Name: Fertilizzazione Ovociti di Xenopus Utilizzando il metodo di trasferimento Host (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Impara la fertilizzazione di ovociti Xenopus con il metodo di trasferimento host. Questa tecnica consente di ottenere embrioni da ovociti manipolati in coltura per studi di biologia dello sviluppo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori desiderano grazie ai membri del laboratorio di Houston per la lettura critica del manoscritto. La ricerca è supportata dal National Institutes of Health (GM083999) assegnato a DWH

1. La rimozione chirurgica del tessuto dell&#39;ovaio <ol class="lalpha"><li> Preparare un lotto fresco di media cultura ovocita (OCM; Materiali), tra 400-800 ml a seconda delle dimensioni dell&#39;esperimento. Regolare il pH a 7,6-7,8, fino a quando il rosso fenolo trasforma un colore rosso scuro (sei o giù di piccole gocce di NaOH 5N). Versare una piccola quantità di controllare il pH in un tubo a parte in quanto l&#39;elettrodo pH può contaminare i media. OCM deve essere conservato a 18 ° C e utilizzata entro una settimana. </li><li> Seleziona 3-5 femmine e posto uno in ~ 2L soluzione tamponata anestetico (Materiali). Cerchiamo di evitare di usare le rane che sono stati alimentati il ​​giorno o prima di un intervento chirurgico. Mentre la rana è cedere alla anestetico, disinfettare l&#39;area chirurgica con il 70% EtOH e preparare gli strumenti chirurgici. </li><li> Sterilizzare gli strumenti chirurgici da parte di 20 secondi l&#39;immersione in uno sterilizzatore a caldo cordone a 250 ° C. I seguenti strumenti dovrebbero essere a portata di mano: manico bisturi (# 3) e la lama (# 10 o 11), diverse paia di Dumont pinze, forbici iris Bonn (curve o diritte), Halsey o Olsen-Hegar titolare micro aghi e suture. Luogo sterilizzati strumenti su piastra di Petri sterile o all&#39;interno del pacchetto di sutura per tenere sterile. Afferrare l&#39;ago nel porta-aghi con l&#39;orientamento desiderato prima di iniziare. Noi preferiamo Olsen-Hegar porta-aghi in quanto il manico contiene lame a forbice, che può essere usato per tagliare suture senza strumenti di commutazione. </li><li> Dopo 10 minuti, verificare che un aereo di anestesia chirurgica è stato raggiunto. Rane anestetizzato smetterà di muoversi e non risponde a un pizzico piedi o di essere capovolta. Anestesia dovrebbe durare 15 minuti, che è più che abbastanza tempo per eseguire le operazioni. Don abbigliamento adeguato chirurgico. Questo può includere guanti puliti (non-lattice), camici e mascherine chirurgiche, a seconda delle preferenze personali e istituzionali le linee guida la cura degli animali. </li><li> Nota sulla tecnica asettica: le secrezioni della pelle Frog contengono peptidi antimicrobici che in genere riducono l&#39;incidenza di contaminazione durante l&#39;intervento chirurgico, anche se la tecnica asettica deve essere seguita il più possibile. Teli chirurgici può essere utilizzato, ma non può essere richiesto da IACUCs istituzionali e non può fornire molto beneficio. Generalmente &quot;tecnica punta&quot; usato, dove le mani toccano le punte sterili del, materiale di sutura strumenti o sito di incisione. Gli strumenti possono essere risterilizzati (nello sterilizzatore tallone) incisione a seguito della pelle, e una zona sterile dovrebbe essere mantenuta sul bancone per gli strumenti che mette (come una capsula di Petri o un pacchetto di sutura). Requisiti istituzionali possono differire in modo significativo, quindi seguire le linee guida le vostre istituzioni &#39;e di ricevere adeguate istruzioni prima di eseguire interventi chirurgici. </li><li> Rimuovere la rana da anestetico e posto in decubito dorsale su un chirurgico umido pulire. Nota. La pelle può essere pulito con il risciacquo di iodio povidine diluito (1:20) o clorexidina (0,75%). Tuttavia, evitare commerciale scrub chirurgico, saponi e il 70% di alcol isopropilico, poiché possono danneggiare la pelle delicata di anfibi. </li><li> Usando un bisturi, forbici o piccoli iris, fare un piccolo (1 - 1,5 cm) incisione nella pelle nella parte inferiore dell&#39;addome, laterale alla linea mediana. Incisioni successive sulla stessa rana deve essere eseguita su lati alterni, ben distanziati gli uni dagli altri. Le incisioni possono essere effettuate sia parallela o perpendicolare alla linea mediana. </li><li> Rendere la pelle e le incisioni dei muscoli addominali in due fasi. Dopo il taglio della pelle, sollevare lo strato muscolare e circonda di colore bianco fascia con una pinza e fare l&#39;incisione nel muscolo sollevato. Usare le forbici e tagliare verso il basso, cercare di fare un taglio rapido