Name: Dissezione di organizzatore e Espianti Polo animali da embrioni di Xenopus laevis e montaggio di un saggio Adesione Cellulare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 21 s
Description: Impara la dissezione di esplanti di polo animale e organizzatore da embrioni di Xenopus laevis e il montaggio di un saggio di adesione cellulare. Questo metodo consente di studiare le caratteristiche di adesione e migrazione cellulare.

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Preparazione Chambers Adesione (il giorno prima l&#39;iniezione / dissezione) Adesione saggio Chambers Se si dispone di un microscopio convenzionale composto (localizza ottica sopra il palco), è ncecessary fare una bassa altezza camera di adesione come segue. Se si utilizza il microscopio invertito-ottica, poi &quot;NUNC Lab-Tek vetrino Chambered&quot; può solo essere usato, e saltare i passaggi # 1 - 2. <ol><li> Collegare uno dei &quot;press-per sigillare-isolante silicio&quot; su un 24 millimetri x 40 vetrino. Premere con decisione l&#39;isolatore allo scorrimento coperchio sul banco di lavoro pulito e guardare dall&#39;altra parte per assicurarsi che l&#39;isolante sia completamente inserito, senza bolle d&#39;aria. </li><li> Optional: Mettere le camere adesione in un piatto di vetro Petri con carta Whatman filtro e autoclave a secco a ciclo per la sterilizzazione. Raffreddarli a RT. </li></ol> Rivestimento della Camera <ol><li> Mettere una goccia da 200 ml di soluzione di lavoro di caderina (10 mg) o fibronectina (20mg/ml) sul centro di una camera di adesione in autoclave, utilizzando sigmacoated punte gialle. Incubare a temperatura ambiente per 4 ore. </li><li> Estrarre la soluzione caderina o fibronectina e trasferirli in un tubo di 1,5 ml. Questa soluzione può essere riutilizzati per successive due settimane. </li><li> Dispensare 500 ml del 4% BSA in 1x MBS-H per bloccare la camera. Incubare a RT per 1 ora. </li><li> Aspirare la soluzione di BSA. Lavare la camera con 500ml di 1x MBS-H due volte. Dopo il secondo lavaggio, aspirare la maggior parte di MBS-H (non completamente), e conservare in un contenitore sigillato a 4 ° C. Questa camera di adesione è un bene per i prossimi 2 - 3 giorni. </li></ol> Dissezione e dissociazione di espianti Cap Animale <ol><li> Incubare gli embrioni iniettati in 0.1x MBS-H, diluito in base al autoclave 1x MBS-H, in quanto non in autoclave medio porta a volte piccoli germi che possono disturbare il dissociato cellule tappo animali. </li><li> Fai 1x Barth agarosio piatti e CMF-MBS piastre di agarosio con piatti 60mm, almeno tante quanto il numero dei tuoi campioni. Versare autoclave 1x MBS-H per le piastre 1x Barth. Per CMF-MBS piatti, versare 10 ml di CMF-MBS. </li><li> Quando gli embrioni diventano palcoscenico 8,5, avviare sezionare i tappi animale in lamiera uno Barth 1x è. 10-15 espianti per i campioni sono di solito sufficienti per un esperimento. </li><li> Trasferire il espianti animali tappo ad un CMF-MBS piatto. Incubare la espianti per 45 - 60 minuti fino a quando la espianti sono completamente dissociati. Agitazioni delicato in ogni 15 minuti aiuterà la dissociazione. </li></ol> Adesione cellulare Assay <ol><li> Semina delle cellule: Dispensare 500 ml di 1x MBS-H alla camera di adesione preparati nella procedura descritta nelle sezioni di cui sopra, Chambers Assay Adesione e rivestimento della Camera. Trasferire il dissociato cellule animali tappo dalla CMF-MBS piastra alla camera di adesione utilizzando P200 con punte sigmacoated e tritate-off giallo. </li><li> Facoltativo: se possibile, con attenzione succhiano il supporto fino a circa 2 / 3 a metà strada, senza esporre le cellule all&#39;aria. Aggiungere circa la stessa quantità di fresco MBS-H, per assicurarsi che il terreno contiene sufficiente Ca 2 + e Mg 2 +. </li><li> Incubare a RT per 45 - 90 minuti. Controllare le cellule