L'isolamento e l'arricchimento delle cellule staminali mesenchimali di ratto (MSC) e la separazione dei Single-colonia di cellule staminali mesenchimali derivate
22 marzo 2010
Ratto MSC sono stati isolati da femori e delle tibie e poi arricchita da cell sorting magnetico. Cellule ordinati sono stati confermati per l'espressione di marcatori di superficie mediante citometria a flusso. Queste cellule sono state coltivate a densità clonale a formare singole colonie e poi queste colonie erano separate da cilindri di clonazione.
Le cellule staminali mesenchimali, abbreviate come MSC, sono isolate da una ratto femmina di sei-otto settimane e coltivate in una piastra di Petri da 10 centimetri fino a raggiungere una confluenza di circa l'80%. Per arricchire le MSC, le cellule vengono marcate con anticorpi primari coniugati con biotina, seguiti da microsferette magnetiche coniugate con streptavidina. Le cellule marcate vengono quindi separate in due frazioni, la frazione negativa e la frazione positiva, mediante il sorting cellulare attivato da campo magnetico.
In seguito, l'analisi mediante citometria a flusso viene utilizzata per confermare l'espressione dei marcatori di superficie. Infine, si utilizzano cilindri per clonazione per ottenere cellule staminali mesenchimali derivate da singole colonie. Ciao, sono Lee del laboratorio di Christina Chang del Dipartimento di Ingegneria Chimica e Scienza dei Materiali della Michigan State University.
Oggi vi mostreremo un procedimento per l'isolamento e l'arricchimento di cellule staminali chy, nonché per l'ottenimento di cellule derivate da singole colonie. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare i comportamenti di proliferazione e di differenziazione delle cellule staminali rosse. Cominciamo dunque.
Le cellule staminali mesenchimali, o MSC, verranno isolate da una ratto femmina SPRD Dolly di età compresa tra le sei e le otto settimane. Per iniziare questa procedura, asportare i femori e le tibie dagli arti posteriori dell'animale eutanasizzato. Rimuovere la pelle e i muscoli, quindi immergere i femori e le tibie dissecati in alcol isopropilico al 70% per alcuni secondi e successivamente trasferirli in un X-D-P-B-S.
I seguenti passaggi devono essere eseguiti in una cappa a sicurezza biologica. In primo luogo, trasferire il femore e la tibia in una piastra da 10 centimetri contenente DMEM. Successivamente, tenendo ciascun osso con pinzette, tagliare entrambe le estremità con forbici.
Applicare un ago da 22 gauge a una siringa da tre millilitri e riempirla con DMEM. Inserire l'ago in una delle estremità aperte dell'osso ed estrarre il midollo in un tubo da 50 millilitri. Ripetere due o tre volte per ciascun osso, fino a quando tutto il midollo è stato recuperato.
Risospendere le cellule, quindi far passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri per rimuovere i detriti ossei e gli aggregati ematici. Centrifugare le cellule a 200 ×g a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Dopo aver rimosso il soprannatante per aspirazione, risospendere le cellule in 25 millilitri di mezzo per cellule staminali mesenchimali (MSC).
10 millilitri di sospensione cellulare in ciascuna di due piastre di coltura da 10 centimetri. Incubare le piastre di coltura in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per una o due settimane. Una volta che le MSC di ratto precedentemente isolate raggiungono una confluenza di circa l'80%, aspirare il mezzo e aggiungere da quattro a cinque millilitri di tripsina EDTA a ogni piastra.
Rimettere le piastre nell'incubatore e incubare per circa cinque minuti. Per consentire il distacco delle cellule, aggiungere un volume uguale di mezzo di coltura per inattivare la tripsina. Raccogliere le sospensioni cellulari in un tubo da 15 millilitri e centrifugare le cellule a 200 ×g e 4 °C per cinque minuti.
