Name: Lo sperma raccolto e linseminazione artificiale di topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Impara l'inseminazione artificiale nei topi per la biologia riproduttiva e la ricerca transgenica. Questo metodo consente di controllare con precisione i tempi di fecondazione utilizzando sperma fresco o congelato.

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Vorrei ringraziare Mike Dewey dal Centro Peromyscus patrimonio genetico per le sue informazioni preziose, la pazienza e la conoscenza sulla riproduzione dei roditori.

Inseminazione artificiale L&#39;inseminazione artificiale è usato al posto di accoppiamenti naturali per aumentare le probabilità che tutte le femmine hanno avrà una gravidanza. 2 maschi è stato utilizzato per ogni 1 femmine superovulated o una femmina noti per essere in estro. L&#39;epididimo caudae da maturare topi maschi sono stati collocati in una sospensione di latte 9% e affettato aperto con 18 aghi di calibro. Lo sperma è stato permesso di nuotare liberamente per qualche minuto e poi il epididimi sono state prese dalla miscela. La sospensione è stata valutata con un microscopio per la confluenza e di spermatozoi mobili. Un brusco AWG 22 ago 1 ½ pollice di lunghezza è stato utilizzato per amministrare lo sperma. A 120 piegare ° era collocato circa 3 / 4 ° verso il basso l&#39;ago. L&#39;ago è stato inserito nella vagina fino alla curva e 0,025 - 0.05mls iniettato. Se un assistente è utilizzato per contenere la femmina nella posizione appropriata, l&#39;uso di anestetici non è necessario. Preparazione <ol><li> Utilizzare 4 maschi per 6 femmine </li><li> Euthanize maschi al vivaio </li><li> Preparare circa 5 ml di latte 9% di latte in polvere </li><li> Mettere 1,5 ml in piccole piastre di Petri </li><li> Tagliare dell&#39;Epididymus e vasi deferenti </li><li> Metti in 1,5 ml del 9% latte </li><li> Usando due aghi calibro 18, e con lunghi movimenti di taglio con aghi, fetta aperto dell&#39;Epididymus e deferenti per rilasciare gli spermatozoi </li><li> Estrarre rimasto tessuti e verificare la presenza di spermatozoi al microscopio </li></ol> Iniezione <ol><li> Utilizzare l&#39;ago smussato a 120 ° angolo </li><li> Tenete il mouse in mano e iniettare miscela. Se a disagio con una persona in possesso e l&#39;iniezione, due persone possono essere utilizzati. Nessun anestetico dovrebbe essere utilizzato, come si sa su come questo potrebbe influenzare la procedura. </li><li> Utilizzare 0,05 ml di sperma / latte mix per femmina </li></ol> Destinatario femmine <ol><li> Fare striscio vaginale sulle femmine destinatario (in questo periodo le femmine destinatario deve essere in proestro / estro) </li><li> Femmine che non hanno raggiunto estro da 5 ° giorno non dovrebbe probabilmente utilizzato </li></ol>

<table><tbody><tr><td>Piastra di Petri</td><td>Strumento</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-30</td><td></td></tr><tr><td>Ago 18 G</td><td>Strumento</td><td>BD Biosciences</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>Latte in polvere</td><td>Reagente</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 1 mL</td><td>Strumento</td><td>National Scientific Company</td><td>S7510-1</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Strumento</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5060</td><td></td></tr><tr><td>Forbici</td><td>Strumento</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tampone al fosfato di Dulbecco&amp;rsquo;s</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14200-075</td><td></td></tr><tr><td>Ago smussato 22 G</td><td>Strumento</td><td>Give to me</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