di tanto in tanto per vedere se sono connessi con la superficie inferiore. </li><li> Ora è possibile scattare la foto delle cellule al microscopio. </li><li> Porre la camera di adesione su un vetrino griglia. Allineare uno degli angoli della camera di adesione a un angolo della diapositiva griglia. Contare e registrare il numero delle cellule allegata in varie griglie. </li><li> Versare 1L di MBS-H in un secchio di plastica di grandi dimensioni (ad esempio, Tupperware, ecc.) Delicatamente la camera di scorrimento adesione al fondo del secchio. Ruotare sul agitatore orbitale per cinque minuti a bassa velocità (50 - 60rpm). </li><li> Porre la camera di adesione indietro sulla griglia di scorrimento, allineando stesso angolo della camera verso l&#39;angolo della diapositiva stessa griglia, come è stato fatto nel punto # 5 del presente, di analisi cellulare sezione Adesione. Conta il numero di cellule che rimangono attaccati sulla stessa griglia che avete contato prima del lavaggio. Calcolare la percentuale di cellule che rimangono attaccati dopo il lavaggio. </li></ol>

<table><tbody><tr><td>1x MBS-H</td><td>Tampone</td><td></td><td></td><td>Barth modificato&amp;rsquo;s medio: ricetta per 1 L: 5,14 g di NaCl, 75 mg di KCl, 0,2 g di NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 0,2 g di MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 60 mg di CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 80 mg Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)2&amp;#8226;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;. 38 g di HEPES, acido libero. Regolare il pH a 7,4 con NaOH. Autoclavare.</td></tr><tr><td>CMF-MBS</td><td>Tampone</td><td></td><td></td><td>Questo è Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;-versione libera di MBS-H. Ricetta per 500 mL: 2,57 g di NaCl, 37,5 mg di KCl, 0,1 g di NaHCO₃&lt;sub&gt;3/sub&gt; 1,19 g di HEPES, acido libero. Regolare il pH a 7,4 con NaOH. Autoclavare.</td></tr><tr><td>1% agarosio/1x Barth&amp;rsquo;piastre s</td><td></td><td></td><td></td><td>tanti quanti sono i campioni</td></tr><tr><td>Piastrine di agarosio 1% in CMF-MBS</td><td></td><td></td><td></td><td>tanti quanti sono i campioni</td></tr><tr><td>E-Cadherina/Fc chimera </td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-2278</td><td>Sciogliere 0,1 mg di E-caderina solida in 100 µl di MBS-H 1x contenente il 40% di glicerolo per ottenere una soluzione madre 100x (1,0 mg/ml). Conservare in &amp;#8211;20 &amp;deg;C. Prima dell'uso, preparare una diluizione 1/100 con MBS-H 1x per ottenere una soluzione lavorativa da 10 μg/ml. Sono necessari 200 μl di questa soluzione lavorativa per ogni campione.</td></tr><tr><td>Fibronectina, soluzione allo 0,1% </td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-1141</td><td>Questa soluzione pronta all'uso può essere utilizzata come soluzione madre 50x. Eseguire una diluizione 1:50 con MBS-H 1x per ottenere 20 &amp;mu;soluzione lavorativa g/mL subito prima dell'uso. Sono necessari 200 &amp;mu;L per campioni di questa soluzione lavorativa. NON consiglio di utilizzare Fibronectina solida, poiché è difficile da sciogliere alla concentrazione dello 0,1% per preparare la soluzione madre. Anche se più costosa, questa soluzione pronta all'uso allo 0,1% è preferibile per ottenere risultati costanti.</td></tr><tr><td>4% BSA / MBS-H</td><td>Tampone</td><td></td><td></td><td>BSA: frazione V di grado biologia molecolare</td></tr><tr><td>punte gialle Sigmacoted </td><td>Strumento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coprioggetti n.1</td><td></td><td></td><td></td><td>40 mm x 24 mm o 60 mm x 24 mm</td></tr><tr><td>Isolante in silicone con chiusura a pressione</td><td>Strumento</td><td>Glace Bio-Labs</td><td>JTR20-2.5</td><td>2,5 mm di profondità x 20 mm di diametro</td></tr><tr><td>NUNC Lab-Tek Chambered Coverglass</td><td>Strumento</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-471</td><td>2 pozzetti/vetrini</td></tr><tr><td>Vetrino portaoggetti a griglia</td><td>Strumento</td><td></td><td></td><td>o reticolo del Finder per il conteggio cellulare</td></tr></tbody></table>