Ora dimostreremo l'arricchimento delle MSC mediante due marcatori di superficie, CD 54 e CD 90. Utilizzando il magnete per separazione cellulare BD I magnet di BD Biosciences, iniziare risospendendo il pellet cellulare nel buffer per la colorazione cellulare a 20 milioni di cellule per millilitro.
Successivamente, aggiungere l'anticorpo CD54 biotinilato e un anticorpo CD90 biotinilato alla sospensione cellulare e mescolare delicatamente; dopo un'incubazione sul ghiaccio di 15 minuti, lavare le cellule marcate con un volume in eccesso di buffer BD IMAG 1X. Centrifugare le cellule marcate a 200 ×g e 4 °C per cinque minuti. Preparare le particelle BD IMAG streptavidina vortexando accuratamente, quindi aggiungere 40 microlitri di particelle per ogni 10 milioni di cellule.
Mescolare accuratamente le particelle con le cellule marcate e incubare le cellule a sei-dodici gradi Celsius per 30 minuti. Durante questo periodo di incubazione, etichettare un tubo da prova con fondo rotondo per raccogliere la frazione positiva. Al termine dell'incubazione, portare il volume di marcatura a 20 milioni di cellule per millilitro.
Con un tampone Expedia I mag. Trasferire le cellule marcate nel tubo di raccolta della frazione positiva. Posizionare il tubo della frazione positiva sul magnete BDI e lasciarlo in posa per sei minuti.
Quindi, con il tubo della frazione positiva ancora posizionato sul magnete BDI, rimuovere il soprannatante utilizzando una pipetta Pasteur di vetro. Successivamente, rimuovere il tubo della frazione positiva dal magnete BDI e posizionarlo sul ghiaccio. Aggiungere un millilitro di buffer BDI mag freddo 1X e risospendere le cellule mescolando delicatamente.
Rimettere il tubo sul magnete BDI e lasciarlo in posizione per due o quattro minuti. Rimuovere il soprannatante con una nuova pipetta di vetro Pasteur. Ripetere il lavaggio come descritto in precedenza.
Un'ultima volta. Infine, rimuovere il soprannatante con una nuova pipetta di vetro Pasteur. Quindi rimuovere il tubo dal magnete BDI reus.
Sospendere le cellule in un millilitro di mezzo di coltura e trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 50 millilitri contenente 25 millilitri di mezzo seminato. 1 fiasca quadrata da 75 centimetri per il mantenimento delle cellule e una piastra da 10 centimetri per la citometria a flusso.
Per iniziare la procedura di separazione delle MSC derivate da singole colonie, piastrare le cellule a circa 50-100 cellule per piastra da 10 centimetri e incubare in un'incubatrice a 37 °C e 5% di anidride carbonica per uno o due settimane. Durante questo periodo di una o due settimane, esaminare le colonie ben isolate con un microscopio invertito. Una volta che le colonie hanno raggiunto una dimensione sufficiente, superiore a 100 cellule per ciascuna colonia, contrassegnarle con un pennarello indelebile sul fondo della piastra.
Quando si sceglie una colonia da contrassegnare, assicurarsi che non vi siano colonie vicine nelle vicinanze. Aspirare il mezzo e lavare la piastra una volta con una X-D-P-B-S usando pinzette. Prendere un cilindro di clonazione sterile e posizionarlo delicatamente attorno alla colonia marcata.
Ripetere questo passaggio fino a quando ogni colonia marcata avrà un cilindro di clonazione posizionato sopra. Aggiungere 100 microlitri di tripsina EDTA in ogni cilindro di clonazione e reinserire la piastra nell'incubatore. Dopo cinque minuti, controllare le cellule al microscopio per verificare se stanno assumendo una forma arrotondata.
Quando le cellule si sono staccate, aggiungere una quantità equivalente di mezzo di coltura per inattivare la tripsina. Mescolare la sospensione cellulare con una micropipetta da 200 microlitri e trasferire la sospensione cellulare in una piastra da 60 millimetri contenente tre millilitri di mezzo di coltura preriscaldato. Etichettare le piastre e reinserirle nell'incubatore Bader, dopo l'isolamento su plastica aderente.
