Name: Fertilizzazione Ovociti di Xenopus Utilizzando il metodo di trasferimento Host (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Impara la fertilizzazione di ovociti Xenopus con il metodo di trasferimento host. Questa tecnica consente di ottenere embrioni da ovociti manipolati in coltura per studi di biologia dello sviluppo.

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Gli autori desiderano grazie ai membri del laboratorio di Houston per la lettura critica del manoscritto. La ricerca è supportata dal National Institutes of Health (GM083999) assegnato a DWH

1. La rimozione chirurgica del tessuto dell&#39;ovaio <ol class="lalpha"><li> Preparare un lotto fresco di media cultura ovocita (OCM; Materiali), tra 400-800 ml a seconda delle dimensioni dell&#39;esperimento. Regolare il pH a 7,6-7,8, fino a quando il rosso fenolo trasforma un colore rosso scuro (sei o giù di piccole gocce di NaOH 5N). Versare una piccola quantità di controllare il pH in un tubo a parte in quanto l&#39;elettrodo pH può contaminare i media. OCM deve essere conservato a 18 ° C e utilizzata entro una settimana. </li><li> Seleziona 3-5 femmine e posto uno in ~ 2L soluzione tamponata anestetico (Materiali). Cerchiamo di evitare di usare le rane che sono stati alimentati il ​​giorno o prima di un intervento chirurgico. Mentre la rana è cedere alla anestetico, disinfettare l&#39;area chirurgica con il 70% EtOH e preparare gli strumenti chirurgici. </li><li> Sterilizzare gli strumenti chirurgici da parte di 20 secondi l&#39;immersione in uno sterilizzatore a caldo cordone a 250 ° C. I seguenti strumenti dovrebbero essere a portata di mano: manico bisturi (# 3) e la lama (# 10 o 11), diverse paia di Dumont pinze, forbici iris Bonn (curve o diritte), Halsey o Olsen-Hegar titolare micro aghi e suture. Luogo sterilizzati strumenti su piastra di Petri sterile o all&#39;interno del pacchetto di sutura per tenere sterile. Afferrare l&#39;ago nel porta-aghi con l&#39;orientamento desiderato prima di iniziare. Noi preferiamo Olsen-Hegar porta-aghi in quanto il manico contiene lame a forbice, che può essere usato per tagliare suture senza strumenti di commutazione. </li><li> Dopo 10 minuti, verificare che un aereo di anestesia chirurgica è stato raggiunto. Rane anestetizzato smetterà di muoversi e non risponde a un pizzico piedi o di essere capovolta. Anestesia dovrebbe durare 15 minuti, che è più che abbastanza tempo per eseguire le operazioni. Don abbigliamento adeguato chirurgico. Questo può includere guanti puliti (non-lattice), camici e mascherine chirurgiche, a seconda delle preferenze personali e istituzionali le linee guida la cura degli animali. </li><li> Nota sulla tecnica asettica: le secrezioni della pelle Frog contengono peptidi antimicrobici che in genere riducono l&#39;incidenza di contaminazione durante l&#39;intervento chirurgico, anche se la tecnica asettica deve essere seguita il più possibile. Teli chirurgici può essere utilizzato, ma non può essere richiesto da IACUCs istituzionali e non può fornire molto beneficio. Generalmente &quot;tecnica punta&quot; usato, dove le mani toccano le punte sterili del, materiale di sutura strumenti o sito di incisione. Gli strumenti possono essere risterilizzati (nello sterilizzatore tallone) incisione a seguito della pelle, e una zona sterile dovrebbe essere mantenuta sul bancone per gli strumenti che mette (come una capsula di Petri o un pacchetto di sutura). Requisiti istituzionali possono differire in modo significativo, quindi seguire le linee guida le vostre istituzioni &#39;e di ricevere adeguate istruzioni prima di eseguire interventi chirurgici. </li><li> Rimuovere la rana da anestetico e posto in decubito dorsale su un chirurgico umido pulire. Nota. La pelle può essere pulito con il risciacquo di iodio povidine diluito (1:20) o clorexidina (0,75%). Tuttavia, evitare commerciale scrub chirurgico, saponi e il 70% di alcol isopropilico, poiché