Analizzando le risposte di topo neuroni olfattivi sensoriali che utilizzano l'aria in fase di registrazione Electroolfactogram

Una preparazione di epitelio olfattivo viene montata su un piatto e posta in un flusso di aria umidificata. Sotto un microscopio da dissezione, un elettrodo di riferimento è collegato elettricamente al tessuto attraverso una soluzione tampone. Un elettrodo di registrazione viene posizionato sulla superficie dell'epitelio olfattivo.

L'epitelio olfattivo è stimolato da sbuffi odorosi controllati dal computer somministrati in un flusso di aria umidificata, che trasporta gli odoranti all'epitelio olfattivo. I segnali EOG vengono trasmessi attraverso un amplificatore e un digitalizzatore al computer di registrazione. Ciao, sono Catherine Ciar del Laboratorio di Igiene XO presso il Dipartimento di Biologia della Johns Hopkins University.

Oggi vi mostreremo una procedura per registrare il grammo elettro olf facto dai topi. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare le risposte dei neuroni sensoriali olfattivi agli odori. Quindi iniziamo.

L'apparato di registrazione è costituito da un elettrodo di registrazione, un elettrodo di riferimento, un tubo di erogazione dell'aria, un tavolino per campioni e un microscopio da dissezione, il tutto ancorato su una tavola d'aria all'interno di una gabbia di Faraday. I manipolatori Microm vengono utilizzati per il posizionamento degli elettrodi nel tubo di mandata dell'aria. Un flusso d'aria continuo viene fatto gorgogliare attraverso l'acqua distillata per aggiungere umidità prima di passare attraverso il tubo di mandata dell'aria e sopra il campione.

Un piatto di coltura da 60 millimetri riempito con sard per adattarsi da sei a otto millimetri viene utilizzato come superficie di montaggio per il campione. Un pozzo e un canale sono scavati fuori dalla loro protezione nel piatto di montaggio. Per fornire un mezzo per collegare elettricamente l'elettrodo di riferimento al campione tramite una soluzione ringer modificata.

Gli elettrodi di registrazione e di riferimento sono collegati a un amplificatore. I segnali provenienti dall'amplificatore vengono inviati a un digitalizzatore e quindi a un computer. Il software del grafico XI viene utilizzato per controllare il protocollo di stimolazione, registrare il segnale e analizzare le risposte.

Un oscilloscopio è collegato dopo l'amplificatore per il monitoraggio in tempo reale del potenziale elettrico durante il posizionamento dell'elettrodo di registrazione. E durante le registrazioni EOG. L'erogazione degli stimoli odorizzanti è controllata da uno spritz pico, che è collegato allo stesso computer utilizzato per l'acquisizione del segnale appena prima di erogare uno stimolo odorizzante.

L'uscita dello spritz pico è collegata a un flacone di odorante contenente odorizzante liquido. La bottiglia viene quindi collegata al tubo di mandata dell'aria. Vediamo ora come preparare gli elettrodi per la registrazione degli esperimenti.

L'elettrodo di registrazione è un filo di cloruro d'argento in un capillare di vetro tirato riempito con una soluzione di ringer modificata. L'elettrodo di riferimento è un filo di cloruro d'argento. Iniziare la preparazione di entrambi gli elettrodi installando un filo d'argento nel portaelettrodo.

Per l'elettrodo di registrazione, uno o due centimetri di filo dovrebbero sporgere dall'estremità del portaelettrodo. È possibile lasciare più filo per l'elettrodo di riferimento. Per aggiungere il rivestimento di cloruro d'argento, posizionare il filo in cloruro di sodio molare da 0,1 e collegare il portaelettrodo al terminale positivo di una fonte di alimentazione da 1,5 a nove volt CC.

Il terminale negativo del generatore deve essere collegato elettricamente alla soluzione di cloruro di sodio 0,1 molare. Lasciare procedere il cloruro in reazione per 10 minuti per equalizzare l'eventuale carica statica tra la registrazione e l'elettrodo di riferimento. Toccare brevemente gli elettrodi prima di installarli sull'apparecchio di registrazione.

Quindi, estrarre un capillare di vetro utilizzando un micro estrattore per pipette. L'apertura sulla punta del capillare dovrebbe avere un diametro compreso tra cinque e 10 micron. Usa una matita di diamante per incidere e rompere l'estremità smussata del capillare in modo che sia circa due centimetri più lunga del filo d'argento.

Utilizzare una torcia a butano per lucidare a fuoco l'estremità tagliata, ora sciogliere lo 0,5% di agros in una soluzione di suoneria modificata. Utilizzare una pipetta di trasferimento per aspirare una piccola quantità di soluzione agro fusa nella punta dell'elettrodo utilizzando una siringa che è stata riscaldata e tirata in modo da avere un'estremità lunga e sottile. Riempire il capillare estratto per circa metà del percorso.

