Name: Un dispositivo a microfluidi per quantificare chemiotassi batterica in gradienti di concentrazione stabile (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-19T17:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Impara a quantificare la chemiotassi batterica in gradienti stabili utilizzando un dispositivo microfluidico con E. coli RP 4 37. Questo metodo consente di studiare i meccanismi di navigazione cellulare in biotecnologia.

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Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla National Science Foundation (cbet 0846453).

1. Fabbricazione di maestri silicio utilizzando le normali SU-8 fotolitografia 1 (non mostrato in questo video). <ol><li> Uso standard SU-8 metodi di fotolitografia per creare un SU-8 "master" (SU-8 2025, MicroChem, Newton, MA) per la realizzazione dello stampo PDMS che contiene la rete microfluidica e la camera di chemiotassi. Stampi maestro tale può essere fabbricato in qualunque impianto di microfabbricazione (ad esempio, Stanford Microfluidica Fonderia; <a href="http://thebigone.stanford.edu/foundry/">http://thebigone.stanford.edu/foundry/</a> ). </li><li> Prima della replica PDMS, esporre il SU-8 master fluorosilane vapore in un essiccatore collegato ad una fonte di vuoto per facilitare il rilascio facile PDMS dal master. Aggiungere una goccia di fluorosilane ad un tovagliolo di carta e si applicano a vuoto per un min. Rimuovere il vuoto e attendere 30 minuti per la deposizione di fluorosilane. Tenere il SU-8 master in un contenitore chiuso per un uso futuro. </li></ol> 2. Stampaggio replica del PDMS da SU-8 master: Lo strato di fluidi e il livello di controllo sono realizzati per stampaggio replica del PDMS da SU-8 master. <ol><li> Miscelare il PDMS pre-polimero e cross-linker ad un peso 10:1. rapporto e Degas in essiccatore per 1 ora (o fino a quando le bolle d'aria vengono rimossi dalla miscela PDMS). </li><li> Posizionare il SU-8 master in una capsula di Petri e con attenzione versare il composto PDMS sulla parte superiore del SU-8 master per lo spessore desiderato. </li><li> Riscaldare la capsula di Petri contenente il PDMS e il SU-8 stampo maestro a 80 ° C per due ore per curare il PDMS. </li><li> Rimuovere il curato PDMS coperto SU-8 master dalla piastra e la buccia di stampo PDMS dal SU-8 master. La struttura desiderata verrà incorporato nello stampo PDMS. </li><li> Fori pugno nello stampo PDMS per tubi al generatore di gradiente e di ingresso delle cellule utilizzando un calibro 20 smussato-end ago. </li></ol> 3. Incollaggio di dispositivi PDMS: <ol><li> Pulire un vetrino da microscopio in vetro con isopropanolo e asciugare con azoto o un flusso d'aria. </li><li> Esporre il PDMS e vetrino di plasma di ossigeno in un plasma asher. </li><li> Portare lo stampo PDMS a contatto con il vetrino. Calore la diapositiva contattato e PDMS stampo a 65 ° C per 15 min. </li></ol> 4. Montaggio del dispositivo PDMS <ol><li> Utilizzando una lama di rasoio, taglio tubi ad un angolo di 45 ° la lunghezza corretta necessaria per il dispositivo. </li><li> Inserire un'estremità del tubo nel fori nel dispositivo (ad esempio, outlet) con pinze. </li><li> Uso di pinze, inserire un brusco da 30 gauge in l'altra estremità del tubo. </li><li> Ripetere il punto 4.2 per tutte le lacune ancora esistenti. </li><li> Raccogliere 1 ml di buffer di chemiotassi (CB) in una siringa da 3 ml, avendo cura di eliminare le bolle d'aria dalla siringa. </li><li> Fissare un hub ago per una estremità del tubo di uscita. </li><li> Aggiungi CB al mozzo ago, e toccare il mozzo ago per rimuovere eventuali bolle d'aria. </li><li> Spingere un po 'fuori CB della punta della siringa e collegare la siringa 3 ml al mozzo dell'ago senza intrappolare l'aria. </li><li> Spingere CB attraverso il dispositivo fino a quando tutti gli hub ago rimanenti sono pieni di CB. Questo dovrebbe rimuovere la maggior parte delle bolle d'aria. </li><li> Riempire due siringhe 500μL con CB contenente le concentrazioni adeguate di chemoeffector in fase di test. Eliminare la formazione di bolle d'aria, spingendo fuori una piccola goccia dei contenuti siringa e toccare la goccia di liquido nel mozzo ago e fissaggio. </li><li> Allo stesso modo, collegare una siringa contenente CB verso l'ingresso del batterio. Questo sarà rimosso quando i batteri vengono introdotti nel dispositivo. </li></ol> 5. Crescita altamente mobili E. coli <ol><li> Grow culture durante la notte di E. coli RP437 con un'espressione GFP plasmide in 20 ml di brodo triptone (TB) a 32 ° C con agitazione. Aggiungi concentrazioni di antibiotico appropriato per mantenere il plasmide. Nel nostro protocollo, utilizziamo una pCM182 plasmide basso copia per la rilevazione di batteri sulla base di fluorescenza nel dispositivo. Per E. coli, le culture in crescita a 32 ° C è raccomandata per la motilità elevato, come la motilità è inferiore a temperature più elevate. </li><li> Utilizzare la lingua durante