Name: Procedura di trapianto epiteliali mammarie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Impara la procedura di trapianto di epitelio mammario per studiare lo sviluppo della ghiandola mammaria nel topo. Questo metodo consente di analizzare la crescita dell'albero duttale epiteliale in vivo.

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1. Preparazione del trapianto di epitelio Tessuto del donatore freschi o surgelati epiteliali possono essere trapiantate nel cuscinetto di grasso eliminato, ma la preparazione prima di epitelio donatore congelato è più conveniente con una diminuzione minima in termini di efficienza trapianto (efficienza&gt; 85%). Il protocollo per la preparazione di epitelio donatore congelato è la seguente: Prima di preparare trapianto di epitelio donatore, preparare i supporti per congelare epitelio e aliquote di 1 ml in cryovials. Questo può essere conservato a 4 ° C fino a 6 mesi fino al momento dell'uso. Congelare supporto contiene DMEM/F12 supporti tamponata con HEPES e NaHCO 3, 10% di siero fetale bovino (FBS) e il 10% dimetilsolfossido (DMSO). Harvest epitelio mammario da un mouse di recente eutanasia femminile. <ol><li> Lavare il mouse con il 70% EtOH. </li><li> Fai una sagittale tagliare la parete del corpo che si estende dal pube allo sterno senza perforare la membrana sierosa della cavità del corpo ventrale. Fare un taglio obliquo dall'incisione iniziale al pube verso ogni zampa posteriore (Figura 1). </li><li> Sbucciare la parete del corpo lontano dalle membrane sierose per esporre il 5 ° ghiandola mammaria inguinale attaccato alla fascia sulla parte inferiore della parete del corpo. Il modo migliore per raggiungere questo obiettivo è afferrando le membrane sierose attentamente con la parte ricurva di un paio di pinze curve, facendo attenzione a non forare la cavità del corpo ventrale. Contemporaneamente, afferrare il bordo tagliato del tegumento con diritto pinze dentellate e tirare la parete del corpo lontano dalle membrane sierose. </li><li> Identificare il linfonodo all'interno della ghiandola mammaria. Il linfonodo si trova all'intersezione di tre vasi sanguigni importanti nella ghiandola mammaria e può essere sentito come un nodulo denso all'interno del cuscinetto adiposo (Figura 2). Con la punta di un paio di forbici occhio, stroncare il tessuto adiposo che circonda il nodo. Con un dito ribalta sul lato epidermico della pelle, applicare una pressione per aumentare il nodo fuori del cuscinetto adiposo e un pizzico fuori con un paio di pinze curve. Eliminare il linfonodo. </li><li> Mentre si tiene ai margini della pelle, afferrare il cuscinetto di grasso mammaria con il bordo curvo di una coppia di pinze curve e gradualmente il cuscinetto adiposo buccia di distanza dalla parete del corpo. Seguire la direzione del cuscinetto adiposo verso la superficie dorsale del mouse come si rimuove l'intera ghiandola mammaria in un unico pezzo. </li><li> Mettere la ghiandola mammaria in un blocco sterile taglio di plastica. Aggiungere una piccola quantità di media, circa 200 ul, alla superficie della ghiandola per mantenerlo umido. Tritare la ghiandola in pezzi 1mm con una lama di rasoio fresca. Dividere la ghiandola tritata in quattro porzioni e distribuire tra quattro cryovials dei media congelare con una pinza. Mettere il cryovials in una "cellula congelatore Nalgene Mr. Frosty che ha 250 ml di alcool isopropilico nel compartimento esterno. Mettete il freezer Nalgene in un congelatore ° -70 C per 24 ore. Conservare le fiale congelate di frammenti mammaria in azoto liquido fino al momento di trapianto. Ogni provetta Microbank ™ conterrà frammenti abbastanza ghiandola mammaria di trapiantare nel cuscinetti di grasso eliminato da 4 a 8 topi host. </li></ol> 2. Preparazione del trapianto di cellule Il nostro laboratorio ha trapiantato diversi tipi di cellule, tra cui immortalato le linee di cellule epiteliali mammarie, mammarie linee di cellule tumorali o cellule