Microfluidica Co-coltura di cellule epiteliali e batteri per le indagini solubile del segnale mediato da Interazioni

Questo protocollo illustra l'uso di un nuovo modello microfluidico di co-coltura che permette la coltivazione indipendente di cellule eucariotiche insieme a batteri, al fine di testare l'effetto del microambiente commensale sulla colonizzazione da parte di patogeni. Il modello di co-coltura viene dimostrato sviluppando un biofilm di e coli commensale tra cellule HeLa, seguito dall'introduzione di e coli enterorraggiativo (EHEC) nell'isola commensale, in una sequenza che imita quella degli eventi che si verificano durante un'infezione del tratto gastrointestinale.

L'estensione risultante della colonizzazione delle cellule epiteliali da parte di EHEC viene visualizzata mediante microscopia a fluorescenza. Ciao, sono del laboratorio di biotecnologia dei sistemi molecolari del Dipartimento di Ingegneria Chimica della Texas e M University. Oggi vi mostreremo un procedimento per coltivare batteri e cellule eCard insieme in un dispositivo microfluidico, in un modo che imita l'organizzazione del tratto gastrointestinale umano.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare come la colonizzazione delle cellule epiteliali da parte di batteri patogeni sia influenzata dai segnali che questi incontrano nel tratto tri prima della colonizzazione. Cominciamo dunque. Prima dell'esperimento, preparare un master in silicone progettato e realizzato in base all'uso sperimentale previsto.

Ad esempio, il Stanford Microfluidics Foundry produrrà stampi master progettati a partire dai quali possono essere realizzati successivi stampi di replica sperimentali. Per il dispositivo a tre strati descritto in questo protocollo, sono necessari stampi per due membrane per lo strato di coltura cellulare eucariotica e lo strato pneumatico e un canale batterico; le altezze dei canali per gli strati batterico, pneumatico e di coltura cellulare eucariotica sono rispettivamente di 5, 200 e 100 micrometri. Prima di preparare uno stampo di replica, esporre lo stampo master in SU-8 al vapore di fluorocillina in un essiccatore collegato a una sorgente di vuoto. Per facilitare il facile distacco dello stampo in PDMS dallo stampo master, aggiungere una goccia di fluoro-silano su un tovagliolo di carta nella camera a vuoto ed applicare il vuoto per un minuto.

Rimuovere il vuoto e attendere 30 minuti per il deposito del fluoro. Conservare il master in SU-8 in una piastra di Petri per un uso futuro al fine di creare stampi di replica. Preparare il prepolimero di PDMS e l'agente di reticolazione in un rapporto ponderale di 10 a 1 e mescolare accuratamente; degasare la miscela in una camera a vuoto per un'ora.

Per rimuovere le bolle d'aria, posizionare il master SU-8 in una capsula di Petri e versare con attenzione il PDMS sul master utilizzando cinque grammi di PDMS per il e 30 grammi di PDMS per lo strato batterico. Sottoporre nuovamente il PDMS a degasaggio per 10 minuti per eliminare le bolle d'aria. Successivamente, far ruotare lo stampo per un minuto per distribuire il PDMS in una membrana uniforme.

In questo protocollo, la membrana per colture cellulari eucariotiche viene centrifugata a 1200 giri al minuto per uno spessore di 150 micrometri, mentre la membrana pneumatica viene centrifugata a 800 giri al minuto per uno spessore di 250 micrometri. Dopo la centrifugazione, mantenere la piastra di Petri contenente il PDMS e il modello principale SU otto per 15 minuti a temperatura ambiente prima di riscaldarla su una piastra riscaldante a 80 gradi Celsius per un'ora. Per polimerizzare il PDMS, dopo la polimerizzazione inumidire il PDMS con metanolo e staccarlo con cura dai modelli principali SU otto utilizzando pinzette pulite.

Posizionare lo strato batterico su un stereomicroscopio e, utilizzando un ago da 20 gauge con estremità smussata, praticare tre fori: due ingressi per i batteri e un'uscita. Il dispositivo a tre strati viene assemblato nel seguente ordine: legatura dello strato pneumatico allo strato batterico, seguita dalla legatura dello strato per la coltura di cellule eucariotiche allo strato batterico più quello pneumatico.