la notte per inoculare a 20 mL di cultura TB in un Erlenmeyer da 250 ml a una densità ottica a 600nm di ~ 0,05. Far crescere la coltura in agitazione a 32 ° C. </li><li> Raccogliere le cellule con un diametro esterno di 600 ~ 0,35 0,45 da bassa velocità di centrifugazione a 400 xg per 5 min. </li><li> Risospendere le cellule ad un diametro esterno di 600 ~ 0.35 in CB contenente il chemoeffector alla concentrazione prevista nel bel mezzo del canale. </li><li> Aggiungere RFP marcato le cellule morte con un diametro esterno di 600 ~ 0,35 alla GFP che esprimono cellule vive. I morti (rosso), le cellule vengono utilizzati come controllo interno per garantire che qualsiasi migrazione non è dovuto agli effetti del flusso. </li></ol> 6. Monitoraggio chemiotassi <ol><li> Rimuovere alcuni dei CB dall'ago ingresso cellulamozzo. Riempire con la sospensione cellulare. </li><li> Delicatamente riempire la siringa 50μL con le cellule risospese. Questo passo deve essere fatto lentamente come flagelli possono essere tranciati e ridurre la motilità. </li><li> Attaccare la siringa 50μL verso l'ingresso del centro-ago come descritto al punto passi 4.10. </li><li> Posizionare il dispositivo sul palco di un microscopio a fluorescenza dotato di una telecamera ad alta velocità per l'acquisizione delle immagini. Posizionare le siringhe di aspirazione (sia la 500 siringhe gradiente microlitri e la siringa da 50 celle mL) nella pompa a siringa e avviare il flusso in modo tale che il gradiente è formato e le celle sono che scorre attraverso il tubo. </li><li> Una volta che le cellule entrano nella camera chemiotassi, attendere circa 20 minuti per il sistema si stabilizzi prima di imaging. </li><li> Raccogliere verde (dal vivo) e rosso (morti) le immagini di fluorescenza a diverse posizioni lungo la lunghezza della camera (corrispondenti a diversi tempi di esposizione). Di solito, raccogliamo 100 immagini in ogni posizione ad intervalli di 3 secondi. </li></ol> 7. Analisi dei dati: la procedura seguente può essere eseguito utilizzando qualsiasi programma di analisi disponibili in commercio di immagini (ad esempio, ImageJ, Metamorph) o con semplici codici scritti in Matlab. <ol><li> Rimuovere i pixel di sfondo dell'immagine (cioè la soglia di intensità dei pixel e rimuovere tutti i pixel che hanno un'intensità inferiore alla soglia). Questo riduce al minimo rumore nell'analisi. </li><li> Utilizzare la posizione delle cellule morte (fluorescenza rossa) per determinare il centro dell'immagine. Dal momento che le cellule morte non mostrano chemiotassi, questa rappresenta la posizione in cui le cellule entrato nella camera di chemiotassi e sarebbe rilevato in assenza di migrazioni. </li><li> Individuare le cellule vive (fluorescenza verde) nell'immagine. </li><li> Dividere l'immagine in canali e determinare il numero di cellule vive in ogni canale. Nel nostro lavoro precedente 3, il micron 1050 chemiotassi ampia camera era divisa in 64 canali che sono ogni ~ 16 micron di larghezza. </li><li> Ripetere i passi 7,1 7.3 per tutte le immagini e la somma del numero di cellule totale per ogni canale in tutte le immagini. Questo dà il conteggio totale delle cellule rilevato in ciascun canale per tutta la durata dell'esperimento. </li><li> Calcolare il coefficiente di partizione chemiotassi (CPC), che rappresenta la direzione della migrazione, come segue: ogni cellula si trova nella alta concentrazione (a destra) e bassa concentrazione (a sinistra) i lati della cellule morte viene assegnato un moltiplicatore pari a +1 e -1 , rispettivamente. Ovvero, una cellula che migra un gradiente viene moltiplicata per 1, mentre le cellule in movimento lungo il gradiente sono moltiplicati per -1. Tutti i valori moltiplicati vengono sommati e normalizzati al numero totale di cellule rilevate. Per esempio, un valore CPC di 0,40 indica che il 40% in più dei batteri totale spostato sul lato alta concentrazione rispetto al lato bassa concentrazione (cioè la chemoeffector è un attrattivo come più batteri sono stati rilevati in movimento il gradiente). </li><li> Calcolare il coefficiente di migrazione chemiotassi (CMC), che pesa la migrazione delle cellule dalla distanza percorsa, come segue: Peso contare le celle in ogni canale di un fattore che è proporzionale alla distanza che le cellule migrano. Una cellula che si muove di più lontano ad alta concentrazione di posizione (canale 64) viene assegnato un fattore di ponderazione di +1, mentre quello che si muove a metà strada nel lato maggiore concentrazione è assegnato un fattore di ponderazione di 0,5, e una cellula di passare al più lontano bassa concentrazione posizione ponderata per -1. Sommare tutti i conteggi delle cellule ponderato e normalizzare il numero di cellule per generare il CMC. </li></ol> Risultati Rappresentante 3,4: Abbiamo usato il dispositivo a microfluidi (Figura 1A) descritto qui di indagare chemiotassi di E. coli in gradienti di attrattivi (acido aspartico, autoinducer-2) e