lo sperma raccolto e l&#39;inseminazione artificiale di topi

Harvesting Sperm and Artificial Insemination of Mice

Roditori del genere Peromyscus (topi cervi) sono i mammiferi autoctoni più diffusi del Nord America. Specie Peromyscus sono utilizzati in una vasta gamma di ricerca tra cui tossicologia, epidemiologia, ecologia, comportamento, e gli studi genetici. Qui essi forniscono un utile modello per le dimostrazioni di inseminazione artificiale. Metodi simili a quelli visualizzati qui sono già state utilizzate in diversi studi topo cervo, ancora nessun protocollo dettagliato è stato pubblicato. Qui mostriamo il metodo di base della fecondazione artificiale. Questo metodo comporta l&#39;estrazione dei testicoli dal roditore, poi isolare gli spermatozoi dall&#39;epididimo e vasi deferenti. Lo sperma maturo, ora in una miscela di latte, sono collocati nel tratto riproduttivo della femmina al momento della ovulazione. Fecondazione viene considerato come 0 giorni per tempi di sviluppo embrionale. Gli embrioni possono poi essere recuperate al momento desiderato-point e manipolata. L&#39;inseminazione artificiale può essere utilizzato in una varietà di specie di roditori in cui tempistica esatta embrione è fondamentale o difficile da ottenere. Questa tecnica è di vitale importanza per le specie o ceppi (tra cui la maggior Peromyscus) che non possono accoppiarsi immediatamente e / o dove l&#39;accoppiamento è difficile da valutare. Inoltre, l&#39;inseminazione artificiale provvede esatta tempistica per lo sviluppo embrionale sia in corso la mappatura dello sviluppo e / o di lavoro transgenici. Riduzione del numero di animali possono essere utilizzati in quanto la fecondazione è garantita. Questo metodo è stato fondamentale per promuovere il sistema Peromyscus, e si spera beneficiare gli altri.

Questo protocollo vengono utilizzati dei metodi per l&#39;estrazione degli spermatozoi dai testicoli dei maschi e poi inseminazione topi femmina. Questa procedura è utile quando il tempo preciso è necessaria in studi sullo sviluppo e il lavoro transgenici.

Lo sperma raccolto e l&#39;inseminazione artificiale di topi

I roditori del genere Peromyscus (topi cervo) sono i mammiferi autoctoni più diffusi del Nord America. Le specie di Peromyscus sono utilizzate in un'ampia gamma di ricerche...

