Procedura di trapianto epiteliali mammarie

In questo video vengono illustrate le procedure per il prelievo del tessuto mammario. Rimuovere il grasso mammario, eliminare il pad adiposo mammario e trapiantare un epitelio esogeno per studiare lo sviluppo della ghiandola mammaria in topi di tre settimane di età. La crescita dell'albero epiteliale mammario è confinata nelle vicinanze del capezzolo, e il pad adiposo è quasi privo di epitelio mammario. Con la maturazione del topo, l'albero epiteliale si espande attraverso il pad adiposo.

Entro la settimana sette di età, l'albero duttale epiteliale si estende in tutto il cuscinetto adiposo. Se la piccola porzione del cuscinetto adiposo contenente epitelio viene rimossa all'età di tre settimane, l'epitelio endogeno non popolerà mai il cuscinetto adiposo "ripulito" e il cuscinetto adiposo viene definito come ripulito e rimarrebbe tale alla maturità. Tuttavia, l'epitelio o le cellule epiteliali donatrici trapiantate hanno la capacità di estendere alberi duttali in tutto il cuscinetto adiposo ospite ripulito.

Cuscinetto adiposo. L'istologia può quindi essere utilizzata per monitorare il progresso dello sviluppo della memoria nei tessuti trapiantati da animali transgenici o da animali sottoposti a test. Salve, mi chiamo Joseph Jerry e lavoro presso il Dipartimento di Scienze Veterinarie e degli Animali dell'Università del Massachusetts.

Ciao, mi chiamo Karen Dunphy. Lavoro nel laboratorio di Jerry. Oggi eseguiremo un trapianto di epitelio mammario.

Utilizziamo questa procedura per studiare la base molecolare e cellulare della genesi dei tumori della memoria e un modello per il cancro al seno. Cominciamo dunque. Il primo passo della procedura di trapianto consiste nel prelevare il tessuto epiteliale della memoria dal topo donatore.

Iniziare lavando un topo femmina recentemente eutanasizzato con etanolo al 70%, senza perforare le membrane delle SRU della cavità corporea ventrale. Praticare un'incisione sagittale mediana attraverso la pelle, estendendola dal pube allo sterno. Successivamente, effettuare un'incisione obliqua dall'incisione iniziale al pube verso ciascuna zampa posteriore.

Utilizzando pinze curve, afferrare le membrane delle SRU. Quindi, utilizzando pinze dritte seghettate, afferrare il bordo tagliato della pelle e staccare con cura la parete corporea dalle membrane delle S cs.

Per esporre la quarta ghiandola inguinale della memoria attaccata alla superficie inferiore della parete corporea, si localizzi il linfonodo all'interno della ghiandola della memoria all'incrocio di tre vasi sanguigni prominenti e lo si percepisca come un nodulo denso all'interno del cuscinetto adiposo. Con la punta di un paio di forbici da occhio, recidere il tessuto adiposo che circonda il linfonodo. Quindi, applicare pressione con un dito sulla faccia epidermica della pelle per sollevare il linfonodo dal cuscinetto adiposo e staccarlo pinzandolo.

Con una pinza curva, scartare il linfonodo. Ora, tenendo i margini della pelle, afferrare il cuscinetto adiposo con il bordo curvo di una pinza curva e staccare gradualmente il cuscinetto dalla parete addominale. Seguendo la direzione del cuscinetto adiposo verso la superficie dorsale del topo, rimuovere l'intera ghiandola in un unico pezzo.

Posizionare la ghiandola pineale su un blocco di plastica sterile con una piccola quantità di mezzo, circa 200 microlitri, sulla superficie della ghiandola per mantenerla umida. Quindi tritare la ghiandola in pezzi di un millimetro utilizzando una lametta sterile. Dividere il tessuto tritato in quattro porzioni.

Quindi, utilizzando pinzette, distribuire il campione in quattro provette criogeniche contenenti mezzo di congelamento. Posizionare le provette criogeniche in un congelatore cellulare Nalgene con 250 millilitri di alcol isopropilico nel compartimento esterno. Successivamente, collocare il congelatore cellulare a meno 70 gradi Celsius per 24 ore.

Dopo 24 ore, trasferire le provette congelate contenenti frammenti di ghiandole della memoria in azoto liquido, dove dovranno rimanere fino al momento del trapianto. Ogni provetta criogenica contiene frammenti di ghiandole della memoria sufficienti per il trapianto nei cuscinetti adiposi svuotati di quattro-otto topi ospiti. Dopo aver verificato la profondità dell'anestesia in un topo ospite di tre settimane mediante pizzicamento del dito del piede, immobilizzare saldamente il topo in posizione supina, con gli arti distesi su un supporto chirurgico, in modo che l'addome risulti teso.

Deve essere somministrato un analgesico preoperatorio, bupivacaina o buprenorfina, per via sottocutanea. Disinfettare l'area chirurgica con alcol e una soluzione a base di iodio utilizzando pinze. Afferrare la pelle alcuni millimetri sopra il bacino e sollevarla dall'addome.

Tagliare con attenzione la pelle, assicurandosi che l'incisione iniziale non sia troppo vicina all'uretra, dove il posizionamento delle clip per ferite potrebbe interferire con la capacità del topo di urinare. Successivamente, facendo attenzione a non perforare le membrane delle SRUs, effettuare un'incisione midsagittale attraverso la pelle, estendendola dal pube allo sterno.

