L'impianto di Ferumoxides etichetta cellule staminali mesenchimali in difetti della cartilagine

Lo scopo della presentazione è dimostrare un metodo semplice e riproducibile per la produzione di MASI con HME etichettati mediante para-ossidi per il tracciamento della terapia basata su cellule staminali. Per l'etichettatura mediante imaging a risonanza magnetica, il mezzo viene preparato, aggiunto a una fiasca T75 e incubato per quattro ore. Successivamente, le cellule vengono tripsinizzate e lavate.

Tre volte dopo il lavaggio, le cellule vengono risospese e al tubo viene aggiunto il gel di agarosio. Ora le cellule sono pronte per l'innesto in difetti cartilaginei. Ciao, sono Alex.

Ho bisogno di ripetere l'esperimento dal laboratorio di High Delta Blink, il Contrast Media Laboratory del Dipartimento di Radiologia dell'Università della California di San Francisco. Sono Lydia Men. Anch'io del Contrast Media Lab.

Oggi vi mostreremo un procedimento per etichettare cellule staminali ematopoietiche con nanoparticelle di ossido di ferro, generando costrutti cellulari aggregati, e per impiantare questi costrutti in difetti della cartilagine. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per tracciare in modo non invasivo le cellule staminali mesenchimali mediante risonanza magnetica. Cominciamo dunque.

Per iniziare, le cellule vengono coltivate fino a raggiungere una confluenza dell'80% almeno 18 ore prima dell'etichettatura. Durante questo periodo, preparare il mezzo di etichettatura in modo che sia pronto per l'uso quando le cellule avranno raggiunto la confluenza. Per fare ciò, aggiungere end durum al campione a una dose di 100 microgrammi di ferro per millilitro di mezzo privo di siero.

Dopo che le cellule sono cresciute fino alla confluenza, aspirare il terreno di coltura e lavare le cellule con PBS o terreno privo di siero. Successivamente, aspirare la soluzione di lavaggio e aggiungere il terreno di marcatura preparato. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per quattro ore.

Dopo l'incubazione di quattro ore, aspirare il mezzo di marcatura. Lavare le cellule con PBS e quindi con tripsina ghiacciata. Una volta trypsinizzato, lavare le cellule tre volte con PBS e centrifugarle a 400 RCF per cinque minuti.

Dopo questo passaggio di lavaggio, risospendere le cellule, sospenderle, contarle, valutarne la vitalità e infine utilizzarle secondo le necessità per l'esperimento. Vediamo ora come creare impianti di cellule staminali associati alla matrice. Iniziare preparando una soluzione di agarosa fresca.

Una volta che l'agros si è raffreddato a 42 gradi Celsius, contare le cellule e centrifugarle in una provetta da 1,5 millilitri. Dopo la centrifugazione, eliminare il soprannatante e sospenderle nel mezzo di Eagle modificato di Dobé per ottenere una concentrazione di 30 × 10⁶ cellule per ml. Prima di mescolare le cellule con l'agros caldo, preriscaldare la punta della pipetta aspirando e dispensando su e giù PBS sterile e caldo. Questo impedirà all'agros di solidificare all'interno della punta.

Quindi aspirare lo stesso volume di aros del mezzo e mescolarlo accuratamente con la sospensione cellulare, prestando attenzione a non creare bolle. Mantenere il tubo einor all'interno di un bagno termico preriscaldato durante il mescolamento, in modo che l'agros non si raffreddi a sufficienza da solidificare quando la sospensione è omogenea. Le cellule vengono impiantate nel difetto e sono ora pronte per l'imaging mediante risonanza magnetica.

Ora vi mostreremo alcuni risultati rappresentativi, prima della nostra tecnica di marcatura e poi della nostra tecnica di impianto. Dopo la marcatura, le cellule nei flaconi conservano lo stesso aspetto delle cellule non marcate. Come previsto, la vitalità delle cellule marcate non cambia, come dimostrato dal test della caspasi 3.

La combinazione di cellule marcate con agros porta a una perdita di segnale negli impianti, come osservato nelle immagini di risonanza magnetica pesate in T2; le cellule non marcate non mostrano alcun segnale. Sezioni ridotte di costrutti cellulari con agros risultano positive alla colorazione con blu di Prussia. Confermare l'accumulo intracellulare di ferro.

Abbiamo appena mostrato come etichettare le cellule staminali mechy con la nanoparticella di ossido di ferro end interim. Come creare costrutti agros con le cellule marcate e come impiantarle in difetti della cartilagine. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di preriscaldare la punta della pipetta prima di aggiungere aros caldo alla sospensione cellulare in mezzo.

È inoltre fondamentale che Mr.Imaging eviti la formazione di bolle. È tutto. Grazie per averci seguito e buona fortuna con i vostri esperimenti.