Un dispositivo a microfluidi per quantificare chemiotassi batterica in gradienti di concentrazione stabile

Gli E Coli RP 4 37 vengono introdotti in un dispositivo di chemiotassi dove sono esposti a una concentrazione spaziale definita. Le celle dei gradienti che entrano nella camera incontrano il punto medio del gradiente di concentrazione. A seconda che il segnale sia percepito come attrattivo o repellente, i batteri si spostano rapidamente verso l'alto o verso il basso nel gradiente di concentrazione.

Ciao, sono Derek Engler del Laboratorio di Biotecnologie dei Sistemi Molecolari e del Dipartimento di Ingegneria Chimica dell'Università del Texas. Oggi vi mostreremo una procedura che studia le tasse batteriche della chemio in un dispositivo microfluidico. Utilizziamo questa procedura nei nostri laboratori per studiare come l'e coli RP 4 37 migra nel gradiente di concentrazione del solfato di nichel.

Quindi iniziamo. Lo strato fluidico e lo strato di controllo sono realizzati mediante stampaggio replica di polimetilSUBOXANO o PDMS dal master SU otto. Per iniziare questa procedura, mescolare il prepolimero PDMS e il reticolante con un rapporto in peso di 10 a uno.

Degassare la miscela in un essiccante per un'ora fino a quando le bolle d'aria non vengono rimosse. Quando la miscela PDMS è pronta, posizionare l'otto master SU in una capsula di Petri e versare con cura il composto sopra l'otto master SU fino allo spessore desiderato Heat. La capsula di Petri contenente il PDMS e lo stampo master SU eight a 80 gradi Celsius per due ore per polimerizzare il PDMS.

Dopo due ore, rimuovere l'otto master SSU coperto PDMS polimerizzato dalla piastra calda e staccare lo stampo PDMS dall'otto master SU. La struttura desiderata sarà incorporata nello stampo PDMS utilizzando un punzone ad ago con estremità smussata calibro 20 quattro fori nello stampo PDMS per il tubo al generatore di gradiente, all'ingresso della cella e all'uscita della cella. Ora siamo pronti per assemblare il dispositivo PDMS per collegare il dispositivo PDMS.

Per prima cosa, pulire un vetrino da microscopio in vetro con isopropanolo e provarlo con un Airstream. Quindi, esporre lo stampo PDMS e il vetrino al plasma di ossigeno in un incisore al plasma per circa 30 secondi. Portare lo stampo PDMS a contatto con il vetrino Riscaldare il vetrino a contatto e lo stampo PDMS a 65 gradi Celsius su una piastra calda per 15 minuti.

Per assemblare il dispositivo PDMS, utilizzare una lama di rasoio per tagliare i tubi con un angolo di 45 gradi alla lunghezza corretta richiesta a seconda della configurazione del microscopio. Quindi usando il forcipe. Inserire un'estremità del tubo in uno dei quattro fori praticati nel dispositivo.

Inserire un mozzo dell'ago smussato calibro 30 nell'altra estremità del tubo. Ripetere l'inserimento del tubo e del mozzo dell'ago per tutti i fori rimanenti. Caricare un millilitro di chemio, tampone o CB in una siringa da tre millilitri.

Avendo cura di rimuovere l'aria dalla siringa. Aggiungere il CB al mozzo dell'ago di uscita utilizzando una pipetta e picchiettare il mozzo dell'ago per rimuovere eventuali bolle d'aria. Spingere un po' di CB fuori dalla punta della siringa da tre millilitri e collegare la siringa al mozzo dell'ago senza intrappolare aria.

Spingere il CB attraverso il dispositivo fino a quando tutti i mozzi dell'ago rimanenti non sono riempiti di cb. Questo dovrebbe rimuovere la maggior parte delle bolle d'aria. Successivamente, riempire due siringhe da 500 microlitri con CB contenente le concentrazioni appropriate dell'effettore chemioterapico da testare.

Eliminare la formazione di bolle d'aria spingendo fuori una piccola goccia del contenuto della siringa e toccando le gocce di liquido nel mozzo dell'ago e collegando la siringa per preparare batteri altamente mobili. Per l'esperimento di chemiotassi, coltivare una coltura notturna di e coli RP 4 37 con un'espressione di GFP, plasmide in brodo di triptoni o TB a 32 gradi Celsius con agitazione il giorno successivo. Utilizzare la coltura notturna per inoculare una coltura di TB da 20 millilitri in una fiaschetta di Erlenmeyer da 250 millilitri a una densità ottica a 600 nanometri di circa 0,05.

Coltivare la coltura a 32 gradi Celsius con agitazione quando le cellule sono a un OD 600 di circa 0,35-0,45. Raccoglierli mediante centrifugazione a bassa velocità resus sospendere le cellule a un OD 600 di circa 0,35 in CB contenente il chemioeffettore alla concentrazione prevista al centro del canale. Infine, aggiungere le cellule morte marcate con RFP al n. D 600 di circa 0,35 alle cellule vive che esprimono GFP.