possono danneggiare la pelle delicata di anfibi. </li><li> Usando un bisturi, forbici o piccoli iris, fare un piccolo (1 - 1,5 cm) incisione nella pelle nella parte inferiore dell&#39;addome, laterale alla linea mediana. Incisioni successive sulla stessa rana deve essere eseguita su lati alterni, ben distanziati gli uni dagli altri. Le incisioni possono essere effettuate sia parallela o perpendicolare alla linea mediana. </li><li> Rendere la pelle e le incisioni dei muscoli addominali in due fasi. Dopo il taglio della pelle, sollevare lo strato muscolare e circonda di colore bianco fascia con una pinza e fare l&#39;incisione nel muscolo sollevato. Usare le forbici e tagliare verso il basso, cercare di fare un taglio rapido per esporre le cavità del corpo lasciando margini della ferita pulita. Se solo la fascia è tagliata, si rientra e renderanno più difficile la sutura. Sollevare il muscolo evitare inavvertitamente ferire qualsiasi organi interni. Inoltre, cercare di evitare il taglio tramite qualunque cuori linfatici visibili o vasi sanguigni all&#39;interno degli strati muscolari. Estendere la lunghezza con le forbici del taglio in modo che ovaie possono essere facilmente tirato attraverso. </li><li> Ovaio deve essere chiaramente visibile una volta che l&#39;incisione viene fatta. Per procurarsi i ovaio, afferrare con una pinza e esternare il tessuto ovarico. La quantità desiderata di tessuto viene rimosso e rifilata a livello della parete del corpo. Non roba del tessuto indietro nella cavità celomatica, in quanto ciò potrebbe essere fonte di infezioni o altre complicazioni. </li><li> Subito osservare un piccolo pezzo di ovaio sotto un microscopio da dissezione e defolliculate uno ovociti pochi per testare la loro qualità. Essi dovrebbero essere fermi e di dimensioni uniformi e colorazione. Se sono accettabili, rimuovere la quantità desiderata di tessuto ovarico e suturare l&#39;incisione. Abbastanza per riempire un 90 millimetri piatto di Petri è solitamente sufficiente per la maggior parte degli esperimenti. Se gli ovociti sono di qualità discutibile, sutura la rana e ripetere con una donna diversa. </li><li> Chiudere l&#39;incisione di sutura il muscolo e lo strato prima fascia. Inserire il n<html> eedle pochi millimetri laterale per l&#39;incisione, avendo cura di passare attraverso lo strato di fascia pure. Suture solo attraverso il muscolo può strappare il tessuto e allentarsi. Usare pinze per inserire l&#39;ago da sotto sul lato opposto della incisione. Rilascio e ri-comprendere l&#39;ago dall&#39;esterno del corpo e tirare la sutura attraverso fino a diversi centimetri o giù di lì della coda rimane, facendo attenzione a non tirarlo fino in fondo. </li><li> Chiudere la ferita con un semplice modello interrotto di sutura. Usiamo un legame fondamentale strumento per rendere chirurgo nodi quadrati (nodi scogliera). Anello l&#39;estremità lunga della sutura intorno al titolare ago, afferrare la coda e tirarlo attraverso il ciclo verso di voi e stringere. Loop e tirare attraverso, questa volta tirare il titolare ago lontano da voi. Un terzo lancio può essere utilizzato per una maggiore sicurezza (nella stessa direzione del primo). Tagliare la sutura, lasciando la coda corta e farne un&#39;altra sutura nel muscolo pochi millimetri di distanza. Due punti di sutura sono sufficienti per piccole suture, tre per quelle più grandi. Ripetere l&#39;operazione per lo strato di pelle. Dimostrazioni video della tecnica di sutura di base sono disponibili su YouTube - la ricerca di &quot;legare strumento&quot;, ci sono un bel po &#39;tra cui scegliere, anche se la tecnica di base è la stessa. </li><li> Risciacquare la femmina con acqua deionizzata e metterla in un secchio pieno di recupero fresco (18 ° C). Mentre in laboratorio, le rane sono tenuti in acqua di rubinetto trattata con Amquel per rimuovere clorammine. Ogni pochi minuti, sollevare delicatamente la rana dall&#39;acqua