Posizionare il film pneumatico e lo strato batterico su un vetrino e sottoporli a plasma in una camera a plasma di ossigeno per 40 secondi a una pressione di ossigeno di 10 centimetri cubici standard al minuto (SCCM) e una potenza radiofrequenza (RF) di 100 watt. L'aggiunta di metanolo nei film facilita il movimento libero degli strati e rende più semplice l'allineamento. Entro 10 minuti dall'esposizione al plasma di ossigeno, posizionare lo strato batterico in una piastra di Petri utilizzando pinzette e uno stereomicroscopio.

Allineare la membrana pneumatica centrale al livello batterico in base ai fori di ingresso e uscita per i batteri. Dopo l'allineamento, posizionare la piastra di Petri con la struttura in PDMS allineata su una piastra riscaldante a 80 gradi Celsius per otto ore per effettuare il legame. Al termine, praticare un foro nel livello pneumatico per controllare il canale pneumatico.

Successivamente, ripetere i passaggi di assemblaggio, allineamento e incollaggio per fissare il canale di coltura cellulare eucariotica al dispositivo PDMS composito assemblato. Praticare fori nei porti di ingresso e uscita utilizzati per la semina delle cellule eucariotiche. Collegare il tubo tigon ai porti e azionare lo strato pneumatico aspirando con la siringa da 20 millilitri.

Posizionare la struttura composita in PDMS e un'objecta di vetro precedentemente pulita all'interno di una camera a plasma ad ossigeno. Accendere il plasma per 20 secondi senza applicare il vuoto. Rimuovere la struttura composita in PDMS dalla camera a plasma ad ossigeno e collegare una siringa da 20 millilitri ad essa.

Estrare immediatamente creando un vuoto per evitare il contatto tra le valvole e il vetro. Far scivolare entro un minuto. Dopo l'esposizione al plasma, premere delicatamente la struttura composita in PDMS sul vetro.

Incubare il dispositivo in PDMS su una piastra riscaldata a 80 gradi Celsius per 10 minuti. Successivamente, collegare un tubo tigon a ciascun orifizio e sterilizzare il dispositivo sotto luce UV per 15 minuti. Poi, riempire una siringa da un millilitro con 500 microlitri di PBS sterile ed introdurli nel canale per rimuovere eventuali detriti.

Se si osserva una bolla d'aria, chiudere il tubo di uscita con una microprovetta da centrifuga einor ed esercitare una leggera pressione per far uscire la bolla attraverso gli strati di PDMS permeabili ai gas. Riempire il canale pneumatico con acqua sterile per prevenire la formazione di bolle d'aria nel canale.

Viene utilizzato un convertitore fai-da-te da pressione aria a liquido per prevenire la formazione di bolle d'aria nel canale pneumatico. Per preparare la semina di cellule eucariotiche sul vetro, introdurre 500 microlitri di fibronectina nella regione di coltura cellulare attraverso l'ingresso per la coltura di cellule eucariotiche. Utilizzando una siringa, mantenere la valvola chiusa e incubare per 40 minuti a 37 gradi Celsius.

Infine, rimuovere l'eccesso di fibronectina lavando con un millilitro di terreno di crescita utilizzando la pompa a siringa. Il dispositivo è ora pronto per essere utilizzato nell'esperimento per formare un biofilm commensale: diluire i batteri in terreno minimo M9 fino a un OD 600 di circa uno. In questo esempio, utilizziamo un ceppo di laboratorio di e coli, ma può essere utilizzato qualsiasi ceppo batterico non patogeno.

Chiudere la valvola che separa le regioni di coltura cellulare batterica ed eucariotica applicando una pressione idraulica positiva. Introdurre 0,2 millilitri di e coli con un OD 600 di circa 1,0 nelle isole mediante una pompa per siringa e lasciare che i batteri si attacchino per un'ora a 32 gradi Celsius. Dopo l'incubazione.

Perfondere una sospensione batterica diluita con OD 600 di circa 0,05 e mezzo minimo M nove a 0,25 millilitri all'ora per 12 ore. Utilizzando la pompa per siringa, lavare il biofilm con 0,5 millilitri di mezzo DMEM fresco, privo di siero e antibiotici, a 0,5 millilitri all'ora mediante pompa per siringa per rimuovere i batteri debolmente aderenti e preparare il biofilm all'adesione delle cellule eucariotiche; acquisire un'immagine del biofilm. Utilizzare un microscopio confocale a scansione laser Leica T-C-S-S-P cinque e visualizzare l'architettura del biofilm mediante il software MS.