Ora, a partire dall'incisione iniziale, effettuare tagli obliqui attraverso la pelle dalla linea mediana lungo il bacino verso ciascuna zampa posteriore. Utilizzando pinze curve, afferrare delicatamente le membrane sierose della parete ventrale del corpo. Quindi usare pinze per tessuti per afferrare il margine tagliato della pelle e staccare la parete corporea dalle membrane sierose.

Per esporre la quarta ghiandola inguinale mammaria, identificare la quarta ghiandola mammaria. Identificare la quinta ghiandola mammaria, cauterizzare il linfonodo del capezzolo e le due arterie che conducono al linfonodo. Separare la quarta e la quinta ghiandola, quindi cauterizzare il margine della quinta ghiandola.

Successivamente, utilizzando delle forbici, effettuare un taglio trasversale nel cuscinetto adiposo appena ventrale al linfonodo, dividendo così il cuscinetto adiposo della quarta ghiandola mammaria. Con pinze curve, afferrare saldamente la porzione ventrale del cuscinetto adiposo e staccarla dalla parete corporea. È consigliabile premere il tessuto escisso tra due vetrini etichettati e fissarlo in fissativo car noise.

In seguito, il tessuto può essere colorato, montato e valutato per verificare margini di escissione negativi. Utilizzando pinzette, rimuovere ogni traccia della ghiandola della memoria attorno alla regione in cui è stata asportata la porzione del cuscinetto adiposo. L'animale è ora pronto per il trapianto di tessuto o di cellule.

Il tessuto epiteliale donatore fresco o congelato rapidamente può essere trapiantato nel cuscinetto adiposo svuotato. In alternativa, possono essere trapiantate linee cellulari epiteliali immortalizzate, linee cellulari tumorali della memoria, o cellule primarie. Per i dettagli sulla preparazione delle cellule, si prega di consultare il protocollo scritto allegato per il trapianto di frammenti di epitelio. Preparato.

Questo video inizia scongelando una provetta criogenica contenente epitelio e trasferendo i frammenti in una piastra di Petri contenente mezzo fresco. Per diluire il DMSO usando le forbici, creare una tasca nell'epitelio del cuscinetto adiposo chiarificato del topo ricevente. Quindi, utilizzando pinze a ago, inserire un frammento di epitelio donatore lungo un millimetro all'interno della tasca.

Se necessario, tenere chiusa la tasca con pinze per tessuti ed estrarre le pinze dell'ago in modo che il tessuto rimanga in posizione. Afferrare i margini opposti della pelle. Tenerli uniti con le pinze.

Sollevarli lontano dalle membrane sierose della cavità corporea ventrale e chiudere con clip per ferite. Utilizzare due clip per chiudere l'incisione midsagittale e una clip per ciascuna incisione obliqua. Se necessario, evitare di ostruire l'uretra.

Chiudere i lembi cutanei nel punto di intersezione tra l'incisione mediana sagittale e quella obliqua mediante sutura. Posizionare il topo nella sua gabbia e mantenere la gabbia sotto una lampada riscaldante fino al completo risveglio dell'animale. I fermi cutanei devono essere rimossi dopo due settimane.

Le seguenti diapositive mostrano immagini rappresentative di ciò che si può osservare nella ghiandola della memoria dell'ospite dopo la rimozione del cuscinetto alimentato e il trapianto dell'epitelio; questa immagine mostra l'epitelio della memoria endogeno rimosso da un topo di tre settimane. Nella procedura di svuotamento della ghiandola, osservare i margini netti lungo il bordo tagliato. Dopo ogni procedura, va preparato un preparato in toto come questo per valutare la presenza di margini completamente svuotati.

Questa immagine mostra il cuscinetto adiposo chiarificato del topo sette settimane dopo la procedura di chiarificazione. Si noti che l'intero cuscinetto adiposo è privo di memoria, epitelio, ematina e asina. La colorazione di un cuscinetto adiposo chiarificato sette settimane dopo la procedura di chiarificazione dimostra inoltre che la ghiandola è priva di epitelio della memoria.

Viene mostrato un esempio di preparato intero di un grasso depurato trapiantato con epitelio memoriale donatore proveniente da un topo di 10 settimane. Si noti che l'epitelio trapiantato ha prodotto alberi duttali epiteliali normali, ematina e asina. Colorazione di un grasso depurato e memoriale.

Il trapianto di epitelio alla stessa età rivela la normale produzione di dotti epiteliali da parte dell'epitelio esogeno. Qui, ematina e asin, colorazione di un cuscinetto adiposo chiarito, mostrano un trapianto epiteliale che si è sviluppato in un tumore di tipo memoria. Vi abbiamo appena mostrato come raccogliere l'epitelio mammario ed eseguire un trapianto epiteliale mammario.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di recidere le connessioni tra la quarta e la quinta ghiandola per cauterizzare il linfonodo e il capezzolo, e per rimuovere ogni traccia di epitelio endogeno. È necessario assicurarsi che non vi sia alcuna possibilità che l'epitelio endogeno possa crescere nel cuscinetto adiposo svuotato. Inoltre, è consigliabile conservare l'intera porzione rimossa della ghiandola mammaria per verificare la presenza di margini liberi.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.