primarie mammaria in un topo cancellato cuscinetto adiposo. Il protocollo per la preparazione di Comma-D cellule per il trapianto è la seguente: <ol><li> Comma-D le cellule sono coltivate in normali mezzi di comunicazione MECL contenente DMEM: F12 integrato con 2% siero di bovino adulto (ABS), mEGF, insulina, antibiotica / antimicotica (AB / AM). </li><li> Harvest Comma-D cellule quando le cellule sono confluenti 85% -90%. </li><li> Centrifugare la sospensione cellulare a 1200rpm per 5 minuti per far sedimentare le cellule. Risospendere le cellule in fresco mezzi MECL e regolare la concentrazione cellulare di 5 x 10 6 / ml. </li></ol> Per il trapianto di cellule mammarie primarie, il primario cellule epiteliali mammarie sono isolati dal 5 ° del mouse ghiandole mammarie attraverso la dissociazione meccanica ed enzimatica. Le cellule sono risospese in DMEM: media F12 e adattata alla concentrazione desiderata, di solito 5 x 10 6 / ml. 3. Procedura standard per la Cancellazione del cuscinetto adiposo mammario mouse <ol><li> Anestetizzare le tre del mouse vecchio host settimana. Selezionare i topi che sono &lt;12 g per garantire che la crescita duttale mammario non è stata avviata. Noi usiamo 200mg/kg di peso corporeo di 2,2,2-tribromoethanol. </li><li> Dopo che il mouse è anestetizzato, trattenere saldamente il mouse, lato ventrale con le membra distese, su un palco chirurgico in modo che l'addome è provocazione. Prima dell'intervento, amministrare analgesici: o bupivacaina (1mg/kg &lt;) o buprenorfina (0.05mg/kg), per via sottocutanea. </li><li> Afferrare la pelle con una pinza di pochi millimetri al di sopra del bacino e sollevarlo con l'addome . Nip la pelle con le forbici e per fare un sagittale tagliare la parete del corpo che si estende dal pube allo sterno. Non perforare le membrane sierose del corpo cavità ventrale. Non fate la vostra incisione iniziale troppo vicino l'uretra in modo che le clip ferita non interferisce con la capacità del topo di urinare. </li><li> Dalla incisione iniziale, fare dei tagli obliqui attraverso la pelle dalla linea mediana in tutto il bacino verso entrambe le zampe posteriori. </li><li> Utilizzare l'area curva della pinza curva per afferrare delicatamente le membrane sierose. Utilizzare pinze tessuto di cogliere il margine di taglio della pelle e tirare la parete del corpo lontano dalle membrane sierose ed esporre il 5 ° ghiandola mammaria inguinale trova sulla fascia sulla parte inferiore della parete del corpo. </li><li> Cauterizzare l', nodo capezzolo e due arterie che conducono al nodo (Figura 2) </li><li> Separare le ghiandole quarto e quinto. Cauterizzare il margine della ghiandola quinte per evitare che ricrescita dalla ghiandola 6 °. </li><li> Dividere il cuscinetto adiposo della ghiandola mammaria quarto tagliando attraverso il cuscinetto adiposo con le forbici solo ventrale (lato verso il capezzolo) del nodo. Utilizzare pinze curve di afferrare saldamente la parte ventrale del cuscinetto adiposo e tirarlo fuori dalla parete del corpo in un unico pezzo. Premere la parte ventrale del cuscinetto adiposo tra due vetrini e mettere in un piatto di vetro colorazione istologia contenente fissativo Carnoy. Questo tessuto verranno fissate e colorate successivamente con una soluzione di allume carminio per verificare i margini cancellata (Figura 3). Pulire la fascia intorno alla regione della parte rimossa del cuscinetto adiposo per rimuovere tutte le tracce della ghiandola mammaria con le pinzette ricurve. </li></ol> 4. Alternative "Procedura per Sparing Cancellazione del cuscinetto adiposo Dopo che si è diventati competenti con la procedura standard per la cancellazione del cuscinetto adiposo mammario del mouse, si può preferire di tentare la procedura di risparmiare meno invasiva sviluppata da Brill et al. (2008) 2. <ol><li> Preparare il mouse come per la procedura standard. </li><li> Afferrare il capezzolo del quarto ghiandola mammaria inguinale e tagliare un cerchio