per esporre le cavità del corpo lasciando margini della ferita pulita. Se solo la fascia è tagliata, si rientra e renderanno più difficile la sutura. Sollevare il muscolo evitare inavvertitamente ferire qualsiasi organi interni. Inoltre, cercare di evitare il taglio tramite qualunque cuori linfatici visibili o vasi sanguigni all&#39;interno degli strati muscolari. Estendere la lunghezza con le forbici del taglio in modo che ovaie possono essere facilmente tirato attraverso. </li><li> Ovaio deve essere chiaramente visibile una volta che l&#39;incisione viene fatta. Per procurarsi i ovaio, afferrare con una pinza e esternare il tessuto ovarico. La quantità desiderata di tessuto viene rimosso e rifilata a livello della parete del corpo. Non roba del tessuto indietro nella cavità celomatica, in quanto ciò potrebbe essere fonte di infezioni o altre complicazioni. </li><li> Subito osservare un piccolo pezzo di ovaio sotto un microscopio da dissezione e defolliculate uno ovociti pochi per testare la loro qualità. Essi dovrebbero essere fermi e di dimensioni uniformi e colorazione. Se sono accettabili, rimuovere la quantità desiderata di tessuto ovarico e suturare l&#39;incisione. Abbastanza per riempire un 90 millimetri piatto di Petri è solitamente sufficiente per la maggior parte degli esperimenti. Se gli ovociti sono di qualità discutibile, sutura la rana e ripetere con una donna diversa. </li><li> Chiudere l&#39;incisione di sutura il muscolo e lo strato prima fascia. Inserire il n<html> eedle pochi millimetri laterale per l&#39;incisione, avendo cura di passare attraverso lo strato di fascia pure. Suture solo attraverso il muscolo può strappare il tessuto e allentarsi. Usare pinze per inserire l&#39;ago da sotto sul lato opposto della incisione. Rilascio e ri-comprendere l&#39;ago dall&#39;esterno del corpo e tirare la sutura attraverso fino a diversi centimetri o giù di lì della coda rimane, facendo attenzione a non tirarlo fino in fondo. </li><li> Chiudere la ferita con un semplice modello interrotto di sutura. Usiamo un legame fondamentale strumento per rendere chirurgo nodi quadrati (nodi scogliera). Anello l&#39;estremità lunga della sutura intorno al titolare ago, afferrare la coda e tirarlo attraverso il ciclo verso di voi e stringere. Loop e tirare attraverso, questa volta tirare il titolare ago lontano da voi. Un terzo lancio può essere utilizzato per una maggiore sicurezza (nella stessa direzione del primo). Tagliare la sutura, lasciando la coda corta e farne un&#39;altra sutura nel muscolo pochi millimetri di distanza. Due punti di sutura sono sufficienti per piccole suture, tre per quelle più grandi. Ripetere l&#39;operazione per lo strato di pelle. Dimostrazioni video della tecnica di sutura di base sono disponibili su YouTube - la ricerca di &quot;legare strumento&quot;, ci sono un bel po &#39;tra cui scegliere, anche se la tecnica di base è la stessa. </li><li> Risciacquare la femmina con acqua deionizzata e metterla in un secchio pieno di recupero fresco (18 ° C). Mentre in laboratorio, le rane sono tenuti in acqua di rubinetto trattata con Amquel per rimuovere clorammine. Ogni pochi minuti, sollevare delicatamente la rana dall&#39;acqua e cercare ingoiare o occhi sporgenti movimenti, indicative di ripresa dall&#39;anestesia. </li><li> Nota: Chirurgia La sopravvivenza non è strettamente necessario per ottenere tessuto ovarico, anche se le femmine continuerà a produrre ovociti buoni dopo un certo numero di operazioni. L&#39;esecuzione di interventi chirurgici sopravvivenza anche ridurre il numero degli animali utilizzati. Assicurati di seguire le linee guida dell&#39;unità di cura degli animali sui metodi di vertebrati chirurgia sopravvivenza, post-op cura e monitoraggio e per numero di interventi chirurgici ammessi su un individuo. </li></ol> 2. Coltura e oociti Defolliculating <ol class="lalpha"><li> Subito dopo l&#39;intervento è terminato, suddividere l&#39;ovaio in piccoli pezzi (circa 2 cm 2) e conservare in OCM fresco, con 5-6 pezzi al piatto 90 mm. Lobi individuali di ovaio vengono tagliati aperti, appiattita e tagliate a pezzi quadrati. Questi sono risciacquati in OCM pulito e messo in piatti per la cultura. Appiattimento e dividendo l&#39;ovaio estenderà la sua vita di cultura e di rendere più facile defolliculation. </li><li> Spostare un lobo di un piccolo piatto di OCM e manualmente defolliculate 300-500 ovociti. Ovociti mediante trasferimento sterile, fuoco lucido pipetta. Abbiamo scoperto che utilizzando il cotone collegato varietà è essenziale per minimizzare la contaminazione delle culture. Conservare gli ovociti a 18 ° C in 8 mL OCM (in piatti di media (Falcon 1007)) in gruppi di 100-150. Con la pratica, si dovrebbe essere in grado di defolliculate ovociti abbastanza in 1-2 ore. Ovociti Collagenased non sono adatti per il trasferimento di ospitare in quanto non è fertilizable. </li><li> Defolliculating metodo. Noi defolliculate con pinze (Dumont o # # 4s 5s, Strumenti Scienza Fine) orologiai &#39;, seguendo i metodi descritti in base Smith et al., (1991). Utilizzando un paio di pinze (in mano dominante), afferrare la teca strato di tessuto connettivo che circonda un adulto ovocita VI tappa vicino a dove il follicolo è collegato l&#39;ovaio (il gambo). Con l&#39;altra coppia di pinze, afferrare l&#39;ovaio adiacente alla prima coppia. Leggermente lacerare lo strato follicolo tirando attraverso l&#39;ovocita. Delicatamente stuzzicare l&#39;ovocita fuori del tessuto. Ovociti con successo defolliculated sono floppier di ovociti semplicemente tirato fuori senza rimuovere lo strato follicolo e sarà priva di vasi sanguigni visibili. </li><li> Nota: E &#39;essenziale per mantenere la pressione molto leggera sulle punte della pinza, appena sufficiente per le punte di incontrare. Serraggio troppo stretto è un comune tra i principianti e comporterà l&#39;ovocita di essere tirato via con il follicolo intatto. Mantenere un buon paio di pinze in esclusiva per defolliculating. Le punte devono soddisfare in modo preciso e dovrebbe essere leggermente più schietto pinze per fare espianti da embrioni di Xenopus (Figura 1). </li><li> Noi abitualmente prova matura circa 20 con progesterone e interrompere l&#39;esperimento se il tasso di maturazione è scarsa (&lt;50% dopo 6-7 ore a temperatura ambiente). </li><li> A questo punto, gli ovociti possono essere manipolati e colto come desiderato, come la microiniezione di oligo, morfolino o mRNA. Procedure di iniezione variare in base alla laboratorio, in modo da non descrivere quei qui. Ovociti può essere mantenuta fino a una settimana di OCM, ma in generale la salute declina quindi è meglio usarli per il trasferimento entro 96 ore di isolamento. </li><li> Tenete presente che solo cinque a sei gruppi (tra cui un controllo) possono essere trasferiti su una singola femmina, a causa di limitazioni di coloranti vitali, in modo da pianificare la sperimentazione di conseguenza. </li></ol>&quot;&gt; 3. Maturazione degli ovociti e la stimolazione di femmine ospitanti <ol class="lalpha"><li> Se si esegue un salvataggio di esaurimento oligo, iniettare il mRNA (di solito 5-30 pg di RNA) ~ 24-48 ore dopo l&#39;oligo. L&#39;oligo avrà degradata da questo momento e non dovrebbe incidere sulla RNA iniettato. </li><li> La sera prima di eseguire il trasferimento, aggiungere 16 ml di soluzione di progesterone di lavoro (1 mm di EtOH) di ovociti in 8 OCM mL in piatti di mezzo (concentrazione di progesterone finale è ~ 2 mM). Incubare per 10-12 ore a 18 ° C per consentire la maturazione degli ovociti. </li><li> Iniettare 3-5 femmine con 1000 unità per rana di hCG per indurre la deposizione delle uova. I nostri esperimenti sembrano funzionare meglio se la maturazione degli ovociti e l&#39;iniezione di hCG sono fatte nello stesso periodo, circa 12 ore prima dell&#39;impianto nell&#39;ospite (ad esempio, 22:00 AM -10). Lascia femmine a RT o 18 ° C durante la notte. </li></ol> 4. Preparazione e colorazione colorante vitale di ovociti <ol class="lalpha"><li> La mattina del trasferimento, permettono ~ 45-60 &#39;a impostare ed eseguire la procedura. A questo punto, gli ovociti maturi possono essere congelati per una successiva analisi dell&#39;efficacia del knockdown mRNA o espressione della proteina. Inoltre, controllare che gli ovociti non sono stati infettati e che c&#39;era un buon tasso di maturazione (&gt; 50%). Ovociti infetto non si fecondano. Scongelare coloranti vitali (Materiali) e far girare a velocità massima per 5 min. </li><li> Colori diversi gruppi sperimentali con l&#39;aggiunta di 80 ml di colorante appropriato vitale (s) ai piatti ovocita e incubare con dondolo per 15 &#39;. Durante questo periodo, selezionare una femmina ospite e iniziare l&#39;anestesia. Scegli una rana che sta lentamente le uova in modo normale o quella che produce le uova con abbondante spremitura mite. Uova dal host deve essere di buona qualità. Evitare di femmine che gettano le stringhe di uova o uova schiacciati. </li><li> Trasferire le uova colorate di un grande piatto di OCM fresca, agitare brevemente di lavare e metterle da parte prima del trasferimento. </li><li> Preparare una pipetta Pasteur sterile, con un alesaggio ampio abbastanza da ospitare un ovocita (~ 1,5 mm) per l&#39;utilizzo in trapiantare gli ovociti. Punteggio ottenuto la