Name: Espressione di proteine ricombinanti nel lievito Methylotrophic Pichia pastoris /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-25T16:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Impara l'espressione di proteine ricombinanti nel lievito metilotrofo Pichia pastoris. Questo metodo include la preparazione di cellule elettrocompetenti, la trasformazione del vettore e l'analisi Western blot per la rilevazione proteica.

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Vorremmo ringraziare la Fondazione canadese per l&#39;innovazione, la British Columbia Fondo di conoscenza per lo sviluppo e la Canadian Institutes of Health Research (CIHR) per sostenere questo lavoro. MT è stato sostenuto da una borsa di studio del Centro TULA fondazione finanziata per la diversità microbica e Evolution (CMDE).

<ol><li>Cereghino, G. P., Cregg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+yeast+in+biotechnology%3A+protein+production+and+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Applications of yeast in biotechnology: protein production and genetic analysis.</a> Curr Opin Biotechnol. 10, 422-427 (1999).</li>
<li>Cregg, J. M., Barringer, K. J., Hessler, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pichia+pastoris+as+a+Host+System+for+Transformations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pichia pastoris as a Host System for Transformations.</a> Mol. Cell. Biol. 5, 3376-3385 (1985).</li>
<li>Cregg, J. M., Cereghino, J. L., Shi, J., Higgins, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+in+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression in Pichia pastoris.</a> Mol Biotechnol. 16, 23-52 (2000).</li>
<li>Cereghino, G. P., Cereghino, J. L., Ilgen, C., Cregg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+proteins+in+fermenter+cultures+of+the+yeast+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant proteins in fermenter cultures of the yeast Pichia pastoris.</a> Curr Opin Biotechnol. 4, 329-332 (2002).</li>
</ol>

Espressione della proteina usando il methylotrophic Pichia pastoris lievito come sistema host è descritto in questo protocollo. La proteina può essere secreta nel mezzo a seconda del vettore di clonazione utilizzata. La secrezione della proteina ricombinante rende più facile la successiva purificazione. Tuttavia, le condizioni indicate possono essere ottimizzati per l&#39;espressione di proteine ​​diverse e cambiamenti nelle condizioni e tempi di espressione può portare a livelli di proteine ​​maggiore. Il vett...

espressione di proteine ​​ricombinanti nel lievito methylotrophic pichia pastoris</em

Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris

Espressione della proteina in Pichia pastoris microbica eucariotica ospitante offre la possibilità di generare elevate quantità di proteina ricombinante in un sistema di espressione veloce e facile da usare. Come un microrganismo unicellulare P. pastoris è facile da manipolare e cresce rapidamente su un supporto economico a densità elevata delle cellule. Essendo un eucariote, P. pastoris è in grado di eseguire molte delle modificazioni post-traduzionali eseguiti dai maggiori cellule eucariotiche e le proteine ​​ricombinanti ottenuti subiscono ripiegamento delle proteine, maturazione proteolitica, la formazione di legame disolfuro e glicosilazione [1]. Come un lievito P. methylotrophic pastoris è in grado di metabolizzare metanolo come unica fonte di carbonio. Il promotore forte per l&#39;alcol ossidasi, AOX1, è strettamente regolato e indotta da metanolo ed è utilizzato per l&#39;espressione del gene di interesse. Di conseguenza, l&#39;espressione della proteina estranea può essere indotta con l&#39;aggiunta di metanolo al mezzo di crescita [2, 3]. Un altro vantaggio importante è la secrezione della proteina ricombinante nel mezzo di crescita, utilizzando una sequenza segnale per indirizzare la proteina estranea al via secretoria di P. pastoris. Con solo i bassi livelli di proteina endogena secreta alla stampa dallo stesso lievito e senza proteine ​​aggiunti ai media, una proteina eterologa costruisce la maggior parte delle proteine ​​totali nel medio e facilita le seguenti fasi di purificazione proteica [3, 4]. Il vettore usato qui (pPICZαA) contiene il promotore per AOX1 strettamente regolamentati, metanolo-indotta espressione del gene di interesse, il fattore-α segnale di secrezione per la secrezione della proteina ricombinante, un gene di resistenza Zeocin per la selezione sia in E. coli e Pichia e un C-terminale del peptide contenente il c-myc e un epitopo (6xHis) tag polyhistidine per il rilevamento e la purificazione di una proteina ricombinante. Mostriamo anche l&#39;analisi western blot della proteina ricombinante utilizzando lo specifico anti-myc HRP-anticorpo che riconosce il c-myc epitopo sul vettore genitore.

Il protocollo descrive l&#39;espressione della proteina usando il lievito methylotrophic<em&gt; Pichia pastoris</em&gt;. La preparazione di cellule di lievito electrocompetent, la trasformazione del vettore con il gene di interesse in<em&gt; P. pastoris</em&gt; E di purificazione del DNA lievito sono anche eseguito. Western blot e la purificazione di proteine ​​costruire gli ultimi passi in questo protocollo l&#39;espressione della proteina.

Espressione di proteine ​​ricombinanti nel lievito Methylotrophic Pichia pastoris</em

L'espressione proteica nell'ospite eucariotico microbico Pichia pastoris offre la possibilità di generare elevate quantità di proteine ricombinanti in modo rapido e...