I MSC dovrebbero essere visibili già il giorno successivo al seeding. Mentre le cellule continuano a proliferare, le cellule confluenti dovrebbero apparire come quelle mostrate in questa immagine a contrasto di fase, in cui la maggior parte ha una morfologia a forma di fuso o stellata; la coltura è appropriata quando le cellule raggiungono circa l'80% di confluenza.
Dopo la detersione con tripsina, le cellule dovrebbero apparire rotonde e galleggiare nel mezzo. Una volta arricchite le MSC mediante sorting cellulare magnetico, si esegue la citometria a flusso per verificare l'espressione dei marcatori di superficie. Se l'arricchimento è buono, le cellule dovrebbero mostrare una colorazione positiva per i marcatori delle MSC, CD54 e CD90, ma negativa per il marcatore delle HSC CD45; come controlli negativi si utilizzano gli isotipi IgG2a e IgG1.
Quando le cellule sono seminate a una densità clonale appropriata, dovrebbero formarsi colonie derivanti da singole cellule, come mostrato in questo esempio. I cilindri di clonazione possono quindi essere utilizzati per separare le colonie e le cellule derivate dalle colonie possono essere coltivate separatamente. In questi due esempi, le cellule derivate da una colonia sono allungate, mentre le cellule derivate da un'altra colonia sono rotonde.
Finora vi abbiamo mostrato come isolare ed arricchire cellule staminali comuni e rare, nonché come ottenere cellule derivate da singole colonie. Durante questa procedura, è importante ricordarsi di rimuovere i coaguli di sangue e i detriti ossei durante l'isolamento. Utilizzare la quantità ottimale di anticorpo durante l'arricchimento e contrassegnare accuratamente le colonie ben isolate durante la separazione delle colonie.
Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.
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Panoramica
Questo studio si concentra sull'isolamento e l'arricchimento di cellule staminali mesenchimali (MSCs) dai femori e dalle tibie di ratto. Le cellule vengono separate mediante selezione cellulare magnetica e confermate per l'espressione dei marcatori di superficie tramite citometria a flusso.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia delle cellule staminali
- Tecniche di separazione cellulare
- Citometria in flusso
Sfondo
- Le cellule staminali mesenchimali (MSCs) hanno potenziali applicazioni nella medicina rigenerativa.
- L'isolamento e l'arricchimento delle MSCs sono fondamentali per il loro utilizzo efficace nella ricerca.
- Il sorting cellulare magnetico è una tecnica ampiamente utilizzata per l'arricchimento cellulare.
- La citometria a flusso consente l'analisi dei marcatori di superficie cellulare.
Scopo dello studio
- Isolare le MSC dai tessuti ossei del ratto.
- Arricchire le cellule isolate mediante metodi di separazione magnetica.
- Confermare l'identità delle MSC attraverso l'analisi dei marcatori di superficie.
Metodi Utilizzati
- Isolamento di MSC dai femori e dalle tibie di ratti.
- Arricchimento delle MSC mediante anticorpi coniugati con biotina e microsferette magnetiche.
- Separazione delle cellule in frazioni positive e negative mediante sorting cellulare attivato da campo magnetico.
- Analisi mediante citometria a flusso per confermare l'espressione dei marcatori di superficie.
- Coltura delle cellule a densità clonale per formare colonie singole.
- Utilizzo di cilindri di clonazione per separare le colonie.
Risultati principali
- Isolamento e arricchimento con successo di MSC da tessuti ossei di ratto.
- Conferma dell'espressione dei marcatori di superficie mediante citometria a flusso.
- Stabilimento di MSC derivate da singola colonia per ulteriori studi.
Conclusioni
- I metodi impiegati isolano ed arricchiscono efficacemente le MSC.
- La citometria a flusso è una tecnica affidabile per confermare l'identità cellulare.