pipetta con una matita diamante e rompere pulito. Fuoco fino a lucidare i bordi sono lisce, facendo attenzione a non sciogliere l&#39;apertura. </li></ol> 5. L&#39;esecuzione del trapianto degli ovociti <ol class="lalpha"><li> Trapianto ovocita utilizza le stesse procedure chirurgiche, come descritto nella parte I, anche se invece di rimuovere ovaie, gli ovociti vengono manipolati inserito nella cavità del corpo con una pipetta. Idealmente, la procedura di trasferimento deve essere eseguita il più rapidamente possibile e la dimensione dell&#39;incisione deve essere mantenuto il più piccolo possibile. </li><li> Anesthesize la femmina ospite e preparare gli strumenti chirurgici, come descritto nella parte I. Marca e incisione, come descritto nella parte I. L&#39;incisione può essere più piccolo, ma deve essere grande abbastanza da contenere il foro della pipetta di trasferimento (Figura 2A). </li><li> Per il trapianto di ovociti, afferrare e sollevare un lembo di muscolo e fascia con una pinza e introdurre gli ovociti sperimentale utilizzando la pipetta Pasteur preparato in precedenza. Agitare il piatto di ovociti per raccoglierli nel centro e succhiare il maggior numero possibile. Lasciare gli ovociti di stabilirsi nella fine della pipetta per evitare che il liquido in eccesso di essere introdotto e inserire la punta della pipetta in incisione e lentamente permettere gli ovociti di filo nella cavità del corpo (Figura 2B). Ripetere fino a quando tutti gli ovociti sono stati trasferiti. Non rilasciare lo strato muscolare in qualsiasi momento, fino a quando non hanno iniziato sutura, o gli ovociti saranno fuoriuscite di incisione. </li><li> Una volta che gli ovociti sono stati trasferiti, afferrare entrambi i lati della ferita con una pinza e metterli insieme, permettendo al ovociti di stabilirsi nella cavità del corpo. Iniziare la sutura come descritto, avendo cura di mantenere la tensione verso l&#39;alto sul muscolo e fascia fino al primo nodo è legato (Figura 2C). Ciò manterrà gli ovociti di essere espulsi e consentirà ai bordi della ferita per guarire in modo uniforme. Aggiungere un altro sutura nel muscolo / fascia livello e poi sutura la pelle. </li><li> Risciacquare la femmina con acqua deionizzata e metterla in un secchio pieno di recupero raffreddata (18 ° C) Amquel trattati con acqua. Monitorare il suo recupero dall&#39;anestesia come sopra. Lei dovrebbe iniziare le uova normalmente dopo l&#39;operazione. </li><li> Ottenere testicoli da una rana maschio con le normali procedure. Conservare i testicoli nella OCM o L15 fino al momento dell&#39;uso. Noi preferiamo testicolo fresco quando la concimazione esperimenti di trasferimento. </li></ol> 6. Recupero degli ovociti e la fecondazione in vitro <ol class="lalpha"><li> Ciglia peritoneale guiderà le uova trasferiti (e normale uova celomatica dell&#39;ospite) per le aperture dei ovidotti nella parte anteriore della cavità del corpo. Uova colorate possono essere recuperati all&#39;inizio 2-3 ore dopo il trasferimento dalla spremitura normale. Le uova possono essere ottenuti ogni mezz&#39;ora o giù di lì fino a quando la donna smette di posa. </li><li> Fertilizzare in una spesospensione rm (in ~ 4 mL 1x MMR) per 4 minuti. Flood e risciacquare a lungo con MMR 0.1x. Le uova dovrebbero attivare normalmente e inizierà a fendere ~ 1,5-2 ore dopo la fecondazione. Uova trasferiti spesso unirà poco più tardi le uova di accoglienza. </li><li> Rimuovere le mani gelatina con cisteina come embrioni normali e ordinare in piatti separati. Questo può essere fatto in qualsiasi momento, a seconda delle esigenze dell&#39;esperimento. E di solito più facile identificare i vari colori intorno al 4-celle palco e più difficili durante le fasi finali blastula. Cultura le uova a bassa densità (&lt;50 per piatto medio) in pulito MMR 0.1x. Da questo punto, gli embrioni possono essere trattati e manipolati normalmente. </li><li> Ritorna le rane alla struttura animale e monitor per le complicazioni nei prossimi giorni. </li><li> Fecondazione metodo alternativo; deposizione delle uova nel buffer di sale <ol class="lroman"><li> Dopo la rana si è ripreso dall&#39;anestesia, il suo posto in ~ 1L alto sale MMR (1,2 x). Lasciare che la femmina a deporre le uova nel buffer per circa 4-6 ore. Spremere le uova restanti, scolarli MMR 1.2x e ordinare uova colorate nel piatto pulito; rimuovere tutto il liquido possibile. </li><li> Lavare a lungo con MMR 0.3x e fertilizzare in volume minimo di 0.3x MMR / sperma sospensione fino attivare uova (10 minuti). Flood con MMR 0.1x e la cultura come sopra. Questa opzione è utile se le uova sono necessarie molte nella stessa fase o se la spremitura manuale di uova danni degli ovociti donatore. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Brun, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+maturation+in+vitro%3A+contribution+of+the+oviduct+to+total+maturation+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Oocyte maturation in vitro: contribution of the oviduct to total maturation in Xenopus laevis.</a> Experientia. 31, 1275-1276 (1975).</li>
