Utilizzando il sistema GELFREE 8100 Frazionamento per peso molecolare basata su Frazionamento con recupero della fase liquida

Ciao, mi chiamo Jay Harkins. Sono un ricercatore presso Protein Discovery. Oggi dimostrerò quanto sia semplice utilizzare il nuovo sistema di frazionamento senza gel 8, 100 per ottenere un frazionamento basato sul peso molecolare con un'elevata resa.

Utilizzando il sistema senza gel, è possibile caricare fino a un milligrammo di proteine totali per canale e frazionare in modo riproducibile fino a otto campioni in circa 90 minuti. Il sistema comprende quindi uno strumento, una cartuccia monouso e tutti i tamponi necessari per eseguire l'esperimento. Cominciamo dunque.

Iniziare questa procedura preparando ed etichettando fino a otto provette da 500 microlitri, aggiungendo a ciascuna provetta fino a un milligrammo del campione proteico in un volume fino a 112 microlitri. La quantità di proteina presente nel campione dipende dalla complessità del campione.

Per campioni più complessi, come l'omogenato di tessuto utilizzato per questa dimostrazione, da 150 a 200 microgrammi per canale produrranno i migliori risultati. Successivamente, aggiungere 30 microlitri di buffer per campioni 5x, fornito nel kit della cartuccia senza gel. A ciascun campione proteico aggiungere otto microlitri di DTT 1 M.

Quindi regolare ogni campione con acqua fino a un volume finale di 150 microlitri. Successivamente, riscaldare le provette per cinque minuti a 95 gradi Celsius per denaturare il campione. Lasciare raffreddare i campioni riscaldati a temperatura ambiente mentre i campioni si raffreddano.

Rimuovere la cartuccia libera da gel 8, 100 dalla busta di alluminio. Rimuovere e scartare il sigillo della piastra. Rimuovere il buffer di conservazione dai compartimenti della cartuccia utilizzando una pipetta.

Se si utilizzano tutte e otto le camere della cartuccia, capovolgere la cartuccia per drenare il tampone di conservazione dai compartimenti. Successivamente, aggiungere otto millilitri di tampone di corsa senza gel a ciascun serbatoio dell'anodo. Aggiungere sei millilitri a ciascun serbatoio del catodo e pipettare 100 microlitri in ciascuna delle camere di raccolta.

Utilizzando una pipetta a otto canali da 100 a 200 microlitri, rimuovere e scartare qualsiasi tampone che sia fuoriuscito dal serbatoio del catodo ed entrato nella camera di caricamento del campione; quindi caricare immediatamente i campioni nelle camere di caricamento. Una volta caricati i campioni, inserire la cartuccia nella stazione di frazionamento gel free 8, 100. Successivamente, abbassare gli array degli elettrodi e chiudere il coperchio utilizzando l'interfaccia utente grafica facile da programmare sul display touchscreen dello strumento, quindi accedere all'elenco dei metodi preprogrammati disponibili.

Selezionare il metodo appropriato premendo il pulsante metodo. Premere il pulsante di recupero e inserire il numero del metodo preimpostato desiderato utilizzando il tastierino a schermo, quindi premere ok. Successivamente, premere il pulsante applica.

Il metodo che è stato applicato apparirà nella parte inferiore dello schermo principale. Ciascuno dei metodi preprogrammati consiste in tensioni definite e pause basate sul tempo, progettate per risolvere le proteine all'interno di un intervallo specifico di pesi molecolari. Una volta selezionato il metodo appropriato, premere il pulsante del canale sullo schermo principale.

Quindi selezionare i canali che verranno utilizzati durante l'esecuzione. Per selezionare tutti e otto i canali, premere "seleziona tutto". Quindi premere "fine".

Per tornare alla schermata principale, assicurarsi che il coperchio di sicurezza sia chiuso e che la spia luminosa in fondo allo schermo sia verde. A questo punto premere start per iniziare l'esperimento; mentre il sistema è in funzione, i cerchi mostrati nella casella sul lato sinistro dello schermo indicano lo stato di ogni canale. Un cerchio verde indica che il canale è attivo.