repellenti (NISO 4, indolo) 3,4. Il prototipo chemiotassi ceppo 5 E. coli RP437 GFP che esprimono è stato utilizzato, insieme a kanamicina, ucciso E. coli TG1 cellule che esprimono proteine ​​fluorescenti rossi per monitorare gli effetti del flusso. Il gradiente di concentrazione formata nel dispositivo μFlow è mostrato nella Figura 1B. L'ingresso cella era massimale, in modo che non vi era alcun flusso attraverso di essa e un gradiente stabile di 0 100 è stata fondata ng / mL di fluoresscein nel dispositivo. L'intensità dei pixel attraverso il dispositivo è stato utilizzato per determinare il profilo di concentrazione di fluorescina. I dati mostrano che i batteri incontrano una sfumatura lineare quando entrano nella camera di chemiotassi. Figura 2A e B mostra le immagini di fluorescenza di E. coli RP437 migrare in risposta a gradienti di acido aspartico (0 100 mM) e Niso 4 (0 225 mM). Le risposte osservate a questi attrattivo canonico e repellenti sono come previsto. 3A La figura mostra la distribuzione quantificati di E. coli RP437 in assenza di un gradiente di concentrazione (cioè, il gradiente nullo di acido aspartico), mentreFigure 3B e C mostrano la distribuzione in gradienti di acido aspartico e NISO 4. La specificità di queste risposte (cioè, il bias in migrazione) è evidente come E. coli RP437 Δ catrame ceppo (cioè privi del ceppo chemoreceptor Tar che viene utilizzato in E. coli a senso acido aspartico e nichel) non dimostra la parzialità nella migrazione, in presenza di un gradiente di concentrazione di acido aspartico o NISO 4. Le tendenze evidenti nei profili di distribuzione spaziale sono inoltre coerenti con i valori calcolati CPC e CMC. I valori CPC per la migrazione di E. coli RP437 in gradienti di acido aspartico o Niso 4 sono 0,33 e -0,33, rispettivamente. I corrispondenti valori CMC sono 0,13 e -0,14, rispettivamente. Al contrario, la CPC e CMC valori con la E. coli RP437 Δ ceppo di catrame in gradienti di acido aspartico o Niso 4 sono trascurabili. Inoltre, il CPC e CMC in un gradiente nullo di acido aspartico sono 0,03 e 0,02, rispettivamente, e indicano la mancanza di pregiudizi nella migrazione, in assenza di un gradiente. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig1a.jpg" alt="Figura 1a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1a"> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig1b.jpg" alt="Figura 1b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1b"> Figura 1. Dispositivo schematica e gradiente di concentrazione. (A) Rappresentazione schematica del dispositivo chemiotassi microfluidica. Il dispositivo è costituito da un gradiente di miscelazione modulo (20 x 100 x 18750 micron) e un modulo di osservazione chemiotassi (20 x 1050 x 11500 micron). Le larghezze dei due canali gradiente entrare nel dispositivo sono 500 micron e la larghezza della presa batteri è di 50 micron. L'inserto mostra un gradiente di molecola di segnalazione (grigio) e batteri migrano in risposta ad essa. Batteri vivi sono dipinti come ovali solido, mentre i batteri morti sono mostrati come ovali aperte. (B) Un gradiente di concentrazione tra 0 e 100 ng / mL fluoresceina è stata generata in dispositivo e ripreso usando la microscopia a fluorescenza. Immagini di fluorescenza sono state acquisite dopo 30 minuti e quantificato l'analisi dell'immagine. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Chemiotassi di E. coli RP437 nel dispositivo microfluidica. E. coli RP437 è stato esposto ad un gradiente di (A) 0-100 mM L-aspartato (B) 0-225 mM NISO 4 nel dispositivo e la migrazione di batteri vivi (verde) in direzione di L-aspartato o lontano da nichel ripreso ogni 2,5 sec per 30 min. Batteri morti (rosso) è servito come il controllo per gli effetti del flusso nel dispositivo. Le immagini sono state quantificate con un in-house ha sviluppato l'analisi program3. I dati riportati sono rappresentativi pseudo-colore delle immagini provenienti da tre esperimenti indipendenti. <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3a.jpg" alt="Figura 3a" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3a"> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3b.jpg" alt="Figura 3b" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3b"> <img src="/files/ftp_upload/1779/1779fig3c.jpg" alt="Figura 3c" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3c"> Figura 3: Quantificazione dei profili di migrazione a un attrattivo canonica e repellente. Distribuzione spaziale dei RP437 nel dispositivo a microfluidi in risposta a (A) uniforme 100 mM L-aspartato (cioè, senza pendenza), (B) un gradiente 0 100 mM di aspartato, e (C) un gradiente 0 225 mM di NISO 4 . La distribuzione delle cellule morte viene visualizzato come una linea continua, la distribuzione di cellule RP437 è indicato come una linea tratteggiata, e la distribuzione di RP437 eda + Δ cellule tar è mostrata come una linea tratteggiata. I dati riportati sono una media di tre esperimenti indipendenti.