Con la soluzione di suoneria modificata, muovere delicatamente il capillare per rimuovere eventuali bolle d'aria. Conservare l'elettrodo pieno nel barattolo di conservazione con una piccola quantità di soluzione di ringer modificata sul fondo fino al momento dell'uso. Una volta che un campione di tessuto è preparato e pronto per la registrazione, installare un capillare riempito sul filo dell'elettrodo di registrazione con gli elettrodi pronti.

Diamo un'occhiata a un esperimento di registrazione per iniziare a preparare il tessuto per la registrazione. Rimuovere la pelle sovrastante il cranio di un topo sacrificato e dividere in due la testa lungo la linea mediana, montare una metà della testa con il lato mediale rivolto verso l'alto sul piatto di montaggio. Rimuovere con cura il setto per esporre i turbinati.

Posizionare il piatto con il fazzoletto montato sul tavolino di registrazione. Allineare il tavolino in modo che la posizione di registrazione sui turbinati sia centrata sotto il microscopio. Ora accendi il serbatoio dell'aria per fornire aria umidificata a circa 600 millilitri al minuto alla superficie del turbinato.

Posizionare il tubo di mandata dell'aria in modo che si trovi a circa 10 millimetri di distanza dal luogo di registrazione. Impostare l'amplificatore in modalità CC poiché l'amplificazione CA indurrà artefatti nel segnale EOG. Acquisisci con un filtro passa-basso di un kilohertz e un guadagno di 100 x.

Ora montate gli elettrodi di registrazione e di riferimento sui micromanipolatori. Abbassare l'elettrodo di riferimento nel pozzetto sulla piastra di montaggio e coprirlo con una soluzione di suoneria modificata in modo che sia collegato elettricamente al tessuto. Abbassare con cautela l'elettrodo di registrazione sulla superficie del turbinato due B o tre.

L'elettrodo dovrebbe toccare appena la superficie dell'epitelio olfattivo. Quando l'elettrodo entra in contatto con l'epitelio, sull'oscilloscopio apparirà una linea di base diritta. Ora, collega un flacone di odorante alla porta laterale sul tubo di mandata dell'aria sul computer.

Avviare un protocollo di stimolazione. La frequenza di campionamento per l'acquisizione dei dati deve essere di due kilohertz o superiore. Il software attiverà un impulso di odore e inizierà la registrazione.

Un tipico protocollo di stimolazione può essere costituito da impulsi di 100 millisecondi della durata di 100 millisecondi, accoppiati a impulsi singoli, separati da un intervallo di un secondo o da un impulso sostenuto di dieci secondi. Per ridurre al minimo l'adattamento, attendere da uno a cinque minuti tra i protocolli dopo aver erogato alte concentrazioni di odore. L'odore residuo può rimanere nella provetta, lavare la provetta dell'aria con etanolo al 95% e asciugare prima di continuare con ulteriori campioni di tessuto.

Il software Axo graft fornisce strumenti per misurare i parametri chiave del segnale EOG. Tali parametri includono l'ampiezza della risposta, la latenza, il tempo di picco e le costanti di tempo di terminazione. Diversi parametri dell'EOG sono particolarmente utili per il confronto delle risposte normalizzate tra i topi, tra cui l'ampiezza della risposta, il tempo di aumento della latenza, il tempo al picco e la costante di tempo di terminazione.

Qui sono mostrati gli OG di un topo in risposta alla stimolazione con concentrazioni crescenti di acetato di amile liquido. La linea nera in alto indica i tempi e la durata della stimolazione odorizzante. Qui vediamo una relazione dose-risposta mediata da cinque barre di errore dei topi con intervalli di confidenza del 95%.

Un calo dell'ampiezza di picco si osserva spesso a concentrazioni di odore molto elevate. Un esempio di EOG in risposta a una stimolazione a impulsi accoppiati è mostrato un singolo breve impulso di odorante che suscita un adattamento che dura per diversi secondi. Qui è mostrato un EOG in risposta a 10 secondi di stimolazione odorizzante prolungata.

L'EOG mostra desensibilizzazione durante la presentazione continua di odorizzanti. Ti abbiamo appena mostrato come registrare il grammo del fattore elettrodo dai topi. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di posizionare l'elettrodo solo sulla superficie dell'epitelio e di non penetrare nell'elettrodo sotto la superficie.

Registra sempre dallo stesso lato della testa ed evita modifiche alla configurazione per ridurre al minimo le variazioni, mantenere il tessuto umido, ma senza raccogliere goccioline di liquido, mettere il tessuto sotto l'aria umidificata subito dopo la dissezione manterrà il tessuto nello stato migliore per la registrazione. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.