Il mio nome è Amanda Dli del laboratorio del Dottor Paul Verana presso l'Università della California di Irvine. Oggi dimostrerò la procedura di inseminazione artificiale. Questa consiste nell'estrarre lo sperma dal maschio e quindi introdurre tale sperma in una femmina in ovulazione.Il motivo per cui potresti voler fare questo è che il maschio e la femmina potrebbero non accoppiarsi nel momento in cui ne hai bisogno oppure potrebbero non accoppiarsi affatto. Ancora una volta, questo metodo può essere utilizzato anche con sperma congelato se una linea di topi è particolarmente importante. Questa procedura è molto importante da vedere dimostrata, poiché molti manuali e riviste scientifiche non mostrano il corretto procedimento per la manipolazione del topo.Il topo può essere manipolato e iniettato da una sola persona senza l'uso di alcun anestetico sulla femmina. Ciò implica che la femmina non subisca alcun danno e garantisce che la fecondazione possa avvenire nel modo migliore possibile. Gli strumenti da dissezione che utilizzeremo sono due paia di pinzette appuntite e un paio di forbici appuntite.Questi verranno utilizzati per isolare il deferente lungo l'intero decorso nei testicoli e nel grasso addominale. Una volta completato ciò, utilizzeremo la pinzetta per isolare l'epididimo. Il latte al 9% viene utilizzato per trasferire gli spermatozoi nella femmina.È composto da un XPBS in latte in polvere reperibile nel negozio di alimentari locale. Questo viene versato in una piccola capsula di Petri in modo isolato, in modo che gli spermatozoi si trovino in un'area localizzata. Aghi da 18 gauge vengono utilizzati per aprire l'epididimo in modo che gli spermatozoi possano nuotare nella soluzione di latte al 9% presente nella capsula di Petri.Quello ottenuto e le co-fluenze riscontrate nello sperma in una soluzione di latte al 9% vengono aspirate mediante un ago da 22 gauge, di tipo ottuso, con angolo di 120 gradi. Questo viene collegato a una siringa da un millilitro e successivamente vengono iniettati 0,025 millilitri nella femmina di topo arachide, o roditore Polyus is. Para cus sono effettivamente il mammifero endogeno nordamericano Polyus is più abbondante, presente nella regione sudorientale della Florida, negli Stati Uniti.Come si può notare, ha gli occhi leggermente più grandi rispetto a mu musculus. Inoltre, presenta un mantello più chiaro, il che favorisce l'adattamento alle dune di sabbia della regione della Florida.Quello che far&ograve; &egrave; isolare l'intera regione testicolare di questo topo. Ha un anno di et&agrave; qui, poich&eacute; &egrave; noto che si riproducono in cattivit&agrave; fino a quattro anni. E l'aspettativa di vita in cattivit&agrave; &egrave; in realt&agrave; sconosciuta, perch&eacute; sono stati osservati vivi fino a sette anni.La prima cosa che farò è irrorare la regione inferiore di questo maschio con etanolo al 70%. Questo garantisce che i peli non intralcino. Come si può vedere, le protuberanze qui sono i testicoli.Procederò a effettuare un'incisione attraverso lo strato esterno della pelle, realizzerò una piccola incisione sulla parete interna ed eseguirò tagli orizzontali molto ampi. In realtà, a questo punto trovo più semplice espellere semplicemente i testicoli, poiché il cuscinetto adiposo è molto grande e facilmente visibile. Una volta estratti i testicoli, è necessario effettuare due tagli: uno in prossimità del cuscinetto adiposo per isolare questa struttura, e l'altro al di sotto dell'epididimo, che lo collega alla parete sull'altro lato; occorre tagliare abbastanza in basso da non danneggiare l'epididimo.I testicoli sono costituiti da questa grande piega qui. Inoltre, l'epididimo si trova in questa zona e segue i testicoli fino a questo punto qui in alto. L'epididimo assomiglia anche a un fascio di spaghetti nella parte inferiore, mentre il cuscinetto adiposo si trova nella parte superiore.La prima cosa che faccio è staccare l'epidermide dal testicolo. Una volta fatto ciò, si esegue una leggera trazione per separare il cuscinetto adiposo dall'epidermide. Dopo aver completato questa operazione, ruoto i testicoli e cerco di isolare il più possibile l'epididimo dal cuscinetto adiposo.Una volta fatto ciò, è molto semplice staccare leggermente l'epididimo dai testicoli. In questo modo si isola l'intero epididimo all'interno di questi testicoli. L'epididimo si è effettivamente separato lungo il fianco dei testicoli.Quindi qui ci sono due sezioni diverse da isolare. Una in basso, che è ancora collegata, e poi la parte superiore, che girerò nuovamente in modo da tenerla isolata nella mano sinistra per poter tagliare con la destra ed eliminare subito il tessuto adiposo. In questo modo si ottengono le due diverse porzioni degli EPI.Preleverò gli EPI e poi li posizionerò nel latte al 9% in cui raccoglierò questo sperma. Al momento li sto organizzando in base all'isolamento, in modo da poterli trattare singolarmente. Fondamentalmente, la maggior parte è grasso, ed ecco il punto.È necessario eseguire movimenti lunghi in modo che gli spermatozoi possano nuotare fino alla miscela di latte. Questa è composta principalmente di grassi. Questo è un bel movimento lungo, che distrugge quasi completamente il tessuto.Cerco di fare abbastanza incisioni in questa zona per accedere a tutte le diverse sacche in cui lo sperma viene immagazzinato. Un’altra cosa da evitare è tagliare pezzi troppo piccoli, perché quando si cercherà di prelevare lo sperma in un secondo momento, si rischia che si intasi nell’ago di calibro 22. Lascio riposare il campione per un minuto per assicurarmi che tutto lo sperma abbia lasciato l’epididimo.Le linee irregolari in movimento, che provocano il movimento del liquido, sono gli spermatozoi reali. I grumi sono le granule di deposito del latte, motivo per cui l'immagine appare leggermente più scura poiché si trova in una sospensione di latte. Come si può vedere, gli spermatozoi sono ancora attivi, con le code in movimento.Quindi la prossima cosa che faremo è aspirare la soluzione di spermatozoi al 9% nella siringa. È necessario inclinarla lateralmente perché fin dall'inizio non c'è molto liquido. Basta semplicemente aspirarlo.Se si forma un coagulo, è molto facile rimuoverlo. Basta utilizzare una lampada chimica per pulire l'estremità della punta. Dopo aver aspirato parte della soluzione, a seconda del numero di topi in esame, è necessario eliminare quanta più aria possibile dalla siringa.Questo viene semplicemente fatto agitando la siringa per far salire la bolla d'aria in cima. Queste femmine non vengono anestetizzate in alcun modo e, pertanto, si può osservare che l'iniezione è possibile senza l'uso di alcun anestetico serpente. È necessario iniettare la punta del beccuccio in modo verticale.In realtà, la vagina ha una forma a J, quindi se si inietta e si arretra la siringa, si deve iniettare al massimo 0,05, come ho fatto io. Come potete vedere, è più che sufficiente perché il liquido sta fuoriuscendo. Vi ho appena mostrato come effettuare un'inseminazione artificiale su una femmina.Ciò che abbiamo fatto è isolare gli spermatozoi dal Para mucus polyon di sesso maschile e iniettarli in una femmina in ovulazione. Una volta effettuata questa procedura, la fecondazione dovrebbe avvenire nella femmina OV in concomitanza o poco dopo l'inseminazione artificiale. Dopo 12 ore dovrebbe svilupparsi un embrione di cellula T.