<li>Elinson, R. P., Pasceri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+UV-sensitive+targets+in+dorsoanterior+specification+of+frog+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Two UV-sensitive targets in dorsoanterior specification of frog embryos.</a> Development. 106, 511-518 (1989).</li>
<li>Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C., C, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+of+cultured+Xenopus+oocytes+and+use+in+studies+of+maternally+inherited+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules.</a> Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).</li>
<li>Holwill, S., Heasman, J., Crawley, C., Wylie, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axis+and+germ+line+deficiencies+caused+by+u.v+irradiation+of+Xenopus+oocytes+cultured+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Axis and germ line deficiencies caused by u.v irradiation of Xenopus oocytes cultured in vitro.</a> Development. 100, 735-743 (1987).</li>
<li>Houston, D. W., King, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+Xdazl%2C+a+germ+plasm-localized+RNA%2C+in+the+differentiation+of+primordial+germ+cells+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A critical role for Xdazl, a germ plasm-localized RNA, in the differentiation of primordial germ cells in Xenopus.</a> Development. 127, 447-456 (2000).</li>
<li>Mir, A., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+mother+can+help%3A+studying+maternal+Wnt+signaling+by+anti-sense-mediated+depletion+of+maternal+mRNAs+and+the+host+transfer+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">How the mother can help: studying maternal Wnt signaling by anti-sense-mediated depletion of maternal mRNAs and the host transfer technique.</a> Methods Mol Biol. 469, 417-429 (2008).</li>
<li>Rugh, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRugh%2C+R+%22Experimental+Embryology%3A+Techniques+and+procedures%22">Experimental Embryology: Techniques and procedures</a>. , Burgess. Minneapolis, MN. (1962).</li>
<li>Smith, L. D., Ecker, R. E., Subtelny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+induction+of+physiological+maturation+in+Rana+pipiens+oocytes+removed+from+their+ovarian+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro induction of physiological maturation in Rana pipiens oocytes removed from their ovarian follicles.</a> Dev Biol. 17, 627-643 (1968).</li>
<li>Smith, L. D., Xu, W., Varnold, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis+and+oocyte+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Oogenesis and oocyte isolation.</a> Methods Cell Biol. 36, 45-60 (1991).</li>
<li>Woolf, T. M., Jennings, C. G., Rebagliati, M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stability%2C+toxicity+and+effectiveness+of+unmodified+and+phosphorothioate+antisense+oligodeoxynucleotides+in+Xenopus+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The stability, toxicity and effectiveness of unmodified and phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotides in Xenopus oocytes and embryos.</a> Nucleic Acids Res. 18, 1763-1769 (1990).</li>
<li>Wylie, C., Kofron, M., Payne, C., Anderson, R., Hosobuchi, M., Joseph, E., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+beta-catenin+establishes+a+%27dorsal+signal%27+in+early+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Maternal beta-catenin establishes a 'dorsal signal' in early Xenopus embryos.</a> Development. 122, 2987-2996 (1996).</li>
<li>Zhang, J., Houston, D. W., King, M. L., Payne, C., Wylie, C., Heasman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+maternal+VegT+in+establishing+the+primary+germ+layers+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The role of maternal VegT in establishing the primary germ layers in Xenopus embryos.</a> Cell. 94, 515-524 (1998).</li>
<li>Zuck, M. V., Wylie, C. C., Heasman, J. Maternal mRNAs in Xenopus embryos: an antisense approach.. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZuck%2C+MV+%22A+comparative+methods+approach+to+the+study+of+oocytes+and+embryos%22">A comparative methods approach to the study of oocytes and embryos</a>. Richter, J. D. , Oxford University Press. Oxford. 341-354 (1998).</li>
</ol>