<ol><li>McDonald, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prototyping+of+microfluidic+devices+in+poly%28dimethylsiloxane%29+using+solid-object+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing.</a> Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).</li>
<li>Hansen, M. C., Palmer, R. J. J., Udsen, C., White, D. C., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+GFP+fluorescence+in+cells+of+Streptococcus+gordonii+under+conditions+of+low+pH+and+low+oxygen+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assessment of GFP fluorescence in cells of Streptococcus gordonii under conditions of low pH and low oxygen concentration.</a> Microbiol. 147, 1383-1391 (2001).</li>
<li>Englert, D. L., Manson, M. D., Jayaraman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Flow-Based+Microfluidic+Device+for+Quantifying+Bacterial+Chemotaxis+in+Stable%2C+Competing+Gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A Flow-Based Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable, Competing Gradients.</a> Appl Environ Microbiol. 75, 4557-4564 (2009).</li>
<li>Englert, D. L., Jayaraman, A., Manson, M. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEnglert%2C+DL+%22Microfluidic+techniques+for+the+analysis+of+bacterial+chemotaxis%22">Microfluidic techniques for the analysis of bacterial chemotaxis</a>. , Humana press. (2009).</li>
<li>Mao, H., Cremer, P. S., &amp, M. anson <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive%2C+versatile+microfluidic+assay+for+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">A sensitive, versatile microfluidic assay for bacterial chemotaxis.</a> PNAS. 100 (9), 5449-5454 (2003).</li>
</ol>