Prova con tripsina sugli occhi, preleva cellule HeLa da un fiasco per colture cellulari e risospendile. Sospendi le cellule in mezzo DMEA fino a un volume totale di 0,1 millilitri a una densità di semina di cinque per 10 alla quinta cellule per millilitro. Introduci le cellule HeLa nella regione eucariotica del dispositivo a una velocità di flusso di due millilitri al minuto utilizzando una pompa per siringa Pico Plus.

Successivamente, utilizzando un microscopio ottico, assicurarsi che la valvola che separa la regione batterica commensale dalla regione delle cellule eucariotiche sia completamente chiusa, in modo che il biofilm batterico sia separato dalla regione delle cellule helo. Utilizzando una pinza per microprovetta einor, chiudere l'uscita cellulare per ridurre il movimento della sospensione cellulare nel canale e incubare per sei ore a 37 gradi Celsius in un incubatore con 5% di anidride carbonica. Al termine dell'incubazione, perfondere il dispositivo mediante una pompa per siringa con 50 microlitri di mezzo di crescita DMEM a 0,5 millilitri all'ora.

Per rimuovere le cellule non attaccate, sostituire il mezzo DMEM per le regioni di hela e di e coli commensale ogni sei ore. Preparare e coli oh 1 5 7 H sette, o EHEC, in mezzo M nove per infettare le cellule hela a una molteplicità di infezione o MOI di 100-200 cellule EHEC per una cellula hela, eliminando i batteri commensali debolmente aderenti come descritto nella sezione precedente. Introdurre una sospensione diluita di EHEC di 100 microlitri con un OD 600 di circa 0,1 nelle isole mediante una pompa per siringa a un flusso di 0,25 millilitri all'ora.

In seguito, incubare il dispositivo a 37 gradi Celsius in un'incubatrice con 5% di anidride carbonica per sei ore senza flusso, in modo da permettere all'EHEC di essere esposta ai segnali presenti nel biofilm commensale. Al termine dell'incubazione, aprire la valvola che separa la regione batterica commensale da quella delle cellule eucariotiche utilizzando una pompa a vuoto per creare il vuoto e mantenere la valvola aperta per sei ore. Questo esporrà l'HEC nel biofilm batterico commensale alle cellule HeLa; successivamente, procedere a un'ulteriore incubazione per sei ore a 37 gradi Celsius in un'incubatrice con 5% di anidride carbonica.

Introdurre il colorante vitale (live dead stain) nel dispositivo preparato secondo le istruzioni del produttore. Per la valutazione della vitalità delle cellule helo, iniettare 0,1 millilitri di soluzione tampone nell'area eucariotica del dispositivo utilizzando una siringa da un millilitro come controllo per stimare la morte delle cellule helo. In assenza di EHEC, ripetere i tre passaggi precedenti e introdurre nel dispositivo un mezzo DMEM sterile, privo di siero e di antibiotici.

Invece di EHEC, immagine più posizioni su un microscopio a fluorescenza Zeiss AIOt 200 M e stimi il numero di cellule epiteliali vive in verde tra le cellule epiteliali morte in rosso contando il numero di cellule verdi da immagini ottenute in almeno sette posizioni. Ora mostreremo alcune immagini rappresentative del dispositivo microfluidico con strato di prova. In questa immagine, utilizziamo un colorante alimentare inerte per rappresentare le diverse regioni di coltura.

Il colorante viola rappresenta la regione della coltura cellulare eucariotica, mentre il colorante verde rappresenta il biofilm batterico commensale. In questa immagine, dimostriamo la fattibilità di mantenere distinte tra loro le regioni eucariotiche e batteriche, poiché il colorante viola nella regione batterica è distinto dal colorante giallo circostante. Qui viene mostrata la colonizzazione del biofilm batterico commensale esprimente proteina verde da parte di batteri patogeni esprimenti proteina rossa.

Come mostrato in questa immagine, gli EHEC e i batteri commensali sono distinti dalle cellule HeLa che circondano il biofilm batterico. Vi abbiamo appena mostrato come assemblare un dispositivo microfluidico a strato secco per la coltura congiunta di batteri e cellule epiteliali e per lo studio dell'effetto di segnali solubili sulla colonizzazione da parte di patogeni. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordarsi di rimuovere eventuali bolle d'aria nel dispositivo e utilizzare il patogeno a un appropriato rapporto di infezione multiplo per cellula.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con il vostro esperimento.