Le tensioni e le correnti applicate vengono visualizzate a destra dei cerchi di stato del canale. Il sistema automatico gel free 8, 100 si interromperà automaticamente per la raccolta delle frazioni all'intervallo specificato nel metodo. Quando lo strumento si arresta per raccogliere le frazioni, apparirà una casella di testo che notifica l'avvenuta pausa e i cerchi di stato diventeranno gialli.

All'interno della cartuccia, viene applicata una tensione costante tra i serbatoi dell'anodo e del catodo. Sotto questo potenziale, la miscela proteica è spinta elettroforeticamente dalla camera di caricamento verso il gel di precisione progettato appositamente. Le proteine del gel si accumulano inizialmente in una banda stretta nel gel di concentrazione e successivamente vengono separate in base ai rispettivi pesi molecolari nel gel di risoluzione.

Mentre le proteine eluiscono dal gel, vengono trattenute e concentrate in fase liquida. Nella camera di raccolta il gel è assente. Successivamente lo strumento viene messo in pausa.

In base a intervalli di tempo e frazioni preselezionati, si raccolgono le frazioni mediante pipetta. Successivamente, si applica nuovamente il potenziale per intrappolare la seconda frazione di peso molecolare di interesse. Questo processo viene quindi ripetuto fino a quando non sono state raccolte tutte le frazioni desiderate.

Ogni cartuccia contiene otto canali elettroforetici indipendenti, consentendo all'utente di utilizzare solo i canali necessari e di conservare quelli non utilizzati per un uso successivo. Per rimuovere le frazioni, aprire il coperchio dello strumento, quindi utilizzare la pipetta integrata dei canali. Trasferire i 150 microlitri di liquido presenti in ciascuna camera di raccolta in provette di raccolta o in una piastra a pozzetti multipla.

Dopo aver rimosso le frazioni, lavare due volte la camera di raccolta con tampone di corsa senza gel aggiungendo 100 microlitri per canale ed eseguendo due aspirazioni e dispense. Dopo il lavaggio, aggiungere nuovamente 100 microlitri di tampone di corsa senza gel nelle camere di raccolta. Chiudere il coperchio e premere il pulsante di ripresa.

Il gel libero 8, 100 proseguirà fino al prossimo intervallo di tempo. Il tempo totale rimanente nell'esperimento viene visualizzato sul lato destro dello schermo. Premere il pulsante sopra la casella che mostra il tempo per alternare tra tempo rimanente, tempo trascorso e tempo di pausa.

Dopo aver raccolto tutte le frazioni, queste possono essere immediatamente utilizzate per ulteriori preparazioni a valle, come il focalizzazione isoelettrica o l'elettroforesi su gel, oppure per analisi mediante cromatografia liquida, spettrometria di massa o affinità immunochemica. In questa dimostrazione, otto campioni proteici da 200 microgrammi ciascuno sono stati suddivisi in 12 frazioni ciascuno, per un totale di 96 frazioni. Per visualizzare i risultati della frazionatura, un'aliquota di ciascuna delle 12 frazioni provenienti dal campione di omogeneato di fegato bovino è stata sottoposta a elettroforesi su gel standard 1D e colorata con argento.

Come mostrato in questa figura, il campione proteico è stato frazionato in 12 frazioni distinte che coprono un intervallo di peso molecolare compreso tra 3,5 chilodalton e 150 chilodalton. Il gel mostrato evidenzia la capacità del sistema gel free 8, 100 di frazionare una grande quantità di proteine in frazioni distinte in base al peso molecolare. Questo strumento è estremamente potente per la proteomica top-down e bottom-up mediante spettrometria di massa, nonché per esperimenti di affinità immunochemica in cui è richiesta una singola frazione purificata di proteina integra definita per peso molecolare.

È stato un piacere mostrarvi quanto sia semplice utilizzare il sistema di frazionamento senza gel 8, 100 per suddividere in modo riproducibile il vostro campione in frazioni distinte in base al peso molecolare e ottenere un'elevata resa in fase liquida. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.