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Qui mostriamo il nuovo • I kit per la crioconservazione degli spermatozoi Cryo mouse. Stadio di due cellule sviluppo dell'embrione con decongelati sperma era migliorato costantemente in 5 ceppi di topi con l'utilizzo di questo kit. Nel corso di un periodo di 1,5 anni, 49 linee di topi geneticamente modificati sono stati archiviati dalla crioconservazione degli spermatozoi con la Cryo • I kit e poi recuperato con successo da fecondazione in vitro.

Crioconservazione del mouse Sperm and Recovery utilizzando il Kit · I Cryo

La microinezione di ovociti del mouse è comunemente utilizzata sia per il transgenesi classico ( cioè l'integrazione casuale dei transgeni) sia per il targeting del gene mediato da CRISPR. Questo protocollo riesamina gli ultimi sviluppi della microinjection, con particolare attenzione alle strategie di controllo della qualità e genotipizzazione.

Generazione di topi modificati geneticamente attraverso la microinjection of oocytes

Liquefazione dello sperma è richiesto per gli spermatozoi di essere liberato dal gel seminale. Questo studio fornisce le procedure per la raccolta dello sperma dal post-coito tratto riproduttivo femminile e misurazione del tempo di liquefazione dello sperma.

Raccolta di post-accoppiamento sperma dal tratto riproduttivo femminile e la misurazione della liquefazione dello sperma nei topi

Qui, presentiamo un protocollo per promuovere l'integrazione del transgene e produzione di topi transgenici fondatore con alta efficacia mediante una semplice iniezione di un vettore lentivirale nello spazio perivitellino di un ovocita fecondato.

Produzione di topi transgenici mediata lentivirali: un metodo semplice ed altamente efficiente per uno studio diretto dei fondatori

Qui presentiamo un metodo modificato per la crioconservazione di embrioni unicellulari, nonché un protocollo che afcoppia l'uso di embrioni congelato ed elettroporazione per la generazione efficiente di topi geneticamente modificati.

Uso di embrioni congelati per la produzione ad alta efficienza di topi geneticamente modificati

Molti modelli di endometriosi di roditori sono limitati dalla complessità tecnica, dalla riproducibilità e / o dalla necessità di animali immunocompromessi o topi reporter speciali. Presentiamo un sistema semplificato di induzione della lesione utilizzando qualsiasi topo sperimentale con un sistema di punteggio oggettivo verificabile in modo indipendente e senza necessità di ovariectomia o chirurgia di sopravvivenza.

Un modello murino singenico di endometriosi utilizzando topi naturalmente ciclabili

Qui, descriviamo una semplice tecnica destinata alla generazione efficiente di topi geneticamente modificati chiamata CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Questo metodo fornisce reagenti di editing mediante elettroporazione negli embrioni con un'efficienza vicina al 100%. Questo protocollo è efficace per mutazioni puntiformi, piccole inserzioni genomiche e delezioni in embrioni di mammifero.

Editing efficiente del genoma dei topi mediante elettroporazione CRISPR degli zigoti

Il metodo di manipolazione cervicale presentato può indurre pseudogravidanza nei topi senza la necessità di riproduttori di femmine con maschi vasectomizzati. L'induzione della pseudogravidanza è necessaria per il successo del trasferimento di embrioni non chirurgico e dell'inseminazione artificiale non chirurgica, entrambi presentati.

Indurre una pseudogravidanza in topi femmina senza la necessità di maschi vasectomizzati prima del trasferimento di embrioni non chirurgici o dell'inseminazione artificiale

Qui, introduciamo un metodo per eseguire l'iniezione di spermatide rotondo (ROSI) nei topi, una tecnica con promettenti applicazioni cliniche e utilità per studiare i meccanismi alla base dello sviluppo embrionale.

Iniezione di spermatide rotondo di topo

Qui, presentiamo un protocollo per stabilire un modello murino di iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi (ICSI)-trasferimento di embrioni (ET), che ci consente di osservare i cambiamenti legati all'età nel metabolismo del glucosio che possono essere attribuiti all'ICSI, fornendo informazioni sui suoi potenziali impatti a lungo termine sullo sviluppo umano.

Monitoraggio della glicemia nella prole di topo dopo l'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi

Impara l'inseminazione artificiale nei topi per la biologia riproduttiva e la ricerca transgenica. Questo metodo consente di controllare con precisione i tempi di fecondazione utilizzando sperma fresco o congelato.

Lo sperma raccolto e l'inseminazione artificiale di topi

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