e cercare ingoiare o occhi sporgenti movimenti, indicative di ripresa dall&#39;anestesia. </li><li> Nota: Chirurgia La sopravvivenza non è strettamente necessario per ottenere tessuto ovarico, anche se le femmine continuerà a produrre ovociti buoni dopo un certo numero di operazioni. L&#39;esecuzione di interventi chirurgici sopravvivenza anche ridurre il numero degli animali utilizzati. Assicurati di seguire le linee guida dell&#39;unità di cura degli animali sui metodi di vertebrati chirurgia sopravvivenza, post-op cura e monitoraggio e per numero di interventi chirurgici ammessi su un individuo. </li></ol> 2. Coltura e oociti Defolliculating <ol class="lalpha"><li> Subito dopo l&#39;intervento è terminato, suddividere l&#39;ovaio in piccoli pezzi (circa 2 cm 2) e conservare in OCM fresco, con 5-6 pezzi al piatto 90 mm. Lobi individuali di ovaio vengono tagliati aperti, appiattita e tagliate a pezzi quadrati. Questi sono risciacquati in OCM pulito e messo in piatti per la cultura. Appiattimento e dividendo l&#39;ovaio estenderà la sua vita di cultura e di rendere più facile defolliculation. </li><li> Spostare un lobo di un piccolo piatto di OCM e manualmente defolliculate 300-500 ovociti. Ovociti mediante trasferimento sterile, fuoco lucido pipetta. Abbiamo scoperto che utilizzando il cotone collegato varietà è essenziale per minimizzare la contaminazione delle culture. Conservare gli ovociti a 18 ° C in 8 mL OCM (in piatti di media (Falcon 1007)) in gruppi di 100-150. Con la pratica, si dovrebbe essere in grado di defolliculate ovociti abbastanza in 1-2 ore. Ovociti Collagenased non sono adatti per il trasferimento di ospitare in quanto non è fertilizable. </li><li> Defolliculating metodo. Noi defolliculate con pinze (Dumont o # # 4s 5s, Strumenti Scienza Fine) orologiai &#39;, seguendo i metodi descritti in base Smith et al., (1991). Utilizzando un paio di pinze (in mano dominante), afferrare la teca strato di tessuto connettivo che circonda un adulto ovocita VI tappa vicino a dove il follicolo è collegato l&#39;ovaio (il gambo). Con l&#39;altra coppia di pinze, afferrare l&#39;ovaio adiacente alla prima coppia. Leggermente lacerare lo strato follicolo tirando attraverso l&#39;ovocita. Delicatamente stuzzicare l&#39;ovocita fuori del tessuto. Ovociti con successo defolliculated sono floppier di ovociti semplicemente tirato fuori senza rimuovere lo strato follicolo e sarà priva di vasi sanguigni visibili. </li><li> Nota: E &#39;essenziale per mantenere la pressione molto leggera sulle punte della pinza, appena sufficiente per le punte di incontrare. Serraggio troppo stretto è un comune tra i principianti e comporterà l&#39;ovocita di essere tirato via con il follicolo intatto. Mantenere un buon paio di pinze in esclusiva per defolliculating. Le punte devono soddisfare in modo preciso e dovrebbe essere leggermente più schietto pinze per fare espianti da embrioni di Xenopus (Figura 1). </li><li> Noi abitualmente prova matura circa 20 con progesterone e interrompere l&#39;esperimento se il tasso di maturazione è scarsa (&lt;50% dopo 6-7 ore a temperatura ambiente). </li><li> A questo punto, gli ovociti possono essere manipolati e colto come desiderato, come la microiniezione di oligo, morfolino o mRNA. Procedure di iniezione variare in base alla laboratorio, in modo da non descrivere quei qui. Ovociti può essere mantenuta fino a una settimana di OCM, ma in generale la salute declina quindi è meglio usarli per il trasferimento entro 96 ore di isolamento. </li><li> Tenete presente che solo cinque a sei gruppi (tra cui un controllo) possono essere trasferiti su una singola femmina, a causa di limitazioni di coloranti vitali, in modo da pianificare la sperimentazione di conseguenza. </li></ol>&quot;&gt; 3. Maturazione degli ovociti e la stimolazione di femmine ospitanti <ol class="lalpha"><li> Se si esegue un salvataggio di esaurimento oligo, iniettare il mRNA (di solito 5-30 pg