- Le MSC derivate da singola colonia possono essere utilizzate per varie applicazioni nella ricerca.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'isolamento e l'arricchimento di cellule staminali mesenchimali (MSC) dal midollo osseo di ratto consentono la validazione precoce di bersagli nella ricerca sulla medicina rigenerativa. Il protocollo favorisce la riduzione del rischio meccanicistico isolando sottopopolazioni omogenee mediante selezione magnetica e separazione clonale, migliorando l'affidabilità predittiva nelle applicazioni successive. Questo flusso di lavoro colloca la caratterizzazione delle MSC come passaggio riproducibile nelle fasi precliniche di scoperta per lo sviluppo di terapie cellulari.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi dell'eterogeneità delle MSC isolando sottopopolazioni derivate da singole colonie per la valutazione funzionale.
- Valore operativo: Fornisce un metodo standardizzato per arricchire le MSC mediante marcatori superficiali CD54 e CD90, riducendo la variabilità nei modelli sperimentali.
- Valore predittivo: Supporta la conferma dell'obiettivo validando l'identità delle MSC tramite citometria a flusso e deplezione delle cellule staminali ematopoietiche (CD45 negativo), rafforzando lo screening basato su ipotesi.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera popolazioni purificate di MSC adatte alla standardizzazione dei saggi e allo screening riproducibile di composti.
- Valore operativo: La separazione magnetica produce risultati quantitativi e scalabili, compatibili con flussi di lavoro ad alta produttività.
- Prontezza per il saggio: I cilindri per clonaggio permettono la separazione di varianti fenotipiche per la valutazione parallela delle caratteristiche di proliferazione e differenziazione.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Le MSC derivate da singole colonie forniscono sistemi pertinenti alla malattia per valutare il potenziale di differenziazione specifico per linea cellulare.
- De-risking meccanicistico: Sottopopolazioni isogeniche riducono il rumore nelle valutazioni precliniche di efficacia e sicurezza.
- Avanzamento proporzionato al rischio: Permette la priorizzazione di cloni di MSC con multipotenza desiderata per ulteriori sviluppi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta, supportando il passaggio dall'isolamento delle cellule staminali mesenchimali all'identificazione dei composti promettenti mediante caratterizzazione clonale e validazione funzionale.
- Biologia della scoperta: Facilita la verifica di ipotesi sulle sottopopolazioni di MSC eliminando la contaminazione ematopoietica e arricchendo le cellule CD54/CD90+.
- Screening: Produce colture standardizzate di MSC aderenti pronte per lo screening di librerie di composti e saggi di dose-risposta.
- Analisi: La citometria a flusso fornisce dati quantitativi sull'espressione dei marcatori, consentendo un confronto oggettivo tra popolazioni arricchite e naive.
- Ricerca traslazionale: L'espansione clonale supporta studi di allineamento dei biomarcatori collegando fenotipo superficiale a output funzionali.
- Utilizzo aziendale: Il protocollo stabilisce una piattaforma riutilizzabile di preparazione di MSC applicabile a più progetti e aree terapeutiche.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica isolando sottopopolazioni definite di MSC con fenotipi superficiali validati.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso passaggi standardizzati di separazione magnetica e isolamento clonale.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo dati quantitativi sull'arricchimento delle MSC già nelle fasi iniziali della scoperta.
- Impatto sul portafoglio: Permette un'allocazione delle risorse adeguata al rischio, basata sulla potenza clonale e sulla capacità di differenziazione.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura di cellule staminali, nel sorting cellulare magnetico e nella citometria a flusso.
- Dipende dall'accesso al sistema BD IMag, ad anticorpi biotinilati e a cilindri per clonazione.
- Necessita di standardizzazione tra i gruppi di lavoro per un arricchimento costante delle MSC e una densità di semina clonale uniforme.
- L'adattamento ad altre specie o fonti tessutali potrebbe richiedere un'ottimizzazione della digestione enzimatica e dei pannelli di anticorpi.
- I limiti pratici includono la persistenza dell'eterogeneità delle MSC nonostante l'arricchimento e la variabilità nell'efficienza di formazione delle colonie.
