Name: Dissezione di organizzatore e Espianti Polo animali da embrioni di Xenopus laevis e montaggio di un saggio Adesione Cellulare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 21 s
Description: Impara la dissezione di esplanti di polo animale e organizzatore da embrioni di Xenopus laevis e il montaggio di un saggio di adesione cellulare. Questo metodo consente di studiare le caratteristiche di adesione e migrazione cellulare.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Preparazione Chambers Adesione (il giorno prima l&#39;iniezione / dissezione) Adesione saggio Chambers Se si dispone di un microscopio convenzionale composto (localizza ottica sopra il palco), è ncecessary fare una bassa altezza camera di adesione come segue. Se si utilizza il microscopio invertito-ottica, poi &quot;NUNC Lab-Tek vetrino Chambered&quot; può solo essere usato, e saltare i passaggi # 1 - 2. <ol><li> Collegare uno dei &quot;press-per sigillare-isolante silicio&quot; su un 24 millimetri x 40 vetrino. Premere con decisione l&#39;isolatore allo scorrimento coperchio sul banco di lavoro pulito e guardare dall&#39;altra parte per assicurarsi che l&#39;isolante sia completamente inserito, senza bolle d&#39;aria. </li><li> Optional: Mettere le camere adesione in un piatto di vetro Petri con carta Whatman filtro e autoclave a secco a ciclo per la sterilizzazione. Raffreddarli a RT. </li></ol> Rivestimento della Camera <ol><li> Mettere una goccia da 200 ml di soluzione di lavoro di caderina (10 mg) o fibronectina (20mg/ml) sul centro di una camera di adesione in autoclave, utilizzando sigmacoated punte gialle. Incubare a temperatura ambiente per 4 ore. </li><li> Estrarre la soluzione caderina o fibronectina e trasferirli in un tubo di 1,5 ml. Questa soluzione può essere riutilizzati per successive due settimane. </li><li> Dispensare 500 ml del 4% BSA in 1x MBS-H per bloccare la camera. Incubare a RT per 1 ora. </li><li> Aspirare la soluzione di BSA. Lavare la camera con 500ml di 1x MBS-H due volte. Dopo il secondo lavaggio, aspirare la maggior parte di MBS-H (non completamente), e conservare in un contenitore sigillato a 4 ° C. Questa camera di adesione è un bene per i prossimi 2 - 3 giorni. </li></ol> Dissezione e dissociazione di espianti Cap Animale <ol><li> Incubare gli embrioni iniettati in 0.1x MBS-H, diluito in base al autoclave 1x MBS-H, in quanto non in autoclave medio porta a volte piccoli germi che possono disturbare il dissociato cellule tappo animali. </li><li> Fai 1x Barth agarosio piatti e CMF-MBS piastre di agarosio con piatti 60mm, almeno tante quanto il numero dei tuoi campioni. Versare autoclave 1x MBS-H per le piastre 1x Barth. Per CMF-MBS piatti, versare 10 ml di CMF-MBS. </li><li> Quando gli embrioni diventano palcoscenico 8,5, avviare sezionare i tappi animale in lamiera uno Barth 1x è. 10-15 espianti per i campioni sono di solito sufficienti per un esperimento. </li><li> Trasferire il espianti animali tappo ad un CMF-MBS piatto. Incubare la espianti per 45 - 60 minuti fino a quando la espianti sono completamente dissociati. Agitazioni delicato in ogni 15 minuti aiuterà la dissociazione. </li></ol> Adesione cellulare Assay <ol><li> Semina delle cellule: Dispensare 500 ml di 1x MBS-H alla camera di adesione preparati nella procedura descritta nelle sezioni di cui sopra, Chambers Assay Adesione e rivestimento della Camera. Trasferire il dissociato cellule animali tappo dalla CMF-MBS piastra alla camera di adesione utilizzando P200 con punte sigmacoated e tritate-off giallo. </li><li> Facoltativo: se possibile, con attenzione succhiano il supporto fino a circa 2 / 3 a metà strada, senza esporre le cellule all&#39;aria. Aggiungere circa la stessa quantità di fresco MBS-H, per assicurarsi che il terreno contiene sufficiente Ca 2 + e Mg 2 +. </li><li> Incubare a RT per 45 - 90 minuti. Controllare le cellule di tanto in tanto per vedere se sono connessi con la superficie inferiore. </li><li> Ora è possibile scattare la foto delle cellule al microscopio. </li><li> Porre la camera di adesione su un vetrino griglia. Allineare uno degli angoli della camera di adesione a un angolo della diapositiva griglia. Contare e registrare il numero delle cellule allegata in varie griglie. </li><li> Versare 1L di MBS-H in un secchio di plastica di grandi dimensioni (ad esempio, Tupperware, ecc.) Delicatamente la camera di scorrimento adesione al fondo del secchio. Ruotare sul agitatore orbitale per cinque minuti a bassa velocità (50 - 60rpm). </li><li> Porre la camera di adesione indietro sulla griglia di scorrimento, allineando stesso angolo della camera verso l&#39;angolo della diapositiva stessa griglia, come è stato fatto nel punto # 5 del presente, di analisi cellulare sezione Adesione. Conta il numero di cellule che rimangono attaccati sulla stessa griglia che avete contato prima del lavaggio. Calcolare la percentuale di cellule che rimangono attaccati dopo il lavaggio. </li></ol>