dissezione di organizzatore e espianti polo animali da embrioni di xenopus laevis e montaggio di un saggio adesione cellulare

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

Questo video mostra la tecnica utilizzata per la preparazione di organizzatore e di espianti polo animale da embrioni di Xenopus laevis, compreso l&#39;uso del coltello sopracciglio - uno strumento specializzato in dissezione della propria sopracciglio. Il protocollo per l&#39;assemblaggio di un test di adesione è data anche, che le sonde per la presenza di molecole di adesione chiave presenti sulla superficie o organizzatore cellule polo animale che sono fondamentali per un corretto sviluppo.

Dissezione di organizzatore e Espianti Polo animali da embrioni di Xenopus laevis e montaggio di un saggio Adesione Cellulare

Ciao, mi chiamo Sochi Agata. Sono una ricercatrice postdottorato nel laboratorio del dottor Ken Cho, specializzato nello sviluppo della biologia dello sviluppo e cellulare presso l'Università della California di Irvine. Oggi illustrerò la dissezione e il saggio di adesione dell'espansione dell'ectoderma animale o dell'organizzatore proveniente dall'embrione di Xenopus.Questa procedura può essere utilizzata per studiare le caratteristiche di adesione cellulare e la morfologia cellulare delle cellule derivate da tessuti dissezionati. Questa procedura prevede la dissezione di un determinato tessuto dall'embrione di rana Xenopus, la dissociazione delle cellule in un mezzo privo di calcio e magnesio e successivamente il trasferimento delle cellule dissociate in condizioni contenenti calcio e magnesio, sopra un vetrino ricoperto di molecole di adesione cellulare. In questo modo, è possibile studiare il comportamento cellulare, la migrazione cellulare e le caratteristiche di adesione delle cellule X dissezionate in questa procedura.Ok, per tutta questa procedura di dissezione dell'embrione e saggio di adesione, utilizzo innanzitutto strumenti speciali esterni. Questo è un vetrino x 1 privo di calcio e magnesio, ricoperto con agar al 1%. E questo è proprio qui, un vetrino x 1, ricoperto con agar al 1%, sul quale si esegue la dissezione dell'embrione.E poi questo è uno strumento di dissezione, un attrezzo speciale per dissezioni diverso dalla pinzetta. Questo è chiamato coltello per sopracciglia, un nome strano, ma è effettivamente fatto letteralmente con un sopracciglio staccato dal viso. E poi viene attaccato alla punta di una pipetta di pasta.E questo altro strumento qui è chiamato anello di capelli, che consiste nuovamente in un capello che forma un anello sulla punta di una pipetta passata. Non ho utilizzato questo strumento in questa occasione specifica, ma alcune persone preferiscono questo anello di capelli rispetto al coltello a bulbo oculare e quindi per il saggio di adesione. Utilizzo l'isolante in gomma siliconica che viene attaccato sulla parte superiore del vetrino per creare la camera per il saggio di adesione.Quindi, per prima cosa rimuovere l'involucro della vite dall'embrione. Questo pezzo è l'involucro della vite. Poi dissezionare l'aderenza del polo animale.Questo è un progetto animale, non ne hai bisogno. Capovolgi l'embrione e vedrai qui il chiaro labbro dorsale. È bellissimo.Quindi prendere un coltello per l'occhio, appoggiarlo sul lato del labbro dorsale, appoggiare anche sull'altro lato e quindi tagliare questo pezzo appena sotto il labbro dorsale. Questo frammento contiene l'organizzatore e il derma circostante. Si capovolge questo frammento e si stacca la parte addominale dall'organizzatore interno.Me. Ok, in un certo senso distruggo la parte dermica, ma questo