Il coefficiente di partizione chemiotassi (CPC) e il coefficiente di migrazione chemiotassi (CMC) può essere calcolato come descritto in Mao et al 5. Se una cellula viene rilevato sul lato alta concentrazione, si è dato un valore di +1, mentre una cella individuata sul lato bassa concentrazione viene assegnato un valore di -1. I valori sono riassunti e diviso per il numero totale di cellule per generare il CPC. Il segno del CPC (positivo o negativo) dà la direzione della migrazione (verso o lontano ...

un dispositivo a microfluidi per quantificare chemiotassi batterica in gradienti di concentrazione stabile

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemiotassi permette ai batteri di approccio fonti di sostanze chimiche attractant o per evitare le fonti di sostanze repellenti. I batteri di monitorare costantemente la concentrazione di chemoeffectors specifiche confrontando la concentrazione attuale alla concentrazione rilevata pochi secondi prima. Questo confronto determina la direzione netto di movimento. Anche se diversi, i gradienti concorrenti spesso coesistono in natura, gli approcci convenzionali per lo studio chemiotassi batterica non sono ottimali per quantificare la migrazione in risposta a gradienti di concentrazione di attrattivi e repellenti. Qui, descriviamo lo sviluppo di un modello di chemiotassi microfluidica per presentare i gradienti di concentrazione precisa e stabile di chemoeffectors a batteri e quantitativamente indagando la loro risposta al gradiente applicato. Il dispositivo è versatile in quanto gradienti di concentrazione di qualsiasi concentrazione desiderata in assoluto e la forza del gradiente può essere facilmente generato da miscelazione diffusivo. Il dispositivo è dimostrata utilizzando la risposta del<em&gt; Escherichia coli</em&gt; RP437 a gradienti di aminoacidi e ioni nichel.

Questo protocollo descrive lo sviluppo di un dispositivo a microfluidi per indagare chemiotassi batterica in gradienti di concentrazione stabile di chemoeffectors.

Un dispositivo a microfluidi per quantificare chemiotassi batterica in gradienti di concentrazione stabile

La chemiotassi consente ai batteri di avvicinarsi a fonti di sostanze chimiche attrattive o di evitare fonti di sostanze chimiche repellenti. I batteri monitorano costantemente il...

