Recupero degli ovociti mouse

Il mio nome è Amanda dli. Sono del laboratorio del Dottor Paul Verana presso l'Università della California di Irvine. Oggi vi mostrerò la procedura per il prelievo di ovociti.

Questo comporta l'isolamento del videx dalla femmina. Una volta isolati gli ovex, inietteremo il mezzo FHM attraverso il videx, e quindi le cytes dovrebbero uscire dall'utero. Al termine di questa procedura, isoleremo le cytes nel mezzo e le utilizzeremo per esperimenti futuri.

Ciò che potresti voler utilizzare questo procedimento a parte l'isolamento delle cellule, è l'isolamento di embrioni in specifici punti temporali. Un motivo per cui potresti voler vedere questo procedimento in formato video è perché le diverse parti dell'ovidutto possono essere molto difficili da riconoscere. In questo video, indicherò l'infundibolo nel quale inietterai il mezzo FHM.

Gli strumenti da dissezione che verranno utilizzati sono due paia di pinzette appuntite e un paio di forbici appuntite. I dotti ovarici prelevati dalla femmina verranno posti in un mezzo FHM, contenuto in una piastra per colture cellulari da 35 millimetri. Le uova verranno recuperate utilizzando un ago da 30 millimetri con estremità smussata collegato a una siringa da un millilitro, e l'uc verrà stabilizzato con una pinzetta appuntita.

FHM è un mezzo di mantenimento utilizzato per raccogliere i citi. KSOM è il mezzo impiegato per far sviluppare i citi all'interno dell'incubatrice, qualora vengano fecondati. Una volta recuperate le uova e gli embrioni dall'ovidotto, utilizzeremo una pipetta di trasferimento in vetro, tirata da un tubo capillare, a cui è collegato un tubicino, e li aspireremo con una pipetta a bocca in un mezzo di mantenimento.

Una capsula concava in vetro viene utilizzata per contenere gli embrioni e le uova. Questi possono essere posizionati in ciascun cerchio concavo in modo da trovarsi in una posizione ben definita, facilitandone così il ritrovamento. Questa viene inserita in un contenitore in modo da poter essere posta in un'incubatrice a CO2 senza l'uso di olio.

Sopra il mezzo FHM o KSOM, a seconda del mezzo utilizzato, si aggiunge acqua alla base, si chiude il rubinetto e il liquido rimane al suo posto. Viene utilizzato etanolo al 70% per assicurarsi che i peli non interferiscano. Effettueremo una piccola incisione nella regione addominale e un'incisione nella cavità addominale.

Amplieremo un'incisione per esporre la regione addominale. Una volta esposto l'utero, sposteremo l'intestino, tra l'altro, e quindi l'utero si trova proprio al di sotto. L'utero ha una forma a Y e ruota ampiamente, coinvolgendo parte dell'utero.

Quando viene tagliato, l'ovidotto appare simile a degli spaghetti. Proverò a prelevare una parte dell'ovidotto. Preleverò l'UCT e una parte delle ovaie, che è racchiusa nel tessuto adiposo.

L'altro lato verrà asportato. A questo punto, preleveremo nuovamente l'ovaio o l'utero. Prelevare qui l'utero, tagliando al di sotto del punto di fissazione. I dotti di Wolff si trovano in corrispondenza di questa sede.

Preleverò una parte dell'ovaio OV. Questa verrà quindi posta nel mezzo di coltura. L'utero continua a contrarsi.

L'utero è composto da muscolo liscio, quindi anche se è staccato dal corpo, i neuroni continuano a trasmettere impulsi. Qui viene mostrato l'utero. Mentre il dotto OV assomiglia a degli spaghetti e l'ovaio si trova al di sopra, in realtà il dotto OV non è collegato all'ovaio.

Sebbene in questo momento abbiamo mostrato solo una porzione dell'ovaio, la mia mano dominante è quella destra, con cui impugno l'ago ottuso da 30 gauge. Lo utilizzo come una pinza per isolare l'in fibula. Una volta isolato, inserirò l'ago ottuso nell'in fibula e inietterò un liquido che fuoriuscirà dall'utero.

La mia mano sinistra tiene pinze affilate. Queste vengono utilizzate per isolare la fibula e mantenere tutto in posizione. L'amidala ha una forma a tromba ed è isolata qui.

La punta del mio ago è nella fibula, che attraversa lo strato di tessuto. Bene. Per assicurarmi di aver isolato tutti gli embrioni e le uova, mi piace premere sull'utero come se fosse un tubetto di dentifricio. Una volta concentrati sui cuscinetti adiposi, cercate delle goccioline di grasso che appaiano perfettamente simmetriche.

C'è un uovo proprio a sinistra di quel lungo grasso. È un singolo uovo. Quindi prenderò con la bocca la pipetta, raccoglierò l'uovo e lo metterò in un altro mezzo di mantenimento, in modo da poter isolare gli uovi stessi.

Oggi vi ho mostrato come isolare i citi dal tratto riproduttivo femminile. Inoltre, vi ho illustrato le diverse strutture della tuba uterina. In particolare, l'infundibolo, che è l'unica struttura nella quale è possibile iniettare il mezzo FHM.

Con un ago da 30 gauge. Con questa tecnica, ho isolato citi e tutti gli embrioni presenti nel tratto riproduttivo femminile. Posso utilizzarli per studi sull'espressione genica o per lavori di ingegneria genetica.