Name: Recupero degli ovociti mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Impara il recupero di ovociti e embrioni da Peromyscus per studi di biologia riproduttiva e genetica. Questo protocollo dettagliato ottimizza l'isolamento cellulare per ricerche transgeniche.

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Vorrei ringraziare Mike Dewey dal Centro Peromyscus patrimonio genetico per il suo aiuto, la pazienza e la conoscenza.

Embrione / recupero degli ovociti <ol><li> Almeno due ore prima il recupero degli embrioni / ovociti, KSOM si trova nel 37 º C CO 2 incubatore e FHM devono essere scongelati da -20 °. Un piatto di vetro contenente tre pozzi poco profondi concava viene usato per gocce casa di KSOM nell&#39;incubatrice. Per prevenire la disidratazione, la KSOM piatto e sono posti in un contenitore con coperchio che ha l&#39;acqua sul fondo. Questo apparecchio evita l&#39;evaporazione senza l&#39;uso di olio minerale. </li><li> Gli ovidotti da una femmina l&#39;ovulazione sono posti nei media FHM. Per garantire l&#39;orientamento e un infindibulum intatto, una piccola sezione delle ovaie viene tagliato con la sezione ovidotto e piccoli dell&#39;utero. Un brusco 30 gauge viene utilizzato per espellere gli embrioni / ovociti dalla ovidotto inserendo l&#39;ago smussato nel infindibulum. Il infindibulum deve essere utilizzato per recuperare gli embrioni in quanto il tubo ovidotto è troppo piccolo per un ago per passare. Nel caso in cui il infindibulum è distrutto, l&#39;ovidotto deve essere affettato aperto o embrioni spremuto. </li><li> Gli embrioni / ovociti si trovano nei media FHM puntando al microscopio sulla goccioline di grasso che hanno toccato il fondo della scatola di Petri. Embrione / ovocita isolamento può essere ottenuto a 20x come questa fornisce un&#39;area di visualizzazione più grande di ingrandimento. Embrione / ovociti sembrano rotonda goccioline di grasso che hanno un anello chiaro intorno ad esso. Pipette a bocca, utilizzando un bicchiere tirato capillare, viene utilizzato per spostare gli embrioni / ovociti per KSOM per l&#39;incubazione e di ulteriori manipolazioni. </li></ol> Procedura per il recupero degli ovociti Preparazione <ol><li> Scongelare FHM e preparare kSOM. </li><li> Poche ore prima, kSOM porlo in un contenitore prelievo degli ovociti e il luogo in scatola punta con acqua sul fondo, luogo di CO 2 incubatore. </li><li> Portare gabbie al laboratorio e uccidere le femmine raccolta. </li><li> Ritagliate le ovidotto facendo attenzione a tagliare alcune delle ovaie e dell&#39;utero alcuni per assicurarsi di non tagliare fuori parte della ovidotto. </li><li> Posto nei media FHM in piccole piastre di Petri. </li><li> Versare un paio di mezzi di comunicazione più FHM piastre di Petri da utilizzare per il lavaggio. </li></ol> Flushing <ol><li> Utilizzare un ago di lavaggio (30 gauge blunt) collegato ad un ago 1 ml con terminale a spirale. </li><li> Prendete un ovidotto alla volta e con l&#39;ago, inserire infundibolo trova vicino alla parte dell&#39;ovaio sinistro collegato. Se l&#39;infundibolo è distrutto e non può essere usato, poi prendere due pinze e tenere un capo del ovidotto. Con la pinza altri, premere delicatamente, come un tubetto di dentifricio, per espellere ogni dell&#39;embrione. Nota: Questo creerà una grande quantità di disordine nella scatola di Petri, come un sacco di tessuto verranno con esso, quindi si consiglia di utilizzare un piatto diverso Petri dopo. </li><li> Per vedere gli embrioni, messa a fuoco microscopio su pezzi di grasso e cercare rotonda &quot;pezzo di grasso&quot;, con chiaro cerchio intorno ad esso. Nota: Gli embrioni hanno lo stesso aspetto come il grasso, quindi potrebbe essere difficile da trovare. Gli embrioni si depositano sul fondo, in modo da guardare là. </li><li> Fare strisci vaginali delle donne destinatario. In questa fase, dovrebbero essere pseudopregnant. </li></ol>