di RNA) ~ 24-48 ore dopo l&#39;oligo. L&#39;oligo avrà degradata da questo momento e non dovrebbe incidere sulla RNA iniettato. </li><li> La sera prima di eseguire il trasferimento, aggiungere 16 ml di soluzione di progesterone di lavoro (1 mm di EtOH) di ovociti in 8 OCM mL in piatti di mezzo (concentrazione di progesterone finale è ~ 2 mM). Incubare per 10-12 ore a 18 ° C per consentire la maturazione degli ovociti. </li><li> Iniettare 3-5 femmine con 1000 unità per rana di hCG per indurre la deposizione delle uova. I nostri esperimenti sembrano funzionare meglio se la maturazione degli ovociti e l&#39;iniezione di hCG sono fatte nello stesso periodo, circa 12 ore prima dell&#39;impianto nell&#39;ospite (ad esempio, 22:00 AM -10). Lascia femmine a RT o 18 ° C durante la notte. </li></ol> 4. Preparazione e colorazione colorante vitale di ovociti <ol class="lalpha"><li> La mattina del trasferimento, permettono ~ 45-60 &#39;a impostare ed eseguire la procedura. A questo punto, gli ovociti maturi possono essere congelati per una successiva analisi dell&#39;efficacia del knockdown mRNA o espressione della proteina. Inoltre, controllare che gli ovociti non sono stati infettati e che c&#39;era un buon tasso di maturazione (&gt; 50%). Ovociti infetto non si fecondano. Scongelare coloranti vitali (Materiali) e far girare a velocità massima per 5 min. </li><li> Colori diversi gruppi sperimentali con l&#39;aggiunta di 80 ml di colorante appropriato vitale (s) ai piatti ovocita e incubare con dondolo per 15 &#39;. Durante questo periodo, selezionare una femmina ospite e iniziare l&#39;anestesia. Scegli una rana che sta lentamente le uova in modo normale o quella che produce le uova con abbondante spremitura mite. Uova dal host deve essere di buona qualità. Evitare di femmine che gettano le stringhe di uova o uova schiacciati. </li><li> Trasferire le uova colorate di un grande piatto di OCM fresca, agitare brevemente di lavare e metterle da parte prima del trasferimento. </li><li> Preparare una pipetta Pasteur sterile, con un alesaggio ampio abbastanza da ospitare un ovocita (~ 1,5 mm) per l&#39;utilizzo in trapiantare gli ovociti. Punteggio ottenuto la pipetta con una matita diamante e rompere pulito. Fuoco fino a lucidare i bordi sono lisce, facendo attenzione a non sciogliere l&#39;apertura. </li></ol> 5. L&#39;esecuzione del trapianto degli ovociti <ol class="lalpha"><li> Trapianto ovocita utilizza le stesse procedure chirurgiche, come descritto nella parte I, anche se invece di rimuovere ovaie, gli ovociti vengono manipolati inserito nella cavità del corpo con una pipetta. Idealmente, la procedura di trasferimento deve essere eseguita il più rapidamente possibile e la dimensione dell&#39;incisione deve essere mantenuto il più piccolo possibile. </li><li> Anesthesize la femmina ospite e preparare gli strumenti chirurgici, come descritto nella parte I. Marca e incisione, come descritto nella parte I. L&#39;incisione può essere più piccolo, ma deve essere grande abbastanza da contenere il foro della pipetta di trasferimento (Figura 2A). </li><li> Per il trapianto di ovociti, afferrare e sollevare un lembo di muscolo e fascia con una pinza e introdurre gli ovociti sperimentale utilizzando la pipetta Pasteur preparato in precedenza. Agitare il piatto di ovociti per raccoglierli nel centro e succhiare il maggior numero possibile. Lasciare gli ovociti di stabilirsi nella fine della pipetta per evitare che il liquido in eccesso di essere introdotto e inserire la punta della pipetta in incisione e lentamente permettere gli ovociti di filo nella cavità del corpo (Figura 2B). Ripetere fino a quando tutti gli ovociti sono stati trasferiti. Non rilasciare lo strato muscolare in qualsiasi momento, fino a quando non hanno iniziato sutura, o gli ovociti saranno fuoriuscite di incisione. </li><li> Una volta che gli ovociti sono stati trasferiti, afferrare entrambi i lati della ferita con una pinza