Espressione di proteine ​​ricombinanti nel lievito Methylotrophic Pichia pastoris

Il seguente protocollo descrive l'espressione proteica utilizzando il lievito metilotrofico opus. Vengono mostrate la preparazione di cellule di lievito elettrocompetenti e la trasformazione del vettore contenente il gene di interesse in PPAs, seguite dal passaggio di purificazione del DNA del lievito per verificare l'integrazione corretta del gene di interesse nel genoma del lievito. Alla fine, eseguiremo l'espressione della proteina ricombinante.

Ciao, sono Maria del laboratorio di Steven Hallam presso il Dipartimento di Microbiologia e Immunologia dell'Università della British Columbia. Sono Marcus, anch'io del laboratorio Helm. Oggi vi mostreremo un procedimento per esprimere proteine ricombinanti nel lievito TRO PQ.Past stories.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare proteine provenienti da microorganismi non classificati, da cui è stato estratto e archiviato il DNA ambientale e sono state create librerie metagenomiche. Cominciamo dunque. L'espressione di proteine ricombinanti nel lievito metilotrofico Pichia pastoris richiede il clonaggio del gene di interesse in frame in un vettore di espressione PPA.

Nel nostro esperimento, utilizziamo il vettore PPIC Z alpha A. Questo vettore contiene il promotore AO X uno per l'espressione del gene di interesse strettamente regolata dal metanolo, il segnale di secrezione del fattore alfa per la secrezione della proteina ricombinante, zaas e un gene di resistenza per la selezione sia in e coli che in pic, un peptide C-terminale contenente un epitopo acemico e un tag poli-istidinico per il rilevamento e la purificazione della proteina ricombinante. Prima della trasformazione, linearizzare il vettore contenente il gene di interesse mediante digestione con enzimi di restrizione. Utilizziamo l'enzima PME uno, ma sono possibili altri siti di restrizione, purché il vostro inserto non contenga tale sito di restrizione.

Per ottenere una quantità sufficiente di DNA plasmidico linearizzato, preparare tre o quattro reazioni di digestione con enzimi di restrizione da 50 microlitri ciascuna in provette separate; dopo la digestione, unire tutte le soluzioni e concentrare il costrutto. Utilizzando un filtro centrifugo AmCon e un filtro centrifugo MicroCon, saranno necessari da cinque a venti microgrammi di DNA linearizzato in un volume da cinque a dieci microlitri di acqua sterile per la trasformazione in PPA dous. Per preparare cellule elettrocompetenti di PPA dous, seminare le cellule su una piastra A-Y-P-D-S senza SN quattro giorni prima della trasformazione programmata, quindi coltivare a 30 gradi Celsius per uno o due giorni o fino alla formazione di singole colonie due giorni prima della trasformazione.

Coltivare cinque millilitri di PPA o ceppo in mezzo YPD in un tubo Falcon da 50 millilitri a 30 gradi Celsius durante la notte. Posizionare il tubo Falcon in un matraccio per fissarlo nello shaker un giorno prima della trasformazione. Utilizzare 0,25 millilitri della coltura notturna per inoculare 500 millilitri di mezzo YPD fresco in un matraccio da due litri.

Coltivare di nuovo durante la notte in un agitatore a 30 gradi Celsius fino a un OD 600 compreso tra 1,3 e 1,5. Nel giorno della trasformazione, tenere a disposizione ghiaccio, acqua fredda sterile e sorbitolo uno molare. Centrifugare le cellule a 1500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Dopo la centrifugazione, sospenderemo il pellet con 500 millilitri di acqua sterile, fredda di ghiaccio. A seconda della capacità delle provette per centrifuga, potrebbe essere necessario suddividere il volume in due provette distinte o effettuare più centrifugazioni. Centrifugare nuovamente le cellule e risospendere il pellet con 250 millilitri di acqua sterile, fredda di ghiaccio.

A seconda della capacità delle provette per centrifuga, è possibile combinare i diversi pellet cellulari in una singola provetta. Durante la centrifugazione di risospensione, risospendere nuovamente il pellet cellulare. In 20 millilitri di sorbitolo ghiacciato e monomolare, trasferire le cellule risospese in una provetta falcon da 50 millilitri e centrifugare.

Dopo una centrifugazione finale, risospendere il pellet in un millilitro di sorbitolo ghiacciato e una molarità di uno, fino a un volume finale di circa 1,5 millilitri. Le cellule risospese in provette per microcentrifuga vanno conservate sul ghiaccio o a quattro gradi Celsius fino al loro utilizzo per la trasformazione. Prima della trasformazione del costrutto lineare concentrato in cellule PPA stor, preparare i seguenti reagenti e dispositivi.

Riempire una provetta da microcentrifuga con un millilitro di sorbitolo uno molare e posizionarla sul ghiaccio. Posizionare un elettroporatore da 0,2 centimetri sul ghiaccio.

Etichettare una provetta in vetro sterile da 15 millilitri ed avere a disposizione una pipetta sterile in vetro. Trasferire 80 microlitri delle cellule elettrocompetenti precedentemente preparate nel vial di elettroporazione da zero virgola due centimetri, freddo di ghiaccio.

Aggiungere la soluzione di DNA plasmidico alle cellule e mescolare spostando la punta della pipetta da un lato all'altro. Nel vete di elettroporazione. Incubare il vete con le cellule sul ghiaccio per cinque minuti.

Successivamente, pulire l'esterno del vete con il tessuto e applicare l'elettroporazione alle cellule secondo i parametri indicati per lieviti in gemmazione dal produttore del dispositivo di elettroporazione in uso. In questa dimostrazione si utilizza un BioRad Gene Pulser con le seguenti condizioni: tensione di carica di 1500 volt, capacità di 25 microfarad e resistenza di 200 ohm immediatamente dopo l'impulso.