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dall&#39;Università di Iowa IACUC Comitato.

Un trasferimento di successo si tradurrà in fertilizzazione e scissione normale&gt; 50% degli ovociti (Figura 3). Generalmente tra 30-60% degli ovociti trasferiti sopravviverà passato le fasi neurula. Di solito il trasferimento 75-150 ovociti per ogni gruppo sperimentale, che sarà resa embrioni sufficiente per diversi tipi di analisi (in situ, RT-PCR), così come visualizzare il fenotipo. L'impianto di ovociti sostanzialmente più non sembra aumentare notevolmente la resa. Inoltre, almeno 30 ovociti per ogni gruppo dovreb...

Soluzioni e ricette: OCM (terreno di coltura degli ovociti; modificato da Wylie et al, 1996). <table border="0"><tbody><tr><td> 70% di L-15 a medio Leibovitz (contenente l-glutammina) </td><td> (Invitrogen 11415-064) </td></tr><tr><td> 0,4 mg / ml di albumina sierica bovina (BSA; V frazione) </td><td> (Sigma A-9418-50g) </td></tr><tr><td> 1x penicillina-streptomicina </td><td> (Sigma P-0781) </td></tr><tr><td colspan="2"> Aggiustare il pH a 7,6-7,8 con 5N NaOH </td></tr><tr><td colspan="2"> Fai fresca settimanale, conservare a 18 ° C. </td></tr></tbody></table> 10X MMR (Soluzione di Marc modifica di Ringer;. Zuck et al, 1998) <table border="0"><tbody><tr><td> 1M NaCl </td></tr><tr><td> 20 mM KCl </td></tr><tr><td> 20 mM CaCl 2 </td></tr><tr><td> 10 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> 150 mM HEPES </td></tr><tr><td> regolare a pH 7,6-7,8 </td></tr><tr><td> Conservare a 4 ° C </td></tr></tbody></table> Anestetico soluzione <table border="0"><tbody><tr><td> 1 g / L 3-Aminobenzoic di etile (MS222) </td><td> (Sigma A-5040) </td></tr><tr><td colspan="2"> 0,7 g / l di sodio bicarbonato </td></tr><tr><td colspan="2"> Sciogliere in Amquel trattati con acqua </td></tr><tr><td colspan="2"> Fai fresca settimanale </td></tr></tbody></table> Progesterone scorte <table border="0"><tbody><tr><td> Progesterone 10 mM (Sigma P-0130) in 100% etanolo </td></tr><tr><td> Diluire a 1 mm di EtOH 100% per uno stock 500x / soluzione di lavoro </td></tr><tr><td> Conservare a -20 ° C </td></tr></tbody></table> Coloranti vitali (modificato da Heasman et al., 1991) <table border="0"><tbody><tr><td> Blu: 0,1% Nilo Azzurro A </td><td> (Aldrich 121479-5G), </td></tr><tr><td> Rosso: 0,25% Rosso neutro </td><td> (Sigma N-6634), </td></tr><tr><td> Marrone: 1% Bismarck Brown </td><td> (Sigma B-2759), </td></tr><tr><td colspan="2"> Verde (80 microlitri blu + 80 microlitri marrone), </td></tr><tr><td colspan="2"> Mauve (80 microlitri blu + 80 rosso microlitri). </td></tr><tr><td colspan="2"> Un colore sesto, arancione (80 + 80 microlitri rosso bruno microlitri), possono essere utilizzati, ma è spesso difficile da distinguere da marrone. </td></tr></tbody></table> Gli stock di blu, rosso e Brown sono preparati in acqua deionizzata a 50 ml provette, incubate per 20 minuti con dondolo e filato in una centrifuga clinica. I surnatanti sono aliquotted in provette da microcentrifuga e conservati a -20 ° C.