Il seguente protocollo descrive l'espressione proteica utilizzando il lievito metilotrofico opus. Vengono mostrate la preparazione di cellule di lievito elettrocompetenti e la trasformazione del vettore contenente il gene di interesse in PPAs, seguite dal passaggio di purificazione del DNA del lievito per verificare l'integrazione corretta del gene di interesse nel genoma del lievito. Alla fine, eseguiremo l'espressione della proteina ricombinante.Ciao, sono Maria del laboratorio di Steven Hallam presso il Dipartimento di Microbiologia e Immunologia dell'Università della British Columbia. Sono Marcus, anch'io del laboratorio Helm. Oggi vi mostreremo un procedimento per esprimere proteine ricombinanti nel lievito TRO PQ.Past stories.Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare proteine provenienti da microorganismi non classificati, da cui è stato estratto e archiviato il DNA ambientale e sono state create librerie metagenomiche. Cominciamo dunque. L'espressione di proteine ricombinanti nel lievito metilotrofico Pichia pastoris richiede il clonaggio del gene di interesse in frame in un vettore di espressione PPA.Nel nostro esperimento, utilizziamo il vettore PPIC

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Biologia

Trasduzione proteina consente la fornitura diretta di proteine ​​biologicamente attive nelle cellule. A differenza dei metodi tradizionali come la transfezione di DNA o di trasduzione virale questo non invasivo consente paradigma altamente efficiente manipolazione cellulare in modo titolabile eludere tossicità cellulare e il rischio di trasformazione oncogena permanente da modificazione genetica.

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Domini zinco-dita sono intrinsecamente cellula-permeabile e capace di mediare consegna proteine ​​in una vasta gamma di tipi di cellule di mammifero. Qui, un protocollo dettagliato passo-passo per l'attuazione tecnologia zinc finger-consegna proteina intracellulare è presentato.

Diretto Protein Consegna a cellule di mammifero Utilizzando Cell-permeabile Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -Il suo<sub&gt; 2</sub&gt; domini zinc-finger

Presentato qui è una descrizione unificata di tecniche che possono essere utilizzati per sviluppare, trasformare, amministrare e verificare l'espressione della proteina eterologa dei probiotici lievito Saccharomyces boulardii.

Trasformazione di lievito probiotico e il loro recupero da gastrointestinali immunitario tessuti dopo sonda gastrica nei topi

La produzione su scala di laboratorio di proteine eucariotiche con appropriate modifiche post-traduzionali rappresenta un ostacolo significativo. Ecco un protocollo robusto con rapida instaurazione e inversione di tendenza per l'espressione proteica utilizzando un sistema di espressione nei mammiferi. Questo sistema supporta la selettività degli amminoacidi, la marcatura selettiva delle proteine e i modulatori di piccole molecole della composizione dei glicani.

High Yield Espressione di proteine ​​ricombinanti umane con il Transient Trasfezione delle cellule HEK293 in sospensione

Nonlytic sistemi di espressione di cellule di insetto sono sottoutilizzate per la produzione, il traffico cellulare / localizzazione, e analisi funzionale proteina ricombinante. Qui, descriviamo metodi per generare vettori di espressione e successiva espressione proteica transiente in cellule lepidotteri disponibili in commercio. La co-localizzazione di Bemisia tabaci acquaporine con proteine marker fluorescenti subcellulare è anche presentato.

Espressione transitoria e Localizzazione cellulare di proteine ​​ricombinanti in cellule in coltura per insetti

Le analisi biochimiche e strutturali delle proteine glicosilate richiedono relativamente grandi quantità di campioni omogenei. Qui, presentiamo un efficiente metodo chimico per site-specific glicosilazione delle proteine ricombinanti purificate da batteri prendendo di mira i tioli reattivi di Cys.

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Questo metodo per la prima volta descrive procedure sperimentali affidabili per la produzione di proteina ricombinante privo di metanolo viscoelastica efficiente in Pichia pastoris (Komagataella phaffii), che impiegano i promotori di fonte regolata di carbonio P DCe PDF  negli esperimenti su piccola scala durante la coltivazione, i parametri possono essere monitorati online e un feed di glicerolo costante viene applicato.

Metanolo espressione indipendente di Pichia Pastoris che impiegano tecnologie di-repressione

Il baculovirus expression vector system (BEVS) è una solida piattaforma per lo screening dell'espressione e la produzione di proteina arginina metiltransferasi (PRMT) da utilizzare per studi biochimici, biofisici e strutturali. Quantità di milligrammo di materiale possono essere prodotte per la maggior parte dei PRMT e di altre proteine di interesse che richiedono una piattaforma di espressione eucariotica.

Produzione di proteine PRMT ricombinanti utilizzando il baculovirus Expression Vector System

Questo protocollo descrive i passaggi essenziali per condurre campagne di selezione della superficie del lievito per arricchire le varianti proteiche che si legano a un antigene di interesse.

Ingegneria delle proteine mediante display superficiale del lievito

Impara l'espressione di proteine ricombinanti nel lievito metilotrofo Pichia pastoris. Questo metodo include la preparazione di cellule elettrocompetenti, la trasformazione del vettore e l'analisi Western blot per la rilevazione proteica.

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