e metterli insieme, permettendo al ovociti di stabilirsi nella cavità del corpo. Iniziare la sutura come descritto, avendo cura di mantenere la tensione verso l&#39;alto sul muscolo e fascia fino al primo nodo è legato (Figura 2C). Ciò manterrà gli ovociti di essere espulsi e consentirà ai bordi della ferita per guarire in modo uniforme. Aggiungere un altro sutura nel muscolo / fascia livello e poi sutura la pelle. </li><li> Risciacquare la femmina con acqua deionizzata e metterla in un secchio pieno di recupero raffreddata (18 ° C) Amquel trattati con acqua. Monitorare il suo recupero dall&#39;anestesia come sopra. Lei dovrebbe iniziare le uova normalmente dopo l&#39;operazione. </li><li> Ottenere testicoli da una rana maschio con le normali procedure. Conservare i testicoli nella OCM o L15 fino al momento dell&#39;uso. Noi preferiamo testicolo fresco quando la concimazione esperimenti di trasferimento. </li></ol> 6. Recupero degli ovociti e la fecondazione in vitro <ol class="lalpha"><li> Ciglia peritoneale guiderà le uova trasferiti (e normale uova celomatica dell&#39;ospite) per le aperture dei ovidotti nella parte anteriore della cavità del corpo. Uova colorate possono essere recuperati all&#39;inizio 2-3 ore dopo il trasferimento dalla spremitura normale. Le uova possono essere ottenuti ogni mezz&#39;ora o giù di lì fino a quando la donna smette di posa. </li><li> Fertilizzare in una spesospensione rm (in ~ 4 mL 1x MMR) per 4 minuti. Flood e risciacquare a lungo con MMR 0.1x. Le uova dovrebbero attivare normalmente e inizierà a fendere ~ 1,5-2 ore dopo la fecondazione. Uova trasferiti spesso unirà poco più tardi le uova di accoglienza. </li><li> Rimuovere le mani gelatina con cisteina come embrioni normali e ordinare in piatti separati. Questo può essere fatto in qualsiasi momento, a seconda delle esigenze dell&#39;esperimento. E di solito più facile identificare i vari colori intorno al 4-celle palco e più difficili durante le fasi finali blastula. Cultura le uova a bassa densità (&lt;50 per piatto medio) in pulito MMR 0.1x. Da questo punto, gli embrioni possono essere trattati e manipolati normalmente. </li><li> Ritorna le rane alla struttura animale e monitor per le complicazioni nei prossimi giorni. </li><li> Fecondazione metodo alternativo; deposizione delle uova nel buffer di sale <ol class="lroman"><li> Dopo la rana si è ripreso dall&#39;anestesia, il suo posto in ~ 1L alto sale MMR (1,2 x). Lasciare che la femmina a deporre le uova nel buffer per circa 4-6 ore. Spremere le uova restanti, scolarli MMR 1.2x e ordinare uova colorate nel piatto pulito; rimuovere tutto il liquido possibile. </li><li> Lavare a lungo con MMR 0.3x e fertilizzare in volume minimo di 0.3x MMR / sperma sospensione fino attivare uova (10 minuti). Flood con MMR 0.1x e la cultura come sopra. Questa opzione è utile se le uova sono necessarie molte nella stessa fase o se la spremitura manuale di uova danni degli ovociti donatore. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dall&#39;Università di Iowa IACUC Comitato.

Un trasferimento di successo si tradurrà in fertilizzazione e scissione normale&gt; 50% degli ovociti (Figura 3). Generalmente tra 30-60% degli ovociti trasferiti sopravviverà passato le fasi neurula. Di solito il trasferimento 75-150 ovociti per ogni gruppo sperimentale, che sarà resa embrioni sufficiente per diversi tipi di analisi (in situ, RT-PCR), così come visualizzare il fenotipo. L'impianto di ovociti sostanzialmente più non sembra aumentare notevolmente la resa. Inoltre, almeno 30 ovociti per ogni gruppo dovreb...