<table><tbody><tr><td>1x MBS-H</td><td>Tampone</td><td></td><td></td><td>Barth modificato&amp;rsquo;s medio: ricetta per 1 L: 5,14 g di NaCl, 75 mg di KCl, 0,2 g di NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 0,2 g di MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 60 mg di CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 80 mg Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)2&amp;#8226;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;. 38 g di HEPES, acido libero. Regolare il pH a 7,4 con NaOH. Autoclavare.</td></tr><tr><td>CMF-MBS</td><td>Tampone</td><td></td><td></td><td>Questo è Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;-versione libera di MBS-H. Ricetta per 500 mL: 2,57 g di NaCl, 37,5 mg di KCl, 0,1 g di NaHCO₃&lt;sub&gt;3/sub&gt; 1,19 g di HEPES, acido libero. Regolare il pH a 7,4 con NaOH. Autoclavare.</td></tr><tr><td>1% agarosio/1x Barth&amp;rsquo;piastre s</td><td></td><td></td><td></td><td>tanti quanti sono i campioni</td></tr><tr><td>Piastrine di agarosio 1% in CMF-MBS</td><td></td><td></td><td></td><td>tanti quanti sono i campioni</td></tr><tr><td>E-Cadherina/Fc chimera </td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-2278</td><td>Sciogliere 0,1 mg di E-caderina solida in 100 µl di MBS-H 1x contenente il 40% di glicerolo per ottenere una soluzione madre 100x (1,0 mg/ml). Conservare in &amp;#8211;20 &amp;deg;C. Prima dell'uso, preparare una diluizione 1/100 con MBS-H 1x per ottenere una soluzione lavorativa da 10 μg/ml. Sono necessari 200 μl di questa soluzione lavorativa per ogni campione.</td></tr><tr><td>Fibronectina, soluzione allo 0,1% </td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-1141</td><td>Questa soluzione pronta all'uso può essere utilizzata come soluzione madre 50x. Eseguire una diluizione 1:50 con MBS-H 1x per ottenere 20 &amp;mu;soluzione lavorativa g/mL subito prima dell'uso. Sono necessari 200 &amp;mu;L per campioni di questa soluzione lavorativa. NON consiglio di utilizzare Fibronectina solida, poiché è difficile da sciogliere alla concentrazione dello 0,1% per preparare la soluzione madre. Anche se più costosa, questa soluzione pronta all'uso allo 0,1% è preferibile per ottenere risultati costanti.</td></tr><tr><td>4% BSA / MBS-H</td><td>Tampone</td><td></td><td></td><td>BSA: frazione V di grado biologia molecolare</td></tr><tr><td>punte gialle Sigmacoted </td><td>Strumento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coprioggetti n.1</td><td></td><td></td><td></td><td>40 mm x 24 mm o 60 mm x 24 mm</td></tr><tr><td>Isolante in silicone con chiusura a pressione</td><td>Strumento</td><td>Glace Bio-Labs</td><td>JTR20-2.5</td><td>2,5 mm di profondità x 20 mm di diametro</td></tr><tr><td>NUNC Lab-Tek Chambered Coverglass</td><td>Strumento</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-471</td><td>2 pozzetti/vetrini</td></tr><tr><td>Vetrino portaoggetti a griglia</td><td>Strumento</td><td></td><td></td><td>o reticolo del Finder per il conteggio cellulare</td></tr></tbody></table>

dissezione di organizzatore e espianti polo animali da embrioni di xenopus laevis e montaggio di un saggio adesione cellulare

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

Questo video mostra la tecnica utilizzata per la preparazione di organizzatore e di espianti polo animale da embrioni di Xenopus laevis, compreso l&#39;uso del coltello sopracciglio - uno strumento specializzato in dissezione della propria sopracciglio. Il protocollo per l&#39;assemblaggio di un test di adesione è data anche, che le sonde per la presenza di molecole di adesione chiave presenti sulla superficie o organizzatore cellule polo animale che sono fondamentali per un corretto sviluppo.

Dissezione di organizzatore e Espianti Polo animali da embrioni di Xenopus laevis e montaggio di un saggio Adesione Cellulare

Ciao, mi chiamo Sochi Agata. Sono una ricercatrice postdottorato nel laboratorio del dottor Ken Cho, specializzato nello sviluppo della biologia dello sviluppo e cellulare presso l'Università della California di Irvine. Oggi illustrerò la dissezione e il saggio di adesione dell'espansione dell'ectoderma animale o dell'organizzatore proveniente dall'embrione di Xenopus.Questa procedura può essere utilizzata per studiare le caratteristiche di adesione cellulare e la morfologia cellulare delle cellule derivate da tessuti dissezionati. Questa procedura prevede la dissezione di un determinato tessuto dall'embrione di rana Xenopus, la dissociazione delle cellule in un mezzo privo di calcio e magnesio e successivamente il trasferimento delle cellule dissociate in condizioni contenenti calcio e magnesio, sopra un vetrino ricoperto di molecole di adesione cellulare. In questo modo, è possibile studiare il comportamento cellulare, la migrazione cellulare e le caratteristiche di adesione delle cellule X dissezionate in