Fertilizzazione Ovociti di Xenopus Utilizzando il metodo di trasferimento Host

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere embrioni in via di sviluppo derivati da siti OO che sono stati manipolati in coltura. Ciò si ottiene isolando prima i siti di donatrice oo da una femmina e manipolandoli come desiderato nella cultura. Il secondo passo della procedura consiste nello stimolare questi citi a maturare utilizzando il progesterone e nell'iniettare gonadotropina alle potenziali femmine ospiti per stimolare la deposizione degli ovuli.

Il terzo passo della procedura consiste nel colorare i citi del donatore con legami vitali e preparare una femmina a fungere da ospite. La fase finale della procedura consiste nel trasferire chirurgicamente i citi del donatore nella cavità corporea dell'ospite e diverse ore dopo recuperare e fecondare gli ovuli trasferiti. In definitiva, dividendo normalmente gli embrioni derivati dal donatore manipolato sperimentalmente.

I citi possono essere ottenuti e analizzati proprio come i normali embrioni. Ciao, sono Doug Houston dell'Università dell'Iowa. Oggi siamo al corso Xap di Cold Spring Harbor per mostrarti come eseguire la procedura di trasferimento dell'host.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare i ruoli dei prodotti genici materni e determinare i ruoli nello sviluppo precoce dello zap. Quindi iniziamo. Prima di iniziare l'intervento chirurgico, assicurarsi che l'area chirurgica sia disinfettata e che siano pronti terreni freschi e strumenti sterili.

Afferrare un ago da sutura nel portaaghi con l'orientamento desiderato. Posizionare una rana femmina anestetizzata sulla schiena su una salvietta chirurgica umida. Usando piccole forbici per l'iride, praticare un'incisione di un centimetro nella pelle nella parte inferiore dell'addome, lateralmente alla linea mediana.

Non tagliare il muscolo addominale. Usa una pinza per sollevare lo strato muscolare e la fascia circostante di colore bianco. Usa le forbici dell'iride per fare un singolo taglio rapido verso il basso attraverso il muscolo.

Estendere l'incisione a un centimetro esponendo l'ovaio. Usa il forcipe per afferrare l'ovaio ed estrarre un lobo. Usa le forbici per tagliare il lobo a livello della parete del corpo.

Posizionare il tessuto in un piatto da 90 millimetri contenente terreno di coltura ovocitaria o OCM per valutare immediatamente la qualità delle ovaie al microscopio da dissezione. Alcuni citi possono essere defogliati con una pinza. Se i citi sono sodi e di dimensioni e colorazione uniformi, rimuovere la quantità desiderata di tessuto ovarico dalla rana e metterla in una capsula di Petri da 90 millimetri di OCM.

Chiudere l'incisione. Inserire l'ago di qualche millimetro lateralmente all'incisione, assicurandosi che passi attraverso sia il muscolo che la fascia. Usa una pinza per manipolare l'ago, facendo attenzione a non tirare completamente la coda della sutura.

Chiudere la ferita con un semplice schema interrotto di sutura e i nodi quadrati del chirurgo. La tecnica è descritta in dettaglio nel testo di accompagnamento. Ripetere la sutura con lo strato cutaneo.

Sciacquare la femmina con acqua deionizzata e metterla in un secchio di recupero pieno di acqua fresca. Subito dopo aver terminato l'intervento chirurgico, utilizzare le forbici per suddividere l'ovaio. Tagliare i singoli lobi, appiattirli e tagliarli in pezzi quadrati di due centimetri.

Risciacquare con pulito, medio e utilizzare una pinza. Trasferire da cinque a sei pezzi su una piastra fresca da 90 millimetri di OCM per isolare i singoli citi. Inizia trasferendo uno dei pezzi in un piccolo piatto di terreno e portalo a un microscopio da dissezione.

Usa la pinza da orologiaio per mangiare manualmente da tre a 500 ovociti. Afferrare lo strato di tessuto connettivo che circonda un cita di stadio sei completamente sviluppato vicino al ceppo con un secondo paio di pinze. Afferrare l'ovaio adiacente all'ovocita con il primo paio di bps.

Tirare leggermente l'ovocita per aprire lo strato del follicolo. Estrarre delicatamente il cita dal tessuto con successo. I citi defogliati non hanno vasi sanguigni visibili e sono più flosci dei citi con follicoli intatti.

Utilizzare una pipetta di cotone lucidata a fuoco per trasferire gruppi da 100 a 150 citi in piastre di coltura da 60 millimetri contenenti otto millilitri di OCM. Conserva gli ovociti nelle loro piastre a 18 gradi Celsius. Gli ovociti possono ora essere microiniettati a piacere con oligonucleotidi antisenso o mRNA secondo un numero qualsiasi di protocolli, quindi coltivati in OCM in un incubatore a 18 gradi Celsius.