di 3-5 mm di circonferenza intorno al capezzolo con la punta di forbici. </li><li> Tirare il capezzolo lontano dal corpo per staccare la parte di taglio della pelle e tracciare il quarto ghiandola mammaria inguinale attraverso il foro. </li><li> Identificare il nodo. Utilizzare il cauterio per cauterizzare il nodo e il 6 ° ghiandola mammaria attraverso il foro. </li><li> Tagliare e staccare la parte più superficiale della ghiandola mammaria 5 ° appena prima del nodo. L', zona del capezzolo circolare di pelle e porzione di epitelio mammario cuscinetto adiposo contenente vengono rimossi in un unico pezzo. </li></ol> 5. Tessuto / trapianto di cellule <ol><li> Per i frammenti di epitelio trapianto, sbrinamento uno provetta Microbank ™ di epitelio e trasferire i frammenti epiteliali di una piastra di Petri contenente mezzi freschi per diluire il DMSO. Fai un piccolo foro o in tasca il cuscinetto di grasso eliminato con punta a forbice per il nuovo epitelio. Mettete un pezzo di epitelio 1 millimetro donatore nella tasca con una pinza ago. Tenere la tasca chiusa con una pinza il tessuto quando si estrae il forcipe ago in modo che il tessuto rimane in vigore. </li><li> Per il trapianto di cellule, iniettare 50.000 cellule in 10 l di media in ogni pad grasso usando una siringa 50μl Hamilton con un ago calibro 22s. </li></ol> 6. Chiusura / Revival di mouse <ol><li> Disporre la pelle per la chiusura. Afferrare opposti margini di pelle, li tengono insieme con le pinze, ascensore via dalle membrane sierose del corpo cavità ventrale e chiudere con clip ferita. In genere, è necessario utilizzare due clip per chiudere la sagittale incisione e una clip per ogni incisione obliqua per la procedura standard. Evitare di ostruire l'uretra. Può essere necessario per colmare le lacune nella pelle nel punto di intersezione delle incisioni sagittale e obliquo con una sutura. La procedura risparmiando richiede solo una clip ferita per ogni lato. </li><li> . Posizionare il mouse nella sua gabbia e tenere la gabbia sotto una lampada di riscaldamento fino a quando il mouse ha fatto rivivere. </li><li> Le clip ferita deve essere rimosso dopo 2 settimane. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Dimostrazione di disegno incisione. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Luogo di linfonodi, vasi sanguigni, capezzolo e l'epitelio endogena. Cauterizzare in luoghi indicati. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Montare Figura 3. Whole dimostra che l'epitelio endogena è limitata alla zona all'interno del cerchio, e quindi i margini sono "chiari '. 7. Rappresentante Risultati _r.jpg "alt =" Figura 4 "/&gt; Figura 4. Montare intere di cuscinetto adiposo rimosso da 3 topo settimana di vita mostrando margini cancellata. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig2_r.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Montare intero da un mouse 10 settimane vecchio mostrando rimozione del cuscinetto adiposo endogene dell'epitelio mammario. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig3_r.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Ematossilina e eosina sezione macchiato di un cuscinetto di grasso eliminato da un mouse 10 settimane di età. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig4_r.jpg" alt="Figura 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 7"> Figura 7. Montare intero da un mouse 10 settimane vecchio che mostra normale albero mammario duttale sviluppato da epitelio trapiantato. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig5_r.jpg" alt="Figura 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 8"> Figura 8. Ematossilina e eosina sezione macchiato di dotti mammari sviluppate da epitelio trapiantato. <img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig6_r.jpg" alt="Figura 9" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 9"> Figura 9. Ematossilina e eosina sezione macchiato di un tumore mammario sviluppato da epitelio trapiantato.