Soluzioni e ricette: OCM (terreno di coltura degli ovociti; modificato da Wylie et al, 1996). <table border="0"><tbody><tr><td> 70% di L-15 a medio Leibovitz (contenente l-glutammina) </td><td> (Invitrogen 11415-064) </td></tr><tr><td> 0,4 mg / ml di albumina sierica bovina (BSA; V frazione) </td><td> (Sigma A-9418-50g) </td></tr><tr><td> 1x penicillina-streptomicina </td><td> (Sigma P-0781) </td></tr><tr><td colspan="2"> Aggiustare il pH a 7,6-7,8 con 5N NaOH </td></tr><tr><td colspan="2"> Fai fresca settimanale, conservare a 18 ° C. </td></tr></tbody></table> 10X MMR (Soluzione di Marc modifica di Ringer;. Zuck et al, 1998) <table border="0"><tbody><tr><td> 1M NaCl </td></tr><tr><td> 20 mM KCl </td></tr><tr><td> 20 mM CaCl 2 </td></tr><tr><td> 10 mM MgCl 2 </td></tr><tr><td> 150 mM HEPES </td></tr><tr><td> regolare a pH 7,6-7,8 </td></tr><tr><td> Conservare a 4 ° C </td></tr></tbody></table> Anestetico soluzione <table border="0"><tbody><tr><td> 1 g / L 3-Aminobenzoic di etile (MS222) </td><td> (Sigma A-5040) </td></tr><tr><td colspan="2"> 0,7 g / l di sodio bicarbonato </td></tr><tr><td colspan="2"> Sciogliere in Amquel trattati con acqua </td></tr><tr><td colspan="2"> Fai fresca settimanale </td></tr></tbody></table> Progesterone scorte <table border="0"><tbody><tr><td> Progesterone 10 mM (Sigma P-0130) in 100% etanolo </td></tr><tr><td> Diluire a 1 mm di EtOH 100% per uno stock 500x / soluzione di lavoro </td></tr><tr><td> Conservare a -20 ° C </td></tr></tbody></table> Coloranti vitali (modificato da Heasman et al., 1991) <table border="0"><tbody><tr><td> Blu: 0,1% Nilo Azzurro A </td><td> (Aldrich 121479-5G), </td></tr><tr><td> Rosso: 0,25% Rosso neutro </td><td> (Sigma N-6634), </td></tr><tr><td> Marrone: 1% Bismarck Brown </td><td> (Sigma B-2759), </td></tr><tr><td colspan="2"> Verde (80 microlitri blu + 80 microlitri marrone), </td></tr><tr><td colspan="2"> Mauve (80 microlitri blu + 80 rosso microlitri). </td></tr><tr><td colspan="2"> Un colore sesto, arancione (80 + 80 microlitri rosso bruno microlitri), possono essere utilizzati, ma è spesso difficile da distinguere da marrone. </td></tr></tbody></table> Gli stock di blu, rosso e Brown sono preparati in acqua deionizzata a 50 ml provette, incubate per 20 minuti con dondolo e filato in una centrifuga clinica. I surnatanti sono aliquotted in provette da microcentrifuga e conservati a -20 ° C.

fertilizzazione ovociti di xenopus utilizzando il metodo di trasferimento host

Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method

Studiare il contributo di molecole ereditato dalla madre di vertebrati sviluppo precoce è spesso ostacolata dal tempo e la spesa necessaria per generare animali materno-effetto mutante. Inoltre, molte delle tecniche di iperespressione o inibire la funzione dei geni negli organismi come Xenopus zebrafish e non riescono a bersaglio sufficientemente critico le vie di segnalazione della madre, come il segnale Wnt. In Xenopus, manipolando la funzione dei geni negli ovociti in coltura e la loro successiva concimazione può migliorare questi problemi in una certa misura. Ovociti vengono manualmente defolliculated dal tessuto del donatore ovaio, iniettati o trattati in cultura come desiderato, quindi stimolati con progesterone per indurre la maturazione. Successivamente, gli ovociti vengono introdotti nella cavità del corpo di una rana ospitare l&#39;ovulazione femminile, dopo di che verrà traslocato attraverso ovidotto del padrone di casa ed acquisire le modifiche e cappotti gelatina necessaria per la fecondazione. Gli embrioni risultanti possono essere elevato alla scena desiderata e analizzati gli effetti di eventuali perturbazioni sperimentale. L&#39;host di trasferimento metodo è stato molto efficace nello scoprire i meccanismi fondamentali dello sviluppo precoce e consente una vasta gamma di possibilità di sperimentazione non disponibile in qualsiasi altro organismo modello vertebrato.

Procedura per la concimazione<em&gt; Ovociti di Xenopus</em&gt; Con il metodo del trasferimento di accoglienza.

Fertilizzazione Ovociti di Xenopus Utilizzando il metodo di trasferimento Host

Lo studio del contributo delle molecole ereditate per via materna allo sviluppo precoce dei vertebrati è spesso ostacolato dal tempo e dai costi necessari per...