E Coli RP 4 37 vengono introdotti in un dispositivo di chemotassi in cui sono esposti a una concentrazione spaziale definita. I gradienti a cui le cellule sono esposte entrando nella camera incontrano il punto medio del gradiente di concentrazione. A seconda che il segnale venga percepito come un attrattante o un repellente, i batteri si muovono rapidamente verso l'alto o verso il basso lungo il gradiente di concentrazione.Ciao, sono Derek Engler del Laboratorio di Biotecnologia Molecolare dei Sistemi e del Dipartimento di Ingegneria Chimica della Texas A&M University. Oggi vi mostreremo un procedimento per lo studio della chemotassi batterica in un dispositivo microfluidico. Utilizziamo questo procedimento nei nostri laboratori per studiare come l'e coli RP 4 37 migra in un gradiente di concentrazione di solfato di nichel.Iniziamo. Lo strato fluidico e lo strato di controllo sono realizzati mediante stampaggio per replica di Polymethyl SUBOXANE o PDMS a partire dal master SU eight. Per iniziare questa procedura, mescolare il prepolimero di PDMS e l'agente di reticolazione in un rapporto ponderale di 10 a 1.Depurare la miscela in un essiccatore per un'ora, fino a quando non vengono rimossi i bollicine d'aria. Quando la miscela di PDMS è pronta, posizionare il master SU eight in una piastra di Petri e versare con attenzione la miscela sopra il master SU eight fino allo spessore desiderato. Riscaldare la piastra di Petri contenente la miscela di PDMS e il master stampo SU eight a 80 gradi Celsius per due ore per indurire il PDMS.Dopo due ore, rimuovere dalla piastra riscaldata il PDMS polimerizzato contenente la replica negativa dell'SSU eight master e staccare con cura il mold in PDMS dall'SU eight master. Per realizzare la struttura desiderata nel mold in PDMS, utilizzare un ago senza punta calibro 20 per praticare quattro fori nel mold in PDMS, destinati al collegamento dei tubicini al generatore di gradiente, all'ingresso delle cellule e all'uscita delle cellule. A questo punto siamo pronti per assemblare il dispositivo in PDMS e procedere alla sua saldatura.Per prima cosa, pulire un vetrino in vetro con isopropanolo e asciugarlo con un flusso d'aria. Successivamente, esporre il calco in PDMS e il vetrino in vetro a un plasma di ossigeno in un etcher al plasma per circa 30 secondi. Mettere a contatto il calco in PDMS con il vetrino in vetro. Riscaldare il vetrino e il calco in PDMS a contatto a 65 gradi Celsius su una piastra riscaldante per 15 minuti.Per assemblare il dispositivo in PDMS, utilizzare un rasoio per tagliare il tubo con un angolo di 45 gradi alla lunghezza corretta necessaria in base al setup del microscopio. Quindi, utilizzando pinze, inserire un'estremità del tubo in uno dei quattro fori praticati nel dispositivo.Inserire un ago ottuso da 30 gauge nell'altra estremità del tubo. Ripetere l'inserimento del tubo e del connettore dell'ago in tutti i fori rimanenti. Caricare un millilitro di chemiotassanti, tampone o CB in una siringa da tre millilitri.Avendo cura di rimuovere l'aria dalla siringa. Aggiungere CB all'attacco del connettore dell'ago utilizzando una pipetta e battere leggermente sull'attacco per eliminare eventuali bolle d'aria. Espellere una piccola quantità di CB dalla punta della siringa da tre millilitri e collegare la siringa al connettore dell'ago senza intrappolare aria.Spingere il CB attraverso il dispositivo fino a quando tutti i connettori rimanenti dell'ago sono riempiti di cb. Questo dovrebbe rimuovere la maggior parte delle bolle d'aria. Successivamente, riempire due siringhe da 500 microlitri con CB contenente le concentrazioni appropriate dell'effettore chimico in fase di test.Eliminare la formazione di bolle d'aria espellendo una piccola goccia del contenuto della siringa e toccando le gocce di liquido nell'attacco dell'ago, quindi attaccare la siringa per preparare batteri altamente mobili. Per l'esperimento di chemotassi, coltivare una coltura notturna di E. coli RP437 con espressione di GFP, in brodo tripton o TB a 32 gradi Celsius con agitazione; il giorno successivo, utilizzare la coltura notturna per inoculare una coltura di 20 millilitri di TB in un matraccio Erlenmeyer da 250 millilitri fino a raggiungere una densità ottica a 600 nanometri di circa 0,05.Coltivare la coltura a 32 gradi Celsius con agitazione quando le cellule presentano un OD 600 di circa 0,35-0,45. Raccoglierle mediante centrifugazione a bassa velocità e risospendere le cellule a un OD 600 di circa 0,35 in CB contenente l'effettore chimico alla concentrazione prevista nella parte centrale del canale. Infine, aggiungere cellule morte marcate con RFP a un OD 600 di circa 0,35 alle cellule vive che esprimono GFP.Queste cellule morte fungeranno da controllo interno per assicurare che qualsiasi migrazione non sia dovuta a effetti di flusso. La sospensione cellulare è ora pronta per essere caricata nel dispositivo microfluidico per l'esperimento di chemotassi. Per iniziare l'esperimento di chemotassi, rimuovere parte del CB dall'ago di caricamento delle cellule e ricaricare con la sospensione cellulare.Riempire delicatamente una siringa da 50 microlitri con le cellule risospese. Eseguire questa operazione