non è importante. Quindi va bene. E questo pezzo sul lato destro è la misura dell'organizzatore.Sono appena passato alla parte più pulita della piastra. Il frammento sul lato destro è un pezzo di organizzatore mera e questo è l'embrione intero. Ora potete vedere quanto è grande il pezzo dell'organizzatore.E questo può essere utilizzato per estrarre un certo fattore espressivo della regione organizzatrice, oppure per creare un CD dell'organizzatore nella libreria o per studiare la termatologia nel tessuto romale in migrazione. Prima di dissezionare l'ectoderma animale, è necessario individuare lo stadio corretto. Utilizziamo l'embrione blastocistico allo stadio otto.Ora vediamo nell'immagine tre embrioni a tre stadi diversi. I due embrioni a sinistra sono allo stadio sette, blastocisti, e i due embrioni al centro sono allo stadio otto. I due embrioni a destra sono quasi allo stadio nove, blastocisti tardive.E ci piace osservare, ci piace utilizzare anche lo stadio otto intermedio perché, innanzitutto, si nota chiaramente la differenza tra ciascun blastomero al polo animale. Questo embrione allo stadio otto offre una buona combinazione di ampie dimensioni cellulari e facilità di dissezione rispetto allo stadio sette. Allo stadio sette, le cellule al polo animale sono troppo grandi e il loro numero è troppo ridotto, mentre all'embrione allo stadio nove ogni cellula è troppo piccola e il tessuto esomio al polo animale diventa più sottile rispetto allo stadio otto.Per evitare di ottenere un numero di cellule inferiore a quello desiderato. Prima appoggiate la pinzetta sul lato dell'embrione ed estraete l'involucro vitellino dall'embrione. Questo è l'involucro vitellino.Quindi si disseca la parte centrale del polo animale dall'embrione. Va bene, questo è un bellissimo campione. Il lato sinistro è l'espianato del cappuccio animale dissezionato e questa è il resto dell'embrione.E questo frammento può essere utilizzato, ad esempio, nel modo seguente: se si inietta qualcosa nel polo animale dell'embrione in una fase precoce, come ad esempio il costrutto del gene Porto, successivamente si disseca questo frammento in una fase più tardiva e lo si utilizza per il saggio del Porto, come nel saggio di ricapitolazione. Ora utilizzerò un trapianto per trasferire l'organizzatore x esplan per studiare il saggio di adesione cellulare. Per fare ciò, devo dissociare l'organizzatore x esplan nel mezzo con meccanismo al calcio tre.Quindi sto trasferendo l'esplanato dell'organizzatore da questa piastra per colture standard a una piastra contenente mezzo privo di calcio e magnesio. Tuttavia, per fare ciò, se si ha molta destrezza manuale, si può utilizzare la normale pipetta di trasferimento, ma si corre comunque un certo rischio di danneggiare l'embrione durante l'operazione. Per questo motivo, di solito uso una pipetta P200 con un puntale giallo.E questa punta gialla è precedentemente codificata con un codice chimico singolo per impedire alle cellule di aderire alla parete della punta gialla. Inoltre, ho tagliato la punta con le forbici all'estremità della punta gialla, rendendola ora smussata e a largo foro, in modo da minimizzare il rischio di danneggiare l'explants DX. Bene, ora ciò che vedete nell'immagine sono i due explants dell'organizzatore e li trasferirò da questa piastra Petri con mezzo normale a una piastra con mezzo privo di calcio e meccanismi.Aspirare lentamente questi pezzi e trasferirli nel mezzo privo di calcio e magnesio. E ora come, così è come appaiono all'inizio e ora come si dissociano quasi a livello di singola cellula. Ora gli espianti organizzati si trovano nel mezzo privo di calcio e magnesio e li incuberò nel mezzo privo di calcio e magnesio per un'ora, in modo da permettere la loro dissociazione a livello di singola cellula per il passaggio successivo per lo studio della morfologia o del comportamento