<ol><li>DeOme, K. B., Faulkin, L. J. Jr, Bern, H. A., Blair, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+mammary+tumors+from+hyperplastic+alveolar+nodules+transplanted+into+gland-free+mammary+fat+pads+of+female+C3H+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice.</a> Cancer Res. 19, 515-520 (1959).</li>
<li>Brill, B., Boecher, N., Groner, B., Shemanko, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sparing+procedure+to+clear+the+mouse+mammary+fat+pad+of+epithelial+components+for+transplantation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">A sparing procedure to clear the mouse mammary fat pad of epithelial components for transplantation analysis.</a> Laboratory Animals. 42, 104-110 (2008).</li>
<li>Jerry, D. J., Kittrell, F. S., Kuperwasser, C., Laucirica, R., Dickinson, E. S., Bonilla, P. J., Butel, J. S., Medina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mammary-specific+model+demonstrates+the+role+of+the+p53+tumor+suppressor+gene+in+tumor+development%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">A mammary-specific model demonstrates the role of the p53 tumor suppressor gene in tumor development.</a> Oncogene. 19, 1052-1058 (2000).</li>
<li>Shackleton, M., Vaillant, F., Simpson, K. J., Stingl, J., Smyth, G. K., Asselin-Labat, M. -L., Wu, L., Lindman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439, 84-88 (2006).</li>
<li>Stingl, J., Eirew, P., Ricketson, I., Shackleton, M., Vaillant, F., Choi, D., Li, H. I., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439, 993-997 (2006).</li>
<li>Medina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preneoplastic+Lesions+in+Murine+Mammary+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Preneoplastic Lesions in Murine Mammary Cancer.</a> Cancer Res. 36, 2589-2595 (1976).</li>
<li>Wagner, K. -U., Boulanger, C. A., Henry, S. gagias, Hennighausen, M., Smith, G. H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+adjunct+mammary+epithelial+cell+population+in+parous+females%3A+its+role+in+functional+adaptation+and+tissue+renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An adjunct mammary epithelial cell population in parous females: its role in functional adaptation and tissue renewal.</a> Development. 129, 1377-1386 (2002).</li>
<li>Dunphy, K. A., Blackburn, A. C., Haoheng, Y., O Connell, L. R., Jerry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+and+progesterone+induce+persistent+increases+in+p53-dependent+apoptosis+and+suppress+mammary+tumors+in+BALB%2Fc-Trp53%2B%2F-+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Estrogen and progesterone induce persistent increases in p53-dependent apoptosis and suppress mammary tumors in BALB/c-Trp53+/- mice.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), R43-R43 (2008).</li>
</ol>

