per l'analisi CFCA L'immobilizzazione del papino per l'analisi cinetica è impostata allo stesso modo qui, tranne per il fatto che una soluzione più diluita viene iniettata per meno tempo. Questo al fine di immobilizzare meno papina per evitare situazioni in cui i tassi di legame dei mutanti della cistatina sono limitati dalla diffusione in modo che i dati cinetici possano essere misurati isolatamente. Poiché il nome del ligando e il pH di immobilizzazione sono stati inseriti nelle fasi precedenti del flusso di lavoro del saggio, questi sono entrambi preimpostati qui.

L'unico aggiornamento richiesto è di 50 secondi per il tempo di contatto. L'immobilizzazione procede quindi come mostrato in precedenza. Il legame previsto dopo il livello di immobilizzazione è 50 R ru.

Un segno di spunta verde accanto al pulsante di corsa indica che l'immobilizzazione è completa. Successivamente, immettete la soluzione di rigenerazione nel flusso di lavoro del passo. Per individuare le condizioni di rigenerazione, fare clic su Immetti valori noti nella finestra di dialogo visualizzata.

Inserire la soluzione di rigenerazione e il tempo di contatto. Quindi fare clic su Salva. Ora che il ligando è immobilizzato e le condizioni di rigenerazione sono entrate, tutto è impostato per generare i dati cinetici nella casella del saggio di affinità cinetica di esecuzione, premere il pulsante di esecuzione il primo passaggio della cinetica.

La procedura guidata di affinità delinea la sequenza di iniezione di ogni ciclo per la cinetica del ciclo singolo, che viene utilizzata qui, non è necessario modificare nulla. Fare clic su Avanti per procedere. Nel passaggio successivo, mantenere le impostazioni predefinite che indicano l'adescamento del sistema prima dell'esecuzione.

Scegliere di eseguire un ciclo di avvio per equilibrare la superficie del chip. Quindi, definire i parametri di iniezione per il campione. Poiché la soluzione di rigenerazione è stata specificata in precedenza e l'impostazione è predefinita, non è necessario modificare i parametri nella schermata.

Fare clic su Avanti. Infine, specificare gli esempi. Inserisci due righe per ogni variante mutante, una vuota e l'altra con campione.

Un ciclo in bianco è indicato impostando il parametro di concentrazione più alto su zero. Due. Le varianti di cistatina B possono essere inserite in ogni corsa. Per ogni mutante inserire il peso molecolare, la concentrazione più alta e il fattore di diluizione, premere avanti.

Nella schermata seguente, viene delineato il rack per campioni. Preparare una serie di diluizioni dei campioni proteici e posizionare le fiale con tappo nel rack Come indicato sullo schermo, una fiala con tampone viene posizionata in posizione 13 e una fiala con la soluzione di rigenerazione viene posizionata in posizione 14. Assicurarsi di riempire la posizione dell'acqua con acqua fresca.

Posizionare il rack nella macchina e caricare i campioni premendo il pulsante di caricamento dei campioni e fare clic su Avanti. Come in precedenza, eseguire un controllo finale prima di procedere con l'esecuzione dell'esperimento premendo start i dati di interazione vengono visualizzati in tempo reale. Al termine dell'esecuzione, procedere immediatamente con l'esecuzione delle restanti varianti di cistatina B secondo quanto appena dimostrato.

Se le restanti varianti di cistatina B vengono eseguite in successione, omettere il passaggio principale e il ciclo di avvio deselezionando le caselle di controllo corrispondenti nel passaggio. Al termine di ogni esecuzione, è possibile accedere ai dati dal collegamento. Tutti i risultati nel flusso di lavoro del saggio.

Viene visualizzata una finestra di dialogo con tutti i risultati generati all'interno di questo flusso di lavoro. Per calcolare le costanti di velocità cinetica, selezionare il risultato da valutare e premere valuta per essere un core Il software di valutazione X 100 viene riavviato visualizzando tutti i dati collettivi. Selezionare l'affinità cinetica dal menu della barra degli strumenti.

Nel primo screening, la cisteina tre al mutante siriano viene selezionata per la valutazione. I dati di questo mutante vengono visualizzati insieme alla corsa in bianco eseguita per questo mutante e procedono facendo clic. Prossimo. La schermata successiva mostra i dati con la sequenza vuota sottratta dalla sequenza con campione.

Scegliere di valutare la cinetica facendo clic sul pulsante cinetica. Ora scegli di adattare i dati a un modello di interazione uno-a-uno. Facendo clic sul pulsante Adatta, l'adattamento viene visualizzato sullo schermo man mano che viene calcolato.

Una volta pronto, i controlli di qualità vengono applicati automaticamente ed evidenziati in basso. Esamina gli elementi del controllo di qualità e quindi esamina i dati dei grammi del sensore per assicurarti che i grammi del sensore mostrino una curvatura sufficiente. Inoltre, dai un'occhiata al grafico residuo che mostra le differenze tra i dati raccolti e il modello adattato.

Prestare attenzione alle deviazioni sistematiche e non casuali. Questa vestibilità è accettabile. Ora dai un'occhiata ai dati cinetici nella scheda del rapporto.

La costante di velocità di associazione, la costante di velocità di dissociazione e la costante di dissociazione di equilibrio. Al termine, premere Fine e ripetere la stessa procedura per tutti gli altri mutanti. Ecco i risultati rappresentativi dell'analisi CFCA per le diverse varianti di cistatina B esaminate.

I dati specifici sulla concentrazione di legame vengono estratti dai grammi del sensore ottenuti a velocità di flusso di 10 e 100 microlitri al minuto. Confrontando la concentrazione determinata da una misurazione di due 80 con quella determinata dal CFCA, è chiaro che mentre nella maggior parte dei casi la proteina è completamente attiva per la variante leucina 73 glicina, la frazione di proteina attiva è molto bassa. La cinetica delle varianti della cistatina B che si legano alla pepina è determinata utilizzando la cinetica del ciclo singolo.

I grammi dei sensori mostrano dati vuoti e di riferimento sottratti con cinetica per un modello di interazione uno-a-uno sovrapposti in nero. La concentrazione specifica di legame misurata da CFCA per la variante leucina 73 è solo circa il 10% della concentrazione proteica totale determinata da una misurazione di due 80. Quando si utilizza la concentrazione corretta nel calcolo dei parametri cinetici, diventa chiaro che il tasso di associazione per Lucien 73 è simile a quello delle altre varianti.

Mentre i tassi di associazione dei mutanti sono paragonabili a quelli della proteina wild type, la costante del tasso di dissociazione dei mutanti può essere più alta di quasi due ordini di grandezza con un corrispondente aumento della costante di dissociazione di equilibrio. Le affinità ridotte dipendono principalmente dall'aumento dei tassi di dissociazione, indicando che sia il secondo anello di legame che l'estremità terminale C della cistatina B contribuiscono all'affinità di legame mantenendo l'inibitore attaccato all'enzima una volta che il complesso è stato formato, l'uso dell'analisi della concentrazione libera da calibrazione è stato essenziale per questa conclusione perché uno dei mutanti si è rivelato avere un'attività di legame molto bassa, Il mio collega Pol vi ha mostrato come utilizzare bi core X 100 in uno studio strutturato sulle funzioni. Quando si eseguono questi esperimenti, è importante ricordare che, sebbene sia la concentrazione che l'analisi cinetica si basino sulla stessa procedura di legame, le condizioni sperimentali sono molto diverse.