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere embrioni in via di sviluppo derivati da siti OO che sono stati manipolati in coltura. Questo risultato si ottiene innanzitutto isolando i siti donatori da una femmina e manipolandoli secondo le necessità in coltura. Il secondo passaggio della procedura consiste nel stimolare questi citi a maturare mediante progesterone e nel iniettare femmine ospiti potenziali con gonadotropina per indurre la deposizione delle uova.Il terzo passaggio della procedura consiste nella colorazione delle cellule donatrici con coloranti vitali e nella preparazione di una femmina da utilizzare come ospite. L'ultimo passaggio della procedura prevede il trasferimento chirurgico delle cellule donatrici nella cavità corporea dell'ospite e, alcune ore dopo, il recupero e la fecondazione delle uova trasferite. Alla fine, embrioni che si dividono normalmente derivati dalle cellule donatrici sottoposte a manipolazione sperimentale.Le citi possono essere ottenute e analizzate esattamente come gli embrioni normali. Ciao, sono Doug Houston dell'Università dell'Iowa. Oggi siamo al corso Xap di Cold Spring Harbor per mostrarvi come eseguire la procedura di trasferimento nell'ospite.Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare i ruoli dei prodotti genici materni e determinarne le funzioni nello sviluppo precoce dello zigote. Cominciamo. Prima di iniziare l'intervento chirurgico, assicurarsi che l'area operatoria sia disinfettata e che siano pronti mezzi freschi e strumenti sterili.Afferrare un ago da sutura nel portaaigo nella posizione desiderata. Posizionare una rana femmina anestetizzata supina su un tovagliolo chirurgico umido. Utilizzando piccole forbici da iridectomia, praticare un'incisione di un centimetro nel tessuto cutaneo nella parte inferiore dell'addome, laterale rispetto alla linea mediana.Non tagliare il muscolo addominale. Utilizzare la pinzetta per sollevare il muscolo e la fascia di colore bianco circostante. Usare le forbici ad iris per effettuare un singolo taglio rapido in verticale attraverso il muscolo.Estendere l'incisione fino a un centimetro, esponendo l'ovaio. Utilizzare una pinzetta per afferrare l'ovaio ed estrarre un lobo. Usare le forbici per tagliare il lobo al livello della parete corporea.Posizionare il tessuto in una piastra da 90 millimetri contenente mezzo di coltura per oociti o OCM e valutare immediatamente la qualità dell'ovaio al microscopio stereoscopico. Alcuni oociti possono essere defogliati con pinzette. Se gli oociti sono compatti, di dimensioni uniformi e di colore omogeneo, rimuovere la quantità desiderata di tessuto ovarico dalla rana e posizionarla in una piastra di Petri da 90 millimetri contenente OCM.Chiudere l'incisione. Inserire l'ago alcuni millimetri lateralmente rispetto all'incisione, assicurandosi di attraversare sia il muscolo che la fascia. Utilizzare la pinzetta per manovrare l'ago, avendo cura di non tirare completamente il filo della sutura attraverso il tessuto.Chiudere la ferita con un modello di punti semplici interrotti e nodi chirurgici quadrati. La tecnica è descritta in dettaglio nel testo allegato. Ripetere la sutura anche per lo strato cutaneo.Risciacquare la femmina con acqua deionizzata e posizionarla in un contenitore di recupero riempito con acqua fredda. Immediatamente dopo aver terminato l'intervento chirurgico, utilizzare forbici per suddividere l'ovaio. Aprire chirurgicamente lobi singoli, appiattirli e tagliarli in pezzi quadrati di due centimetri di lato.Risciacquare con mezzo pulito e utilizzare pinzette. Trasferire da cinque a sei frammenti in una nuova piastra da 90 millimetri contenente OCM per isolare singole cellule. Iniziare trasferendo uno dei frammenti in una piccola piastra contenente mezzo e portarlo al microscopio stereoscopico.Utilizzare pinzette da orologiaio per rimuovere manualmente da tre a 500 oociti. Afferrare con una seconda coppia di pinzette lo strato di tessuto connettivo che circonda un oocita di stadio sei completamente sviluppato vicino al peduncolo. Afferrare l'ovaio adiacente all'oocita con la prima coppia di pinzette.Tirare leggermente sull'oocita per strappare il foglietto follicolare. Estrarre delicatamente l'ovocita dal tessuto con successo. Gli ovociti defogliati non presentano vasi sanguigni visibili e sono più molli rispetto agli ovociti con follicoli integri.Utilizzare una pipetta con punta in cotone e vetro fiamma per trasferire gruppi di 100 a 150 cellule in piatti di coltura da 60 millimetri contenenti otto millilitri di OCM. Conservare gli oociti nei piatti a 18 gradi Celsius. Gli oociti possono ora essere microiniettati a piacimento con oligonucleotidi antisenso o mRNA seguendo diversi protocolli, quindi coltivati in OCM in un incubatore a 18 gradi Celsius.Utilizzare gli oociti per il trasferimento entro 96 ore dall'isolamento, la sera precedente l'esecuzione del trasferimento. Incubare gli oociti necessari con progesterone per maturarli, aggiungendo 