In questo articolo, dimostriamo il recupero di ovociti da ovulazione indotta (superovulated) Peromyscus. L&#39;uso di superovulazione (al contrario di naturale ciclo estrale) è comune a causa del numero molto maggiore che ne derivano. Tuttavia, bisogna fare attenzione nell&#39;interpretare tali risultati utilizzando ovociti / embrioni, in quanto entrambi gli ormoni usati per indurre l&#39;ovulazione e la coltura può avere effetti. Quando estrale è stata confermata, le femmine sono euthenized e ovidotti recuperato insieme ad una picc...

<table><tbody><tr><td>Ago per lavaggio</td><td>Strumento</td><td>Zephyrtronics</td><td>ZT5-130-L</td><td>30 G ottuso</td></tr><tr><td>Pinzette (2)</td><td>Strumento</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5060</td><td></td></tr><tr><td>Peromyscus</td><td>Animale</td><td>Peromyscus Genetic Stock Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forbici</td><td>Strumento</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo FHM tamponato con HEPES</td><td>Reagente</td><td>Specialty Media</td><td>MR-025-d</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di coltura embrionale KSOM (5x 10 mL)</td><td>Reagente</td><td>Specialty Media</td><td>MR-020P-5F</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta orale</td><td>Strumento</td><td></td><td></td><td>Tirata da capillari di vetro e collegata a tubo di gomma</td></tr><tr><td>Piatto per il mantenimento degli ovociti</td><td>Strumento</td><td></td><td></td><td>Contenitore di vetro con depressioni concave</td></tr></tbody></table>

recupero degli ovociti mouse

Retrieval of Mouse Oocytes

Fino ad oggi, solo pochi studi hanno riportato manipolazioni successo dell&#39;embriogenesi Peromyscus o biologia riproduttiva. Insieme con la Borsa di Centro Genetico Peromyscus (http://stkctr.biol.sc.edu), si stanno caratterizzando le differenze salienti necessari per sviluppare questo sistema. Un obiettivo primario è stato quello di ottimizzare ovociti / recupero embrione precoce.

Questo protocollo illustra la tecnica per l&#39;estrazione di ovociti o di embrioni fecondati in fase iniziale dalla ovidotto di topi. La capacità di identificare i infindibulum e inserire un ago senza punta fine in esso è essenziale per eseguire correttamente la procedura.

Recupero degli ovociti mouse

Ad oggi, solo pochi studi hanno riportato manipolazioni riuscite dell'embriogenesi o della biologia riproduttiva di Peromyscus. Insieme al Peromyscus...

Il mio nome è Amanda dli. Sono del laboratorio del Dottor Paul Verana presso l'Università della California di Irvine. Oggi vi mostrerò la procedura per il prelievo di ovociti.Questo comporta l'isolamento del videx dalla femmina. Una volta isolati gli ovex, inietteremo il mezzo FHM attraverso il videx, e quindi le cytes dovrebbero uscire dall'utero. Al termine di questa procedura, isoleremo le cytes nel mezzo e le utilizzeremo per esperimenti futuri.Ciò che potresti voler utilizzare questo procedimento a parte l'isolamento delle cellule, è l'isolamento di embrioni in specifici punti temporali. Un motivo per cui potresti voler vedere questo procedimento in formato video è perché le diverse parti dell'ovidutto possono essere molto difficili da riconoscere. In questo video, indicherò l'infundibolo nel quale inietterai il mezzo FHM.Gli strumenti da dissezione che verranno utilizzati sono due paia di pinzette appuntite e un paio di forbici appuntite. I dotti ovarici prelevati dalla femmina verranno posti in un mezzo FHM, contenuto in una piastra per colture cellulari da 35 millimetri. Le uova verranno recuperate utilizzando un ago da 30 millimetri con estremità smussata collegato a una s