Aggiungere un millilitro di sorbitolo ghiacciato e monomolare al vet. Trasferire il contenuto del vet in un tubo sterile da 15 millilitri utilizzando una pipetta sterile in vetro. Incubare il tubo a 30 gradi Celsius senza agitazione per 1,5 ore.

Dopo 1,5 ore, le cellule elettroporate sono pronte per essere seminate. Aggiungere da cinque a dieci perline di vetro sterili a ognuna delle quattro piastre YPTS etichettate contenenti 100 microgrammi per millilitro di Zain. Distribuire 250 microlitri dell'elettroporazione.

Mescolare su ogni piastra e agitare orizzontalmente per distribuire uniformemente le cellule. Lasciare asciugare le piastre per 15 minuti, quindi rimuovere le perle dall'agro capovolgendo le piastre. Avvolgere le piastre in una plastica nera per prevenire il degrado del Zain sensibile alla luce e incubare le piastre capovolte per due o tre giorni a 30 gradi Celsius fino alla formazione di colonie, dopo che le colonie si sono formate.

Selezionare 12 colonie. Purificarle mediante striatura dei cloni su piastre YPDS fresche contenenti 100 microgrammi per millilitro di zeina. Per preparare le cellule PPA all'espressione proteica, selezionare una singola colonia dalle colonie di Pichia purificate e inoculare in 25 millilitri di mezzo VMGY in un flacone sterile da 250 millilitri, coltivando a 30 gradi Celsius in un incubatore sotto agitazione fino a quando la coltura raggiunge un OD 600 compreso tra due e sei.

Quando le cellule hanno raggiunto il valore appropriato di OD 600, preparare una provetta di glicerolo delle cellule per la conservazione. Trasferire 800 microlitri della coltura cellulare in una provetta criogenica da due millilitri e aggiungere 200 microlitri di glicerolo sterilizzato. Conservare la provetta di glicerolo a meno 80 gradi Celsius.

Inoltre, trasferire 1,5 millilitri della coltura cellulare in una provetta da microcentrifuga. Raccogliere le cellule centrifugando a 1300 ×g per un minuto a temperatura ambiente. Conservare il pellet a quattro gradi Celsius.

Queste cellule saranno utilizzate per la purificazione del DNA di lievito al fine di analizzare i trasformanti di Pichia mediante PCR con primer specifici per l'inserzione su un gel agarosio per confermare che il gene di interesse si sia integrato nel genoma di Pichia. Trasferire il resto della coltura da 25 millilitri in un tubo Falcon da 50 millilitri e raccogliere le cellule centrifugando a 3000 ×g per cinque minuti a temperatura ambiente, decantare il sopranatante e posizionare il tubo capovolto su un fazzoletto per rimuovere qualsiasi residuo di mezzo; lavare il pellet cellulare. Sospendere il pellet mediante vortex o pipettaggio ripetuto in 20 millilitri di mezzo BMMY e centrifugare.

Sospendere nuovamente la sospensione cellulare dopo la decantazione, risospendere il pellet cellulare nel supernatante mediante vortex o pipettaggio su e giù fino a un OD 600 di 1,0 in BMMY. Mezzo per indurre l'espressione. Trasferire la coltura in un matraccio bafflato da un litro e coprire il matraccio con un beccuccio da 200 millilitri.

Si raccomanda vivamente l'uso di coltelli baffati poiché introducono più ossigeno nella coltura. Per un'espressione proteica efficiente durante l'induzione con metanolo, incubare il coltello nell'incubatrice per continuare la crescita a 30 gradi Celsius. È importante che la temperatura non superi i 30 gradi Celsius qualora la temperatura dell'incubatrice presenti fluttuazioni.

Impostare la temperatura a 28 gradi Celsius. Aggiungere metanolo puro sterilizzato fino a una concentrazione finale di 0,5% di metanolo ogni 24 ore per mantenere l'induzione; in determinati punti temporali dopo l'inizio dell'espressione, trasferire un millilitro della coltura in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri e centrifugare a 1300 G per 2,5 minuti. A temperatura ambiente, trasferire il soprannatante in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri separata.

Conservare il soprannatante e i pellet cellulari a meno 80 gradi Celsius fino all'analisi successiva. I campioni provenienti da diversi punti temporali verranno analizzati per stabilire il periodo ottimale di espressione proteica dopo l'induzione. Di seguito mostriamo alcuni risultati rappresentativi dell'espressione riuscita di proteine ricombinanti utilizzando PIA Pastis come sistema ospite.

Questa immagine di blotting occidentale mostra quattro proteine espresse dopo 24 ore di espressione. L'anticorpo utilizzato per il blotting immuno è stato un anticorpo HRP acemico. La seconda corsia è un controllo negativo e contiene il sopranatante di cellule che non esprimono la proteina ricombinante perché sono state trasformate con il vettore parentale.

Abbiamo appena mostrato come esprimere proteine ricombinanti utilizzando l'ospite eucariotico PQ.Plus. Quando si esegue questa procedura, è importante disporre della sequenza del costrutto per confermare che il gene di interesse sia stato clonato e inserito nel giusto frame, e avere pronti tutti i piatti e i reagenti prima di iniziare. È inoltre fondamentale preparare una quantità sufficiente di plasmide linearizzato per ottenere un elevato numero di trasformanti prima dell'espressione proteica indotta dal metanolo. Assicurarsi di lavare accuratamente le cellule per rimuovere eventuali tracce residue di glicerolo che potrebbero inibire l'espressione proteica.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con gli esperimenti.