lentamente, poiché le flagelle possono rompersi, riducendo così la motilità. Collegare la siringa da 50 microlitri al connettore dell'ago di ingresso come mostrato in precedenza, espellendo una piccola goccia del contenuto della siringa e toccando con essa il liquido presente nel connettore dell'ago; quindi fissare la siringa e posizionare il dispositivo sul palchetto di un microscopio a fluorescenza dotato di una telecamera ad alta velocità per l'acquisizione delle immagini.Posizionare entrambe le siringhe di ingresso nella pompa per siringhe e avviare il flusso in modo da formare il gradiente e far passare le cellule attraverso il tubo. Una volta che le cellule entrano nella camera di chemotassi, attendere circa 20 minuti affinché il sistema si stabilizzi. Prima dell'acquisizione, raccogliere immagini in fluorescenza verdi (vitali) e rosse (morte) in diverse posizioni lungo la lunghezza della camera.Normalmente acquisiamo 100 immagini in ogni posizione a intervalli di tre secondi. Le immagini di fluorescenza acquisite possono essere analizzate utilizzando qualsiasi programma di analisi delle immagini disponibile in commercio, come ImageJ o Metamorph, oppure mediante semplici codici scritti in MATLAB. In questo esempio, utilizzeremo codici MATLAB.Iniziare rimuovendo i pixel di sfondo dall'immagine mediante questa soglia di intensità dei pixel e eliminare tutti i pixel con intensità inferiore alla soglia. Ciò riduce al minimo il rumore. Nell'analisi, utilizzare la posizione delle cellule morte per determinare il centro dell'immagine.Questa è la posizione in cui le cellule sono entrate nella camera di chemotassi e in cui verrebbero rilevate in assenza di qualsiasi migrazione. Successivamente, individuare le cellule vive nell'immagine, suddividere l'immagine in canali e determinare il numero di cellule vive in ciascun canale. Nel nostro lavoro precedente, la camera di chemotassi larga da 10 a 50 micrometri è stata suddivisa in 64 canali, ciascuno largo circa 16 micrometri.Dopo aver ripetuto questi passaggi per tutte le immagini, alcuni dei conteggi totali di cellule per ogni canale su tutte le immagini. Ciò fornisce il numero totale di cellule rilevate in ogni canale durante l'intera durata dell'esperimento. Calcolare il chemotassi, coefficiente di partizione o CPC, che rappresenta la direzione della migrazione.Eseguendo i seguenti passaggi, assegnare un moltiplicatore di più uno e meno uno a ciascuna cellula situata rispettivamente nei lati ad alta concentrazione o destro e a bassa concentrazione o sinistro rispetto alle cellule morte. Sommare tutti i valori moltiplicati e normalizzare rispetto al numero totale di cellule rilevate. Calcolare il coefficiente di chemotassi, coefficiente di migrazione o CMC, che pesa la migrazione delle cellule in base alla distanza percorsa.A una cellula che si sposta nel canale della posizione con la concentrazione più alta, ovvero il canale 64, viene assegnato un fattore di ponderazione pari a più uno, mentre a una cellula che si sposta a metà strada verso il lato ad alta concentrazione viene assegnato un fattore di ponderazione pari a più 0,5. Una cellula che si sposta nella posizione con la concentrazione più bassa viene ponderata con meno uno. La somma di tutti i conteggi di cellule ponderati viene normalizzata rispetto al numero totale di cellule per generare il CMC.Questo grafico mostra un gradiente di concentrazione lineare o profilo formato nel dispositivo microfluidico utilizzando isotiocianato di fluoresceina. La formazione di un gradiente di concentrazione è dimostrata in questa figura mediante coloranti blu e gialli. L'ingresso per le cellule era CA in modo che non ci fosse flusso attraverso di esso, e si può osservare che si forma una gamma di colori compresi tra il blu e il giallo.Di seguito sono mostrate immagini in pseudocolore di un esperimento rappresentativo di chemiotassi in cui E. coli RP437 è stato esposto a un gradiente compreso tra zero e 100 micromolar di L-aspartato o tra zero e 225 micromolar di solfato di nichel nel dispositivo. La migrazione dei batteri verdi vivi verso l’aspartato o lontano dal nichel è stata ripresa ogni 2,5 secondi per 30 minuti. I batteri morti, mostrati in rosso, sono serviti come controllo per gli effetti del flusso nel dispositivo.La distribuzione spaziale di RP 4 37 nel dispositivo microfluidico in assenza di un gradiente è mostrata in questo grafico, in confronto alla sua risposta a un gradiente di aspartato e a un gradiente di solfato di nichel. Abbiamo appena illustrato come monitorare le chemiotassi di e coli RP 4 37 in un gradiente di solfato di nichel. Durante questa procedura, è importante ricordare di minimizzare il vorticoso mescolamento delle cellule, in modo da poter utilizzare una sottopopolazione ad alta motilità.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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La realizzazione di canali di microfluidica e la loro attuazione in esperimenti per studiare il comportamento chemiotattica foraggiamento dei microbi marini all'interno di un paesaggio marino irregolare dei nutrienti e il comportamento di nuoto di batteri all'interno del flusso di taglio sono descritti.