In questo rapporto, presentiamo due metodi alternativi per la pulizia del cuscinetto adiposo mammario del mouse in preparazione per i trapianti epiteliali mammarie. La procedura standard è stato in uso dal suo sviluppo nel 1959 da DeOme et al. 1 Mentre più invasivo, il metodo standard è il metodo preferito per la formazione del novizio perché la struttura e l&#39;orientamento della ghiandola mammaria sono facilmente visualizzati. Tuttavia, la procedura risparmiando può essere preferito dal chirurgo p...

procedura di trapianto epiteliali mammarie

Mammary Epithelial Transplant Procedure

Questo articolo descrive e mette a confronto il grasso procedura di liquidazione pad sviluppato da DeOme KB et al. 1 e della procedura di risparmio sviluppato da Brill B et al. 2, seguita dalla procedura di trapianto epiteliali mammarie. La procedura di trapianto mammaria è ampiamente utilizzato dai biologi mammaria perché sfrutta il fatto che lo sviluppo significativo dell&#39;epitelio mammario non avviene solo dopo la pubertà. A 3 settimane di età, la crescita della pianta epiteliali mammarie è limitata alla vicinanza con il capezzolo e il cuscinetto adiposo è in gran parte privo di epitelio mammario, ma da 7 settimane di età dell&#39;albero epiteliale duttale si estende in tutto il cuscinetto di grasso intero. Pertanto, se questa piccola porzione del cuscinetto adiposo contenente epitelio, la regione tra il capezzolo e il linfonodo, viene rimosso a 3 settimane di età, l&#39;epitelio endogeno non sarà mai popolare il pad mammaria grasso e il cuscinetto adiposo è descritto come &quot;cancellato &quot;. In questo momento, epitelio mammario da un&#39;altra fonte possono essere trapiantate nel cuscinetto di grasso eliminato dove si ha la possibilità di estendere mammario duttale alberi attraverso il cuscinetto adiposo. Questa procedura è stata utilizzata in molti modelli sperimentali tra cui l&#39;esame del fenotipo tumorale in transgenico tessuti epiteliali mammarie senza gli effetti confondenti del genotipo sull&#39;animale intero 3, per l&#39;identificazione delle cellule staminali mammarie trapiantando cellule in diluizione limitato 4,5, determinando se noduli iperplastici procedere alla tumori mammari 6, e di valutare l&#39;effetto della esposizione ormonale prima sul comportamento dell&#39;epitelio mammario 7,8. Tre topi ospitare settimana di vita sono anestetizzati, puliti e trattenuto in una fase chirurgica. Un sagittale incisione è fatta attraverso la pelle, ma non il peritoneo, che si estende dal pube allo sterno. Tagli obliqui sono realizzate attraverso la pelle a partire dalla metà sagittale incisione in tutto il bacino verso ogni gamba. La pelle è allontanata dal peritoneo per esporre il 4 ghiandola mammaria inguinale. Il cuscinetto adiposo viene cancellata, eliminando il grasso anteriore tessuto pad per il linfonodo. Frammenti di epitelio o cellule epiteliali vengono trapiantate nel restante pad eliminato il grasso e il mouse è chiuso.

