Fertilizzazione Ovociti di Xenopus Utilizzando il metodo di trasferimento Host

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere embrioni in via di sviluppo derivati da siti OO che sono stati manipolati in coltura. Questo risultato si ottiene innanzitutto isolando i siti donatori da una femmina e manipolandoli secondo le necessità in coltura. Il secondo passaggio della procedura consiste nel stimolare questi citi a maturare mediante progesterone e nel iniettare femmine ospiti potenziali con gonadotropina per indurre la deposizione delle uova.

Il terzo passaggio della procedura consiste nella colorazione delle cellule donatrici con coloranti vitali e nel preparare una femmina da utilizzare come ospite. L'ultimo passaggio della procedura prevede il trasferimento chirurgico delle cellule donatrici nella cavità corporea dell'ospite e, alcune ore dopo, il recupero e la fecondazione delle uova trasferite. Alla fine, embrioni che si dividono normalmente derivati dalle cellule donatrici sottoposte a manipolazione sperimentale.

Le citi possono essere ottenute e analizzate esattamente come gli embrioni normali. Ciao, sono Doug Houston dell'Università dell'Iowa. Oggi siamo al corso Xap di Cold Spring Harbor per mostrarvi come eseguire la procedura di trasferimento nell'ospite.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare i ruoli dei prodotti genici materni e determinarne l'importanza nello sviluppo iniziale dello zap. Cominciamo. Prima di iniziare l'intervento chirurgico, assicurarsi che l'area operatoria sia disinfettata e che i mezzi freschi e gli strumenti sterili siano pronti.

Afferrare un ago da sutura con il portaaigo nella direzione desiderata. Posizionare una rana femmina anestetizzata in posizione supina su un tovagliolo chirurgico umido. Utilizzando piccole forbici a iris, praticare un'incisione di un centimetro nel tessuto cutaneo nella parte inferiore dell'addome, laterale rispetto alla linea mediana.

Non tagliare il muscolo addominale. Utilizzare la pinzetta per sollevare il muscolo e la fascia di colore bianco circostante. Usare le forbici ad iris per effettuare un singolo taglio rapido in verticale attraverso il muscolo.

Estendere l'incisione fino a un centimetro, esponendo l'ovaio. Utilizzare una pinzetta per afferrare l'ovaio ed estrarre un lobo. Usare le forbici per asportare il lobo al livello della parete corporea.

Posizionare il tessuto in una piastra da 90 millimetri contenente mezzo di coltura per oociti o OCM e valutare immediatamente la qualità dell'ovaio al microscopio stereoscopico. Alcuni cisti possono essere rimossi con pinzette. Se i cisti sono compatti e di dimensioni e colorazione uniformi, prelevare la quantità desiderata di tessuto ovarico dalla rana e posizionarla in una piastra di Petri da 90 millimetri contenente OCM.

Chiudere l'incisione. Inserire l'ago alcuni millimetri lateralmente rispetto all'incisione, assicurandosi che attraversi sia il muscolo sia la fascia. Utilizzare la pinzetta per manovrare l'ago, avendo cura di non far passare completamente attraverso il tessuto la coda del punto di sutura.

Chiudere la ferita con un punto semplice interrotto e nodi chirurgici quadrati. La tecnica è descritta in dettaglio nel testo allegato. Ripetere la sutura anche nello strato cutaneo.

Risciacquare la femmina con acqua deionizzata e collocarla in un contenitore di recupero riempito con acqua fredda. Immediatamente dopo aver terminato l'intervento chirurgico, utilizzare forbici per suddividere l'ovaio. Aprire singoli lobi, appiattirli e tagliarli in pezzi quadrati di due centimetri di lato.

Risciacquare con mezzo pulito e utilizzare pinzette. Trasferire da cinque a sei frammenti in una nuova piastra da 90 millimetri contenente OCM per isolare singole cellule. Iniziare trasferendo uno dei frammenti in una piccola piastra contenente mezzo e portarlo al microscopio stereoscopico.

Utilizzare pinzette da orologiaio per rimuovere manualmente da tre a 500 oociti. Afferrare con una seconda coppia di pinzette lo strato di tessuto connettivo che circonda un oocita di stadio sei completamente sviluppato vicino al follicolo. Afferrare l'ovaio adiacente all'oocita con la prima coppia di pinzette.

Tirare leggermente attraverso l'ovocita per lacerare lo strato follicolare. Estrarre delicatamente l'ovocita dal tessuto con successo. Gli ovociti defogliati non presentano vasi sanguigni visibili e sono più molli rispetto agli ovociti con follicoli integri.

Utilizzare una pipetta a punta di fuoco con tappo di cotone per trasferire gruppi di 100-150 cellule in piastre di coltura da 60 millimetri contenenti otto millilitri di OCM. Conservare gli ovociti nelle loro piastre a 18 gradi Celsius. Gli ovociti possono ora essere microiniettati, secondo le esigenze, con oligonucleotidi antisenso o mRNA seguendo uno qualsiasi tra numerosi protocolli, quindi coltivati in OCM in un incubatore a 18 gradi Celsius.