Queste cellule morte saranno un controllo interno per garantire che qualsiasi migrazione non sia dovuta a effetti di flusso. La sospensione cellulare è ora pronta per essere caricata nel dispositivo microfluidico per l'esperimento di chemiotassi. Per iniziare l'esperimento di chemiotassi, rimuovere parte del CB dalla ricarica del mozzo dell'ago di ingresso della cellula con la sospensione cellulare.

Riempire delicatamente una siringa da 50 microlitri con le cellule risospese. Fallo lentamente poiché i flagelli possono essere tosati, il che ridurrà la motilità. Collegare la siringa da 50 microlitri al mozzo dell'ago di ingresso come mostrato in precedenza spingendo fuori una piccola goccia del contenuto della siringa e toccando la goccia con il liquido nel mozzo dell'ago e collegando la siringa, posizionare il dispositivo sul tavolino di un microscopio a fluorescenza dotato di una fotocamera ad alta velocità per l'acquisizione delle immagini.

Posizionare entrambe le siringhe di ingresso nella pompa a siringa e avviare il flusso in modo tale che si formi il gradiente e le cellule fluiscano attraverso il tubo. Una volta che le cellule entrano nella camera delle chemio-tasse, attendere circa 20 minuti affinché il sistema si stabilizzi. Prima dell'imaging, raccogli immagini di fluorescenza verde vivo e rosso morto in diverse posizioni lungo la lunghezza della camera.

In genere raccogliamo 100 immagini in ogni posizione a intervalli di tre secondi. Le immagini a fluorescenza acquisite possono essere analizzate utilizzando qualsiasi programma di analisi delle immagini disponibile in commercio come Image J o metamorph, oppure utilizzando semplici codici scritti in matlab. In questo esempio, utilizzeremo i codici MATLAB.

Iniziate rimuovendo i pixel di sfondo nell'immagine attraverso questa soglia impostata per l'intensità dei pixel e rimuovete tutti i pixel con intensità inferiore alla soglia. In questo modo si riduce al minimo il rumore. Nell'analisi, utilizzare la posizione delle celle morte per determinare il centro dell'immagine.

Questo rappresenta la posizione in cui le cellule sono entrate nella camera della chemiotassi e dove sarebbero state rilevate in assenza di qualsiasi migrazione. Quindi, individua le celle vive nell'immagine, dividi l'immagine in canali e determina il numero di celle vive in ciascun canale. Nel nostro lavoro precedente, la camera per chemiotasse larga 10 50 micrometri era divisa in 64 canali larghi ciascuno circa 16 micrometri.

Dopo aver ripetuto questi passaggi per tutte le immagini, una parte del conteggio totale delle celle per ciascun canale in tutte le immagini. Questo fornisce la conta totale delle cellule rilevate in ciascun canale per tutta la durata dell'esperimento. Calcola le tasse sulla chemio, il coefficiente di ripartizione o CPC, che rappresenta la direzione della migrazione.

Eseguendo i seguenti passaggi, assegnare un moltiplicatore di più uno e meno uno a ciascuna cella situata rispettivamente nei lati alta concentrazione o destra e bassa concentrazione o sinistra delle cellule morte. Somma tutti i valori moltiplicati e normalizza al numero totale di celle rilevate. Calcola le tasse sulla chemio, il coefficiente di migrazione o CMC, che pesa la migrazione delle cellule in base alla distanza percorsa.

A una cella che si sposta verso il canale 64 della posizione più alta di concentrazione viene assegnato un fattore di ponderazione di più uno, mentre a una che si sposta a metà del lato di concentrazione più alto viene assegnato un fattore di peso di più 0,5 e una cella. Lo spostamento alla posizione di bassa concentrazione più lontana è ponderato di meno uno. Alcuni di tutti i conteggi cellulari pesati sono stati normalizzati al numero di cellule per generare la CMC.

Questo grafico mostra un gradiente di concentrazione lineare o un profilo formato nel dispositivo microfluidico utilizzando isotiocianato di fluoresceina. La formazione di un gradiente di concentrazione è dimostrata in questa figura utilizzando coloranti di colore blu e giallo. L'ingresso della cella era CA in modo che non ci fosse flusso attraverso di esso, e si può vedere che si forma una gamma di colori tra il blu e il giallo.

Ecco le immagini a pseudocolori di un esperimento rappresentativo di chemiotassi in cui l'e coli RP 4 37 è stato esposto a un gradiente da zero a 100 micromolari di L aspartato o da zero a 225 micromolari di solfato di nichel nel dispositivo. La migrazione dei batteri verdi vivi verso l'aspartato o lontano dal nichel è stata ripresa ogni 2,5 secondi per 30 minuti. I batteri morti mostrati in rosso servivano come controllo per gli effetti del flusso nel dispositivo.

La distribuzione spaziale di RP 4 37 nel dispositivo microfluidico in assenza di un gradiente è mostrata in questo grafico rispetto alla sua risposta a un gradiente di aspartato e a un gradiente di solfato di nichel. Vi abbiamo appena mostrato come monitorare le tasse chemioterapiche di e coli RP 4 37 in un gradiente di solfato di nichel. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di ridurre al minimo il vortice delle cellule in modo da poter utilizzare una sottopopolazione ad alta motilità.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.