Questo articolo illustra la procedura sviluppata da DeOme KB<em&gt; Et al.</em&gt; (1959) e la procedura risparmiando sviluppato da Brill B<em&gt; Et al.</em&gt; (2008) per la cancellazione del 4 inguinale pad mammaria di un topo grasso pubescente in preparazione per il trapianto di frammenti mammaria, cellule epiteliali mammarie, o cellule tumorali mammarie.

Procedura di trapianto epiteliali mammarie

Questo articolo descrive e confronta la procedura di rimozione del cuscinetto adiposo sviluppata da DeOme KB et al.1 e la procedura di risparmio sviluppata da Brill B et al.2, ...

In questo video vengono illustrate le procedure per il prelievo del tessuto mammario. Rimuovere il tessuto adiposo del pad mammario e trapiantare un epitelio esogeno per studiare lo sviluppo della ghiandola mammaria in topi di tre settimane di età. La crescita dell'albero epiteliale mammario è confinata nelle vicinanze del capezzolo, e il pad adiposo è in gran parte privo di epitelio mammario. Con la maturazione del topo, l'albero epiteliale si espande attraverso il pad adiposo.Entro la settimana settima di età, l'albero duttale epiteliale si estende in tutto il cuscinetto adiposo. Se la piccola porzione del cuscinetto adiposo contenente epitelio viene rimossa all'età di tre settimane, l'epitelio endogeno non popolerà mai il cuscinetto adiposo e il cuscinetto viene definito "ripulito" e rimarrebbe tale alla maturità. Tuttavia, l'epitelio trapiantato da donatore, o cellule epiteliali, ha la capacità di estendere alberi duttali in tutto il cuscinetto adiposo ospite ripulito.Cuscinetto adiposo. L'istologia può quindi essere utilizzata per monitorare il progresso dello sviluppo della memoria nei tessuti trapiantati da animali transgenici o da animali sottoposti a test. Salve, mi chiamo Joseph Jerry e lavoro presso il Dipartimento di Scienze Veterinarie e degli Animali dell'Università del Massachusetts.Ciao, mi chiamo Karen Dunphy. Lavoro nel laboratorio di Jerry. Oggi eseguiremo un trapianto di epitelio mammario.Utilizziamo questo procedimento per studiare la base molecolare e cellulare della genesi dei tumori della memoria e un modello per il cancro al seno. Cominciamo dunque. Il primo passo della procedura di trapianto consiste nel prelevare il tessuto epiteliale della memoria dal topo donatore.Iniziare lavando un topo femmina recentemente eutanasizzato con etanolo al 70%, senza perforare le membrane delle SRU della cavità corporea ventrale. Praticare un'incisione sagittale mediana attraverso la pelle, estendendola dal pube allo sterno. Successivamente, effettuare un'incisione obliqua dall'incisione iniziale al pube verso ciascuna zampa posteriore.Utilizzando pinze curve, afferrare le membrane delle SRU. Quindi, con pinze dritte seghettate, afferrare il bordo tagliato della pelle e staccare con cura la parete corporea dalle membrane delle S cs.Per esporre la quarta ghiandola inguinale della memoria attaccata alla superficie inferiore della parete corporea, si individui il linfonodo all'interno della ghiandola della memoria all'intersezione di tre vasi sanguigni prominenti e lo si riconosca come un nodulo denso all'interno del cuscinetto adiposo. Con la punta di un paio di forbici da occhi, si recida il tessuto adiposo circostante il linfonodo. Quindi, appoggiando un dito sulla faccia epidermica della pelle, si eserciti una pressione per far fuoriuscire il linfonodo dal cuscinetto adiposo e lo si stacchi con una pinzata.Con una pinza curva, scartare il linfonodo. Ora, tenendo i margini della pelle, afferrare il cuscinetto adiposo con il bordo curvo di una pinza curva e staccare gradualmente il cuscinetto dalla parete corporea. Seguendo la direzione del cuscinetto adiposo verso la superficie dorsale del topo, rimuovere l'intera ghiandola adiposa in un unico pezzo.Posizionare la ghiandola della memoria su un blocco di plastica sterile aggiungendo una piccola quantità di mezzo, circa 200 microlitri, sulla superficie della ghiandola per mantenerla umida. Quindi tritare la ghiandola in pezzi di un millimetro utilizzando una lametta sterile. Dividere il tessuto tritato in quattro porzioni.Quindi, utilizzando pinzette, distribuire in quattro provette criogeniche contenenti mezzo di congelamento. Posizionare le provette nel congelatore cellulare Nalgene con 250 millilitri di alcol isopropilico nel comparto esterno. Successivamente, collocare il congelatore cellulare a meno 70 gradi Celsius per 24 ore.Dopo 24 ore, trasferire le provette congelate contenenti frammenti di ghiandole della memoria in azoto liquido, dove dovranno rimanere fino al momento del trapianto. Ogni provetta criogenica contiene frammenti di ghiandole della memoria sufficienti per il trapianto nei cuscinetti adiposi svuotati di quattro a otto topi ospiti. Dopo aver verificato la profondità dell'anestesia in un topo ospite di tre settimane mediante pinzatura del dito del piede, immobilizzare saldamente il topo in posizione supina, con gli arti distesi su un supporto chirurgico, in modo che l'addome risulti teso.Deve essere somministrato un analgesico preoperatorio, bupivacaina o buprenorfina, per via sottocutanea. Disinfettare l'area chirurgica con alcol e una soluzione a base di iodio utilizzando pinze. Afferrare la pelle alcuni millimetri sopra il bacino e sollevarla dall'addome.Tagliare con attenzione la pelle, assicurandosi che l'incisione iniziale non sia troppo vicina all'uretra, dove il posizionamento delle clip per ferite potrebbe interferire con la capacità del topo di urinare. Successivamente, facendo attenzione a non perforare le membrane delle