fertilizzazione ovociti di xenopus utilizzando il metodo di trasferimento host

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Studiare il contributo di molecole ereditato dalla madre di vertebrati sviluppo precoce è spesso ostacolata dal tempo e la spesa necessaria per generare animali materno-effetto mutante. Inoltre, molte delle tecniche di iperespressione o inibire la funzione dei geni negli organismi come Xenopus zebrafish e non riescono a bersaglio sufficientemente critico le vie di segnalazione della madre, come il segnale Wnt. In Xenopus, manipolando la funzione dei geni negli ovociti in coltura e la loro successiva concimazione può migliorare questi problemi in una certa misura. Ovociti vengono manualmente defolliculated dal tessuto del donatore ovaio, iniettati o trattati in cultura come desiderato, quindi stimolati con progesterone per indurre la maturazione. Successivamente, gli ovociti vengono introdotti nella cavità del corpo di una rana ospitare l&#39;ovulazione femminile, dopo di che verrà traslocato attraverso ovidotto del padrone di casa ed acquisire le modifiche e cappotti gelatina necessaria per la fecondazione. Gli embrioni risultanti possono essere elevato alla scena desiderata e analizzati gli effetti di eventuali perturbazioni sperimentale. L&#39;host di trasferimento metodo è stato molto efficace nello scoprire i meccanismi fondamentali dello sviluppo precoce e consente una vasta gamma di possibilità di sperimentazione non disponibile in qualsiasi altro organismo modello vertebrato.

Procedura per la concimazione<em&gt; Ovociti di Xenopus</em&gt; Con il metodo del trasferimento di accoglienza.

Fertilizzazione Ovociti di Xenopus Utilizzando il metodo di trasferimento Host

Lo studio del contributo delle molecole ereditate per via materna allo sviluppo precoce dei vertebrati è spesso ostacolato dal tempo e dai costi necessari per...

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere embrioni in via di sviluppo derivati da siti OO che sono stati manipolati in coltura. Questo risultato si ottiene innanzitutto isolando i siti donatori da una femmina e manipolandoli secondo le necessità in coltura. Il secondo passaggio della procedura consiste nel stimolare questi citi a maturare mediante progesterone e nel iniettare femmine ospiti potenziali con gonadotropina per indurre la deposizione delle uova.Il terzo passaggio della procedura consiste nella colorazione delle cellule donatrici con coloranti vitali e nella preparazione di una femmina da utilizzare come ospite. L'ultimo passaggio della procedura prevede il trasferimento chirurgico delle cellule donatrici nella cavità corporea dell'ospite e, alcune ore dopo, il recupero e la fecondazione delle uova trasferite. Alla fine, embrioni che si dividono normalmente derivati dalle cellule donatrici sottoposte a manipolazione sperimentale.Le citi possono essere ottenute e analizzate esattamente come gli embrioni normali. Ciao, sono Doug Houston dell'Università dell'Iowa. Oggi siamo al corso Xap di Cold Spring Harbor per mostrarvi come eseguire la procedura di trasferimen

fertilization-of-xenopus-oocytes-using-the-host-transfer-method

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Le uova di Xenopus laevis intatto, lisate, e / o frazionato sono utili per una vasta gamma di esperimenti. Questo protocollo mostra come indurre deposizione delle uova, raccogliere e dejelly le uova, e ordinare le uova per rimuovere tutte le uova danneggiate.