Risposta chemiotattica di microrganismi marini a livelli di nutrienti Micro-Scale

Gli studi di chemiotassi batterica Utilizzando Microfluidica - Intervista

Abbiamo descritto un protocollo per la microfabbricazione del gradiente apparecchio che può generare microfluidi che possono generare gradienti spaziali e temporali ben definite microambiente. In questo approccio, il gradiente di generazione dispositivo a microfluidi può essere utilizzato per studiare la migrazione delle cellule diretto, l'embriogenesi, la guarigione delle ferite, e le metastasi del cancro.

Un gradiente di generazione del dispositivo Microfluidic di Biologia Cellulare

Fonte: Scheidweiler, D., et al. Combinare dispositivi fluidici con microscopia e citometria di flusso per studiare il trasporto microbico in mezzi porosi su scale spaziali. J. Vis. Esp. (2020).Questo video dimostra l'uso di un dispositivo microfluidico per quantificare la motilità batterica attraverso una matrice porosa composta da pilastri disposti casualmente. Batteri marcati con fluorescenze vengono introdotti nel dispositivo, fotografiati tramite microscopia mentre si muovono attraverso la...

Valutazione della motilità batterica tramite un dispositivo microfluidico

Questo video mostra il test della chemiotassi dei neutrofili utilizzando un metodo all-on-chip. Il metodo consente l'isolamento diretto dei neutrofili dall'intero sangue mediante selezione immunomagnetica negativa seguita da un test di chemiotassi su un chip microfluidico.

Un metodo basato su chip microfluidico per l'analisi rapida della chemiotassi dei neutrofili utilizzando sangue intero

Dettagli Questo protocollo un saggio progettato per misurare la chemiotassi dei neutrofili umani da una gocciolina di sangue intero con robusto riproducibilità. Questo approccio elude la necessità di una separazione dei neutrofili e richiede solo pochi minuti di dosaggio tempo di preparazione. Il chip microfluidica consente la misura ripetuta di chemiotassi dei neutrofili nel tempo nei neonati o piccoli mammiferi, dove il volume del campione è limitata.

Piattaforma microfluidica per la misurazione dei neutrofili Chemiotassi dal Lordo Sangue intero

Questo articolo fornisce il metodo dettagliato per eseguire un rapido dosaggio della chemotaxis neutrofile integrando l'isolamento neutrofilo a circuito integrato dal sangue intero e il test di chemotaxis su un singolo chip microfluidico.

Un metodo integrato per l&#39;analisi della chimotassi rapida dei neutrofili direttamente da una goccia di sangue

La migrazione collettiva delle cellule nello sviluppo, nella guarigione delle ferite e nella metastasi del cancro è spesso guidata dai gradienti dei fattori di crescita o delle molecole di segnalazione. Descritto qui è un sistema sperimentale che combina la microscopia a trazione con un sistema microfluidico e una dimostrazione di come quantificare la meccanica della migrazione collettiva in gradiente biochimico.

Microscopia di trazione integrata con microfluidica per la migrazione collettiva chemiotattica

Viene presentato un protocollo per la generazione di paesaggi chimici dinamici mediante fotolisi all'interno di configurazioni microfluidiche e millifluidiche. Questa metodologia è adatta per studiare diversi processi biologici, tra cui il comportamento motile, l'assorbimento di nutrienti o l'adattamento alle sostanze chimiche dei microrganismi, sia a livello di singola cellula che di popolazione.

Generazione di paesaggi chimici dinamici e controllati per studiare il comportamento microbico

Presentato qui è il protocollo per un saggio chemiotaxis in situ, un dispositivo microfluidico recentemente sviluppato che consente studi di comportamento microbico direttamente nell'ambiente.

In Situ Chemotaxis Assay per esaminare il comportamento microbico negli ecosistemi acquatici

Qui, descriviamo l'uso di piastre a gradiente induttore per valutare la motilità dello sciame batterico ottenendo contemporaneamente risposte di concentrazione multiple.

Quantificazione della motilità dello sciame di superficie batterica su piastre gradienti induttori

Impara a quantificare la chemiotassi batterica in gradienti stabili utilizzando un dispositivo microfluidico con E. coli RP 4 37. Questo metodo consente di studiare i meccanismi di navigazione cellulare in biotecnologia.

Un dispositivo a microfluidi per quantificare chemiotassi batterica in gradienti di concentrazione stabile

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