SRUs, effettuare un'incisione midsagittale attraverso la pelle, estendendola dal pube allo sterno.Ora, a partire dall'incisione iniziale, effettuare tagli obliqui attraverso la pelle dalla linea mediana attraverso il bacino verso ciascuna zampa posteriore. Utilizzando pinze curve, afferrare delicatamente le membrane sierose della parete ventrale del corpo. Quindi utilizzare pinze per tessuti per afferrare il margine tagliato della pelle e staccare la parete corporea dalle membrane sierose.Per esporre la quarta ghiandola inguinale mammaria, identificare la quarta ghiandola mammaria. Identificare la quinta ghiandola mammaria, cauterizzare il linfonodo del capezzolo e le due arterie che conducono al linfonodo. Separare la quarta e la quinta ghiandola, quindi cauterizzare il margine della quinta ghiandola.Successivamente, utilizzando delle forbici, effettuare un taglio trasversale nel cuscinetto adiposo appena ventrale al linfonodo, dividendo così il cuscinetto adiposo della quarta ghiandola mammaria. Con pinze curve, afferrare saldamente la porzione ventrale del cuscinetto adiposo e staccarla dalla parete corporea. È consigliabile premere il tessuto escisso tra due vetrini etichettati e fissarlo in fissativo car noise.In seguito, il tessuto può essere colorato, montato e valutato per verificare margini di escissione negativi. Utilizzando pinzette, rimuovere ogni traccia della ghiandola della memoria attorno alla regione in cui è stata asportata la porzione del cuscinetto adiposo. L'animale è ora pronto per il trapianto di tessuto o di cellule.Il tessuto epiteliale del donatore, fresco o congelato rapidamente, può essere trapiantato nel cuscinetto adiposo svuotato. In alternativa, possono essere trapiantate linee cellulari epiteliali immortali, linee cellulari tumorali, cellule primarie o cellule della memoria. Per i dettagli sulla preparazione delle cellule, si prega di consultare il protocollo scritto allegato per il trapianto di frammenti di epitelio. Preparato.Questo video inizia scongelando una provetta criogenica contenente epitelio e trasferendo i frammenti in una piastra di Petri contenente mezzo fresco. Per diluire il DMSO usando le forbici, creare una tasca nell'epitelio del cuscinetto adiposo chiarificato del topo ricevente. Quindi, utilizzando pinze a ago, inserire un frammento di epitelio donatore di un millimetro nella tasca.Se necessario, tenere chiusa la tasca con pinze per tessuti ed estrarre le pinze per l'ago in modo che il tessuto rimanga in posizione. Afferrare i margini opposti della pelle. Tenerli uniti con le pinze.Sollevandoli lontano dalle membrane cerose della cavità corporea ventrale e chiudere con clip da ferita. Utilizzare due clip per chiudere l'incisione midsagittale e una clip per ciascuna incisione obliqua. Evitare di ostruire l'uretra, se necessario.Chiudere le aperture della pelle all'incrocio tra le incisioni midsagittali e oblique con un punto di sutura. Collocare il topo nella sua gabbia e mantenere la gabbia sotto una lampada riscaldante finché il topo non si sarà ripreso. Le clip per ferite devono essere rimosse dopo due settimane.Le seguenti diapositive mostrano immagini rappresentative di ciò che si può osservare nella ghiandola della memoria dell'ospite dopo la rimozione del cuscinetto alimentato e il trapianto dell'epitelio; questa immagine mostra l'epitelio della memoria endogeno rimosso da un topo di tre settimane. Nella procedura di svuotamento della ghiandola, osservare i margini netti lungo il bordo tagliato. Dopo ogni procedura, va preparato un preparato in toto come questo per valutare la presenza di margini completamente svuotati.Questa immagine mostra il cuscinetto adiposo chiarificato del topo sette settimane dopo la procedura di chiarificazione. Si noti che l'intero cuscinetto adiposo è privo di memoria, epitelio, ematina e asina. La colorazione di un cuscinetto adiposo chiarificato sette settimane dopo la procedura di chiarificazione dimostra inoltre che la ghiandola è priva di epitelio della memoria.Viene mostrato un esempio di preparato intero di un grasso depurato trapiantato con epitelio memoriale donatore proveniente da un topo di 10 settimane. Si noti che l'epitelio trapiantato ha prodotto alberi duttali epiteliali normali, ematina e asina. Colorazione di un grasso depurato e memoriale.Il trapianto di epitelio alla stessa et&agrave; rivela la normale produzione di dotti epiteliali da parte dell'epitelio esogeno. Qui, ematina e asina, colorazione di un cuscinetto adiposo chiarito, mostrano un trapianto epiteliale che si &egrave; sviluppato in un tumore di memoria. Vi abbiamo appena mostrato come raccogliere l'epitelio mammario ed eseguire un trapianto di epitelio mammario.Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di recidere le connessioni tra la quarta e la quinta ghiandola per cauterizzare il linfonodo e il capezzolo, e per rimuovere ogni traccia di epitelio endogeno. È necessario assicurarsi che non vi sia alcuna possibilità che l'epitelio endogeno possa crescere nel cuscinetto adiposo ripulito. Inoltre, è consigliabile conservare l'intera porzione rimossa della ghiandola mammaria per verificare la presenza di margini di escissione puliti.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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In questo rapporto, si dimostra un sistema per isolare la cultura e le cellule del donatore dalla ghiandola mammaria del mouse, e ortotopicamente trapianto di queste cellule in topi riceventi per analizzare stromali: interazioni epiteliali durante lo sviluppo del tumore mammario.