Ottenere uova da Xenopus laevis Femmine

Qui mostriamo microiniezione citoplasmatica...

Microiniezione degli ovociti di Xenopus Laevis

Xenopus embrionale epiteli sono un sistema modello ideale per studiare i comportamenti delle cellule, come lo sviluppo di polarità e cambiare forma durante la morfogenesi epiteliale. Istologia tradizionale di campioni fisso è sempre più integrato da live-cell imaging confocale. Qui mostriamo metodi per isolare i tessuti rana e visualizzare dal vivo le cellule epiteliali e le loro citoscheletro con live-cell microscopia confocale.

Live-cell imaging e analisi quantitativa della embrionali in cellule epiteliali Xenopus laevis</em

Questo protocollo video illustra un metodo per la generazione di...

Produzione di transgenici Xenopus laevis Integrazione mediata da enzima di restrizione e trapianto nucleare

Xenopus ectoderma embrionale è diventato un modello attraente per gli studi di polarità cellulare. Un saggio è descritta, in cui la distribuzione subcellulare delle proteine ​​fluorescenti è valutata in cellule ectoderma. Questo protocollo aiuterà a trattare questioni relative al controllo spaziale della segnalazione.

Traslocazione polarizzato di proteine ​​fluorescenti in Xenopus</emEctoderma> in risposta alla segnalazione Wnt

Una tecnica per il trapianto "Extreme anteriore dominio" dei tessuti del viso tra Xenopus laevis embrioni è stato sviluppato. Tessuto può essere spostato da un gene espressione sfondo in un'altra, permettendo lo studio delle esigenze locali di sviluppo craniofacciale e di segnalazione interazioni tra regioni facciali.

Trapianti viso a<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embrioni

Descriviamo i metodi di manipolazione degli ovociti immaturi di Xenopus laevis, la maturazione in vitro degli ovociti in ovuli e l'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi. Questo protocollo consente la degradazione di alcune proteine materne e la sovraespressione di geni di interesse alla fecondazione, e quindi è prezioso per studiare il ruolo di fattori specifici nello sviluppo embrionale precoce.

Manipolazione e<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturazione di<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; ovociti, seguito da Iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi, per studiare lo sviluppo embrionale

Descriviamo un sistema di ovociti e cappucci animali di Xenopus per il clonaggio dell'espressione di geni in grado di indurre una risposta in un ectoderma competente, e discutiamo le tecniche per la successiva analisi di tali geni. Questo sistema è utile nell'identificazione funzionale di un'ampia gamma di prodotti genici.

Clonazione funzionale utilizzando un<em&gt; Xenopus</em&gt; Ovociti Expression System

Vengono descritte procedure ottimizzate per l'isolamento di singoli follicoli, microiniezioni di RNA citoplasmatico, rimozione degli strati cellulari circostanti ed espressione proteica negli ovociti di Xenopus. Inoltre, viene presentato un metodo semplice per cambi rapidi di soluzione in esperimenti elettrofisiologici con canali ionici ligando-dipendenti.

Xenopus ovociti: Metodi ottimizzate per microiniezione, la rimozione di strati di cellule follicolari e cambiamenti soluzione veloce in esperimenti di elettrofisiologia

Questo protocollo dimostra un metodo basato su fluorescenza per visualizzare la vascolarizzazione e per quantificare la sua complessità in Xenopus tropicalis . I vasi sanguigni possono essere immagazzinati minuti dopo l'iniezione di un colorante fluorescente nel cuore battente di un embrione dopo manipolazioni genetiche e / o farmacologiche per studiare lo sviluppo cardiovascolare in vivo .

Visualizzazione e analisi quantitativa di angiogenesi embrionale in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Geni essenziali per la sopravvivenza pongono ostacoli tecnici per la creazione di linee mutanti. Rincorsa aggira la letalità combinando genoma editing con trapianto di cellule germinali primordiali per creare animali portatori di mutazioni di germline. Rincorsa consente anche la generazione efficiente di omozigoti mutanti nella generazione1 F. Qui, il passo di trapianto è dimostrato.

Trapianto di cellule germinali primordiali per basati su CRISPR/Cas9 rincorsa in Xenopus

Impara la fertilizzazione di ovociti Xenopus con il metodo di trasferimento host. Questa tecnica consente di ottenere embrioni da ovociti manipolati in coltura per studi di biologia dello sviluppo.

Fertilizzazione Ovociti di Xenopus Utilizzando il metodo di trasferimento Host

Esplora altri video