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Biologia

Ovociti sono inclini a aneuploidia a causa di errori nella segregazione dei cromosomi durante la maturazione meiotica. Uova aneuploidi può causare infertilità, aborti o disturbi dello sviluppo, come la sindrome di Down. Qui, descriviamo i metodi per introdurre materiali di scelta in ovociti e metodi per lo studio maturazione meiotica e valutare ploidia.

Microiniezione degli ovociti mouse, Maturazione e Ploidia valutazione

Questo video descrive l'isolamento di ovociti antrali da ovaie di topo appena raccolte. Questi ovociti antrali possono essere utilizzati per ulteriori studi di caratterizzazione e sviluppo.

Isolamento degli ovociti antrali di topo: un metodo per isolare gli ovociti antrali dalle ovaie di topo appena raccolte

Qui, vi presentiamo un protocollo per le specifiche esaurimento mRNA siRNA-mediata seguita da analisi di immunofluorescenza per valutare il montaggio fuso meiotico e l'organizzazione in ovociti di topo. Questo protocollo è adatto a deplezione di trascritti in vitro e valutazione funzionale diverso mandrino e / o fattori MTOC associati in oociti.

Meiotic mandrino valutazione in mouse Ovociti mettendo a tacere siRNA-mediata

Qui vi presentiamo un protocollo per la caratterizzazione di oociti antrali di topo sulla base di organizzazione nucleolare.

Isolamento e caratterizzazione di mouse Antral ovociti Sulla base Nucleolare cromatina Organizzazione

Oogenesi nei mammiferi sono noto per essere soggetta a errori, particolarmente dovuto malsegregazione di cromosoma. Questo manoscritto descrive metodi di preparazione di cromatina diffusa per profase mouse, metafase I e II-messa in scena di ovociti. Queste tecniche fondamentali consentono per lo studio della cromatina-proteine e morfologia del cromosoma in tutto mammiferi oogenesi.

Cromatina diffusa i preparativi per l'analisi della progressione di ovocita Mouse dalla profase alla metafase II

Viene presentato un protocollo ottimizzato che consente l'esaurimento dei centri di organizzazione dei microtubuli citoplasmatici negli ovociti di topo durante la metafase I utilizzando un laser a femtosecondi nel vicino infrarosso.

Ablazione laser multi-fotone di centri di organizzazione di microtubuli citoplasmatici in ovociti di topo

L'errore nella segregazione cromosomica è una caratteristica comune negli ovociti. Pertanto, lo studio del punto di controllo dell'assemblaggio del fuso fornisce importanti indizi sui meccanismi necessari per produrre uova sane. Il presente protocollo descrive tre saggi complementari per valutare l'integrità del checkpoint di assemblaggio del fuso negli ovociti di topo.

Valutazione dell'integrità del checkpoint dell'assemblaggio del mandrino negli ovociti di topo

Questo protocollo fornisce un quadro sperimentale per documentare l'impatto fisico del citoscheletro sulla forma nucleare e sugli organelli interni privi di membrana nel sistema ovocitario di topo. Il framework può essere adattato per l'uso in altri tipi di cellule e contesti.

Cattura dell'agitazione basata sul citoscheletro del nucleo dell'ovocita di topo su scale spaziali

Questo protocollo descrive procedure per la maturazione in vitro degli ovociti di topo, la fecondazione in vitro e la successiva coltura embrionale fino allo stadio di blastocisti.

Maturazione in vitro, fecondazione e coltura degli embrioni pre-impianto di ovociti di topo

Questo film e il protocollo hanno lo scopo di aiutare l'apprendimento di trasferimento nucleare.

Trasferimento nucleare in oociti mouse

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Recupero degli ovociti mouse

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