cellulare. Dopo un'ora di incubazione, le cellule, cioè gli espianti organizzati, dovrebbero essere dissociati.Stanno abbastanza bene. E ora date un'occhiata ai microscopi e al microscopio. Sono, sì, sembrano abbastanza azione.Ok, ora sto studiando il comportamento cellulare nella camera di imaging costituita da un vetrino, che è stata rivestita con cadherina o INE o un altro tipo di molecola di adesione cellulare per creare una camera di imaging per l'adesione cellulare. Prendo questo vetrino e anche questo isolante in gomma siliconica e semplicemente pongo l'isolante in gomma siliconica sulla superficie del vetrino, premendo con fermezza per assicurarmi che aderisca completamente lungo tutto il bordo circolare. Quindi osservo dal lato opposto per verificare che l'adesione sia completa, in modo che il liquido non possa fuoriuscire dalla parte superiore.Su questa camera di sabbia versare una goccia di 200 microlitri di sospensione cellulare, contenente proteine di adesione cellulare come la coesina o la fibronectina. Successivamente, bloccare la camera con 500 microlitri di BSA al 4%. Infine, sostituire la BSA con il normale mezzo di coltura a concentrazione 1x.E ora sembra che qui ci sia una camera pronta per trasportare la cellula. Prendo quindi nuovamente questa, una pipetta P 200 dotata di punta gialla tagliata e rivestita con codice sigma, ed aspiro la cellula dal mezzo privo di calcio e magnesio verso questa camera, che contiene il mezzo, il quale include anche calcio e magnesio. Ora, bene, sto trasferendo questo organizzatore dissociato X point utilizzando la P 200.Prima si inserisce questa pipetta P200 ed si aspira delicatamente la cellula, quindi la si può spostare su e giù molto dolcemente. In ogni caso, tendo a distribuire le cellule in tutta la zona, ma per assicurarsi che siano cellule singole, si posiziona la camera per imaging al centro del campo visivo, quindi si distribuiscono le cellule in tutta la camera per imaging. Ora le cellule sono distribuite sulla superficie rivestita.E vediamo, nel capillare superiore le cellule hanno questo aspetto. Ok, dopo due o tre ore di disseminazione delle cellule nella camera adesiva, conto le cellule in questa camera utilizzando questo microscopio. In genere, quando si cerca di studiare l'adesione delle cellule organizzatrici da un espianto dell'organizzatore, si lasciano le cellule sulla superficie del vetrino rivestito per due o tre ore.E successivamente è possibile quantificare il numero di cellule sul vetrino al microscopio prima del lavaggio. Per rimuovere le cellule legate o non legate al DO tre, è sufficiente posizionare la camera Hession nel secchio contenente un'ampia quantità di tampone. Quindi si avvia l'agitazione a una velocità molto bassa, circa 50 giri al minuto, che corrisponde a questa velocità, e si attendono cinque minuti.Dopo cinque minuti, estrarre con attenzione questa camera di adesione senza esporre la cellula all'interno della camera stessa. Estrarre quindi con cura la camera in questo modo, rimuovere il tampone in eccesso e osservare nuovamente al microscopio per contare la percentuale di cellule che rimangono attaccate alla superficie rivestita. Dopo il lavaggio, riposizionare la camera di adesione esattamente nello stesso punto per assicurarsi di osservare la medesima posizione precisa della camera di adesione.E ora iniziate a contare. Su questo schermo, sto mostrando due diversi tipi di cellule con lo stesso tipo di molecola di adesione cellulare. Questi due tipi di cellule mostrano caratteristiche di adesione completamente diverse sulla stessa proteina.Sulla sommità della stessa proteina adesiva per cellule adesive. Potremmo anche utilizzare questa cellula dissociata dall'espianto per studiarne il comportamento di aggregazione o migrazione mediante imaging a intervalli di tempo.

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