Utilizzare gli oociti per il trasferimento entro 96 ore dall'isolamento, la sera precedente l'esecuzione del trasferimento. Incubare gli oociti necessari con progesterone per maturarli, aggiungendo 16 microlitri di progesterone uno millimolare al mezzo contenente gli oociti per una concentrazione finale di due micromolari. Incubare per 10-12 ore a 18 gradi Celsius nella stessa serata; iniettare tre-cinque femmine con 1000 unità di gonadotropina corionica umana per ogni rana per indurre la deposizione delle uova.

Lasciare le femmine a temperatura ambiente o a 18 gradi Celsius durante la notte, al mattino del trasferimento. Verificare al microscopio stereoscopico che le cellule coltivate abbiano completato la maturazione. Agitare i coloranti vitali e centrifugare a oltre 10.000 G per cinque minuti.

Per ridurre il segnale di fondo derivante dai detriti, aggiungere 80 microlitri del colorante vitale appropriato a ciascun gruppo sperimentale di oociti. Incubare a temperatura ambiente per 15 minuti su un agitatore. Trasferire le uova colorate in una piastra da 90 millimetri contenente o cm fresca e agitare brevemente per lavarle.

Preparare una pipetta da utilizzare per il trasferimento delle cellule. Utilizzare una matita diamantata per tracciare una linea su una pipetta a circa due centimetri sotto la parte conica e romperla in modo netto. Questo dovrebbe creare una pipetta con un foro di 1,5 millimetri, appena sufficiente per contenere un ovocita.

Lucidare la punta fino a quando i bordi sono lisci, senza chiudere la punta. Trapianto di oociti. L'intervento chirurgico deve essere eseguito il più rapidamente possibile.

Eseguire un'incisione come in precedenza in una femmina anestetizzata che produce uova di buona qualità. Questa incisione deve essere della lunghezza minima necessaria per adattarsi appena al lume del trasferimento. Usare una pipetta di meno di un centimetro.

Ruotare delicatamente la piastra contenente gli oociti sperimentali per raccoglierli al centro. Utilizzare la pipetta pastoriana preparata per aspirarne il maggior numero possibile. Lasciare sedimentare gli oociti all’estremità della pipetta per ridurre al minimo la quantità di liquido trasferita alla rana.

Usare una pinzetta per afferrare e sollevare un lembo di muscolo e fascia. Inserire la punta della pipetta nell'incisione e lasciare scorrere lentamente le cellule nella cavità corporea. Ripetere il procedimento fino a quando tutti gli ovociti sono stati trasferiti.

Non rilasciare il strato muscolare per evitare che gli oociti fuoriescano dall'incisione. Usare la pinzetta per afferrare entrambi i lati dell'incisione e avvicinarli, permettendo ai citi di posizionarsi nella cavità corporea. Iniziare a suturare il strato muscolare e fasciale come in precedenza, avendo cura di mantenere una tensione verso l'alto fino a quando non viene fatto il primo nodo.

Chiudere la pelle con punti di sutura. Sciacquare la rana con acqua deionizzata e lasciarla riprendere come in precedenza. La rana dovrebbe iniziare a deporre le uova normalmente dopo l'intervento, a partire da due a tre ore dopo l'intervento chirurgico.

Raccogliere le uova mediante leggera pressione ogni mezz'ora fino a quando la femmina smette di deporre, in una capsula contenente uova raccolte. Aggiungere quattro millilitri di una sospensione di sperma appena raccolto in 1 XMMR e incubare a temperatura ambiente per quattro minuti. Allagare e risciacquare abbondantemente le uova con acqua a temperatura ambiente.

Punto uno: incubare XMMR a temperatura ambiente per consentire l'attivazione e il taglio. Utilizzare la cisteina in qualsiasi momento per rimuovere i codici jelly. Gli embrioni trasferiti possono quindi essere suddivisi in piatti separati in base al colore e coltivati come embrioni normali.

Tipicamente, più di due terzi delle uova trasferite si attivano entro pochi minuti dalla fecondazione, mostrando una marcata contrazione corticale al polo animale. Nella maggior parte degli esperimenti, oltre la metà delle uova trasferite subisce una normale prima segmentazione. A volte, la segmentazione può essere ritardata di circa 20 minuti rispetto alle uova ospiti, nei nostri esperimenti.

Da 30 a 60% degli embrioni trasferiti procedono normalmente alla gastrulazione e sopravvivono oltre la fase neurale. Gli embrioni trasferiti manterranno il colore del colorante vitale per molti giorni di sviluppo. Gli embrioni derivati da cellule controllo non iniettate appariranno normali, come previsto.

Al contrario, gli embrioni derivati da ovociti iniettati con beta catenina e oligonucleotidi antisenso, ad esempio, avranno un aspetto centralizzato. Vi abbiamo appena mostrato come ottenere embrioni da citi manipolati in coltura.

Quando si esegue questa procedura, è importante iniziare con ovociti donatori sani e completamente sviluppati e utilizzare femmine ospiti con uova di alta qualità. Inoltre, il successo del metodo tende a correlarsi con la velocità con cui si isolano gli ovociti e si eseguono gli interventi chirurgici. Pertanto, potrebbe essere necessaria una certa pratica prima di ottenere risultati costanti.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.