Utilizzare gli ovociti per il trasferimento entro 96 ore dall'isolamento la sera prima di eseguire il trasferimento. Incubare i citi necessari con progesterone per farli maturare a 16 microlitri di un millimolare di progesterone nel terreno contenente i citi per una concentrazione finale di due micromolari. Incubare per 10-12 ore a 18 gradi Celsius la stessa sera, iniettare da tre a cinque femmine con 1000 unità di gonadotropina corionica umana per rana per indurre la deposizione delle uova.

Lascia le femmine a temperatura ambiente o 18 gradi Celsius durante la notte la mattina del trasferimento. Controllare sotto l'oscilloscopio di dissezione per assicurarsi che i citi in coltura abbiano subito la maturazione. Haw i coloranti vitali e centrifugare a più di 10.000 Gs per cinque minuti.

Per ridurre lo sfondo dei detriti, aggiungere 80 microlitri del colorante vitale appropriato a ciascun gruppo sperimentale di ovociti. Incubare a temperatura ambiente per 15 minuti su un bilanciere. Trasferite le uova colorate in un piatto da 90 millimetri di ø cm fresco e agitatele brevemente per lavarle.

Preparare una pipetta da utilizzare per il trasferimento dei citi. Usa una matita diamantata per segnare un punto oltre la pipetta circa due centimetri sotto la parte affusolata e romperla in modo netto. Questo dovrebbe creare una pipetta con un foro di 1,5 millimetri abbastanza grande da ospitare un fuoco di ovociti.

Lucidare la punta fino a quando i bordi sono lisci senza chiudere la punta. Trapianto di ovociti. L'intervento chirurgico deve essere eseguito il più rapidamente possibile.

Praticare un'incisione come prima in una femmina anestetizzata che depone uova di buona qualità. Questa incisione dovrebbe essere della lunghezza minima richiesta per adattarsi al foro del trasferimento. Pipetta inferiore a un centimetro.

Agitare la piastra di ovociti sperimentali per raccoglierli al centro della capsula. Utilizzare la pipetta per pascoli preparata per aspirarne il maggior numero possibile. Lasciare che gli ovociti si depositino all'estremità della pipetta per ridurre al minimo la quantità di liquido trasferito alla rana.

Usa il forcipe per afferrare ed elevare un lembo di muscolo e fascia. Inserire la punta della pipetta nell'incisione e lasciare lentamente che i citi gocciolino nella cavità corporea. Ripetere il processo fino a quando tutti gli ovociti sono stati trasferiti.

Non rilasciare lo strato muscolare per evitare che gli ovociti fuoriescano dall'incisione. Usa una pinza per afferrare entrambi i lati dell'incisione e unirli, permettendo ai citi di depositarsi nella cavità del corpo. Inizia a suturare lo strato muscolare e fasciale come prima, avendo cura di mantenere la tensione verso l'alto fino a quando il primo nodo non è legato.

Sutura la pelle. Sciacquare la rana con acqua deionizzata e lasciarla riprendersi come prima. La rana dovrebbe iniziare a deporre le uova normalmente dopo l'operazione, iniziando due o tre ore dopo l'intervento.

Recupera le uova con la normale spremitura ogni mezz'ora fino a quando la femmina smette di deporre su un piatto di uova raccolte. Aggiungere quattro millilitri di una sospensione di spermatozoi appena raccolti in un XMMR e incubare a temperatura ambiente per quattro minuti. Inondare e sciacquare abbondantemente le uova a temperatura ambiente.

Punto uno XMMR incubato a temperatura ambiente per consentire l'attivazione e la scissione. Usa la cisteina in qualsiasi momento per rimuovere i codici di gelatina. Gli embrioni trasferiti possono quindi essere smistati in piatti separati a seconda del colore e coltivati come embrioni normali.

In genere, più di due terzi delle uova trasferite si attivano entro pochi minuti dalla fecondazione, mostrando una robusta contrazione corticale al polo animale. Nella maggior parte degli esperimenti, oltre la metà degli ovuli trasferiti subirà una prima scissione normale. A volte la scissione sarà ritardata di circa 20 minuti rispetto alle uova dell'ospite nelle nostre mani.

Dal 30 al 60% degli embrioni trasferiti passa normalmente alla luce gastroenterica e sopravvive oltre lo stadio neurale. Gli embrioni trasferiti manterranno il loro colore vitale per molti giorni di sviluppo. Gli embrioni derivati da citi di controllo non iniettati appariranno normali come previsto.

Al contrario. Gli embrioni derivati da ovociti iniettati con beta catina e oligo antisenso, ad esempio, avranno un aspetto centralizzato. Ti abbiamo appena mostrato come ottenere embrioni da citi manipolati in coltura.

Quando si esegue questa procedura, è importante iniziare con ovociti di donatrice sani e adulti e utilizzare femmine ospiti con ovuli di alta qualità. Inoltre, il successo del metodo tende a essere correlato alla velocità con cui si isolano gli ovociti ed si eseguono gli interventi chirurgici. Quindi potrebbe essere necessaria un po' di pratica prima di ottenere risultati coerenti.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.