16 microlitri di progesterone uno millimolare al mezzo contenente gli oociti, per una concentrazione finale di due micromolari. Incubare per 10-12 ore a 18 gradi Celsius nella stessa serata; iniettare da tre a cinque femmine con 1000 unità di gonadotropina corionica umana per ranocchio per indurre la deposizione delle uova.Lasciare le femmine a temperatura ambiente o a 18 gradi Celsius durante la notte, al mattino del trasferimento. Verificare al microscopio stereoscopico che le cellule coltivate abbiano completato la maturazione. Agitare i coloranti vitali e centrifugare a oltre 10.000 G per cinque minuti.Per ridurre il fondo derivante dai detriti, aggiungere 80 microlitri del colorante vitale appropriato a ciascun gruppo sperimentale di oociti. Incubare a temperatura ambiente per 15 minuti su un agitatore. Trasferire le uova colorate in una piastra da 90 millimetri contenente o cm fresca e agitare brevemente per lavarle.Preparare una pipetta da utilizzare per il trasferimento delle cellule. Utilizzare una matita diamantata per tracciare una linea su una pipetta normale a circa due centimetri sotto la parte conica e spezzarla in modo netto. Questo dovrebbe produrre una pipetta con un foro di 1,5 millimetri, appena sufficiente per accogliere un ovocita.Lucidare la punta fino a quando i bordi sono lisci, senza chiudere la punta. Trapianto di oociti. L'intervento chirurgico deve essere eseguito il più rapidamente possibile.Eseguire un'incisione come in precedenza in una femmina anestetizzata che depone uova di buona qualità. Questa incisione deve essere della lunghezza minima necessaria per adattarsi appena al diametro interno del trasferimento. Usare una pipetta di meno di un centimetro.Ruotare delicatamente la piastra contenente gli oociti sperimentali per raccoglierli al centro. Utilizzare la pipetta preparata per aspirare il maggior numero possibile di oociti. Lasciare sedimentare gli oociti all'estremità della pipetta per ridurre al minimo la quantità di liquido trasferita alla rana.Utilizzare una pinzetta per afferrare e sollevare un lembo di muscolo e fascia. Inserire la punta della pipetta nell'incisione e lasciare scorrere lentamente le cellule nella cavità corporea. Ripetere il procedimento fino a quando tutti gli ovociti sono stati trasferiti.Non rilasciare il strato muscolare per evitare che gli oociti fuoriescano dall'incisione. Usare la pinzetta per afferrare entrambi i lati dell'incisione e avvicinarli, permettendo ai citi di posizionarsi nella cavità corporea. Iniziare a suturare lo strato muscolare e fasciale come in precedenza, avendo cura di mantenere una tensione verso l'alto fino a quando non viene fatto il primo nodo.Suture la pelle. Sciacquare la rana con acqua deionizzata e lasciarla riprendere come in precedenza. La rana dovrebbe iniziare a deporre le uova normalmente dopo l'intervento, a partire da due o tre ore dopo l'operazione.Raccogliere le uova mediante leggera pressione ogni mezz'ora finché la femmina non smette di deporre, in una capsula contenente uova raccolte. Aggiungere quattro millilitri di una sospensione di sperma appena raccolto in un XMMR e incubare a temperatura ambiente per quattro minuti. Allagare e risciacquare abbondantemente le uova con acqua a temperatura ambiente.Incubare un punto XMMR a temperatura ambiente per consentire l'attivazione e il taglio. Utilizzare la cisteina in qualsiasi momento per rimuovere i codici jelly. Gli embrioni trasferiti possono quindi essere suddivisi in piatti separati in base al colore e coltivati come embrioni normali.Tipicamente, più di due terzi delle uova trasferite si attivano entro pochi minuti dalla fecondazione, mostrando una marcata contrazione corticale al polo animale. Nella maggior parte degli esperimenti, oltre la metà delle uova trasferite subisce una normale prima segmentazione. A volte, la segmentazione può essere ritardata di circa 20 minuti rispetto alle uova ospiti, nel nostro caso.Da 30 a 60% degli embrioni trasferiti procedono normalmente alla gastrulazione e sopravvivono oltre la fase neurale. Gli embrioni trasferiti manterranno il colore del colorante vitale per molti giorni di sviluppo. Gli embrioni derivati da cellule controllo non iniettate appariranno normali, come previsto.Al contrario, gli embrioni derivati da ovociti iniettati con beta catenina e oligonucleotidi antisenso, ad esempio, avranno un aspetto centralizzato. Vi abbiamo appena mostrato come ottenere embrioni da citi manipolati in coltura.Quando si esegue questa procedura, è importante iniziare con ovociti donatori sani e completamente sviluppati e utilizzare femmine ospiti con uova di alta qualità. Inoltre, il successo del metodo tende a correlarsi con la velocità con cui si isolano gli ovociti e si eseguono gli interventi chirurgici. Pertanto, potrebbe essere necessaria una certa pratica prima di ottenere risultati costanti.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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