Trapianto mammaria di cellule stromali e cellule di carcinoma in topi C57BL/6J

Time-lapse imaging viene utilizzato per valutare il comportamento di primarie preneoplastiche cellule epiteliali mammarie derivate da modelli murini geneticamente modificati di rischio di cancro al seno per determinare se ci sono correlazioni tra i parametri specifici di comportamento e distinte lesioni genetiche.

Time-lapse imaging di primaria preneoplastiche cellule epiteliali mammarie Derivato da modelli murini geneticamente modificati di cancro al seno

Mancano modelli pre-clinici che valutano la terapia adiuvante che mirano alla metastasi del cancro al seno. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato un modello murino di metastasi adenocarcinomi mammarie polmonari de novo , in cui le terapie somministrate nell'ambiente adiuvante (resezione chirurgica postale dei tumori primari) possono essere valutate per efficacia nell'effetto delle metastasi polmonari precedentemente seminate.

Procedure chirurgiche e metodologia per un modello preclinico murino di De Novo Metastasi del cancro del mammario

Questo protocollo descrive metodi per purificare, quantificare e caratterizzare vescicole extracellulari (EVs) / esosomi da cellule epiteliali mammarie non aderenti / mesenchimali e per usarle per trasferire la capacità di formazione delle ghiandole mammarie alle cellule epiteliali mammarie luminali. EVs / esosomi derivati ​​da cellule epiteliali mammarie simili a stelo possono trasferire questa proprietà cellulare alle cellule che ingeriscono gli EV / esosomi.

Trasferimento di abilità di formazione del ghiandale mammario tra le cellule epiteliali basali del mammifero e le cellule luminescenti mammarie attraverso le vescicole / esosomi extracellulari

Questo lavoro dimostra un nuovo approccio per valutare la proliferazione, la differenziazione e il potenziale di formazione delle vascelle di cellule staminali endoteliali (VESCs) attraverso il trapianto di grassi mammarie, seguito da una preparazione del tessuto a tutto sesto per l'osservazione microscopica. Viene inoltre presentata una strategia di tracciamento delle linee per indagare il comportamento dei VESC in vivo .

Una tecnica novel di trapianto di grassi del grasso mammario per visualizzare la generazione di vascelli delle cellule staminali endoteliali vascolari

L'obiettivo di questo protocollo è descrivere un nuovo approccio di modellazione del cancro al seno basato sull'iniezione intraduttiva di adenovirus che esprime Cre nelle ghiandole mammarie dei topi. Questo approccio consente la manipolazione sia di tipo cellulare che di un organo degli eventi oncogeni in modo controllato temporaneamente.

Modellare il cancro al seno tramite un'iniezione intraduttiva di adenovirus che esprime la creminazione nella ghiandola mammaria del topo

Questo articolo descrive un metodo di trapianto per innestare cellule epiteliali mammarie del donatore nel cuscinetto di grasso bianco interscapular degli animali riceventi. Questo metodo può essere utilizzato per esaminare gli effetti dell'ospite e/o del donatore sullo sviluppo dell'epitelio mammario ed elimina la necessità di pre-clearing, estendendo così l'utilità di questa tecnica.

Rat mammary Epithelial Cell Transplantation nel Pad Grasso Bianco Interscapular

I modelli di xenotrapianto derivato dal paziente (PDX) e i modelli murini trapiantabili geneticamente modificati ricapitolano fedelmente la malattia umana e sono modelli preferiti per la ricerca di base e traslazionale sul cancro al seno. Qui, viene descritto un metodo per trapiantare ortotopicamente frammenti di tumore al seno nel cuscinetto di grasso mammario per studiare la biologia del tumore e valutare la risposta al farmaco.

Trapianto ortotopico di tumori al seno come modelli preclinici per il cancro al seno

Il metodo di imaging intravitale qui descritto utilizza la seconda generazione armonica di collagene e la fluorescenza endogena dal cofattore metabolico NAD(P)H per segmentare in modo non invasivo un microambiente tumorale non etichettato in compartimenti tumorali, stromali e vascolari per l'analisi approfondita delle immagini intravitali 4D.

Un approccio di segmentazione senza etichette per l'imaging intravitale del microambiente del tumore mammario

In questo articolo presentiamo procedure chirurgiche dettagliate per la mastectomia endoscopica bilaterale con risparmio del capezzolo tramite una singola incisione ascellare con ricostruzione mammaria immediata basata su protesi pre-pettorali. Questa procedura è un metodo sicuro e praticabile per le pazienti affette da cancro al seno.

Mastectomia endoscopica bilaterale con risparmio del capezzolo tramite una singola incisione ascellare con ricostruzione mammaria immediata basata su protesi pre-pettorali

Il presente studio riporta un protocollo più semplice, rapido ed economico per isolare e far crescere in modo efficiente le cellule epiteliali mammarie umane primarie (HMEC) da piccole quantità di tessuto mammario. Questo protocollo è adatto per la produzione rapida di HMEC primari sia per applicazioni di laboratorio che cliniche.

Isolamento e coltura di cellule epiteliali mammarie umane primarie

Impara la procedura di trapianto di epitelio mammario per studiare lo sviluppo della ghiandola mammaria nel topo. Questo metodo consente di analizzare la crescita dell'albero duttale epiteliale in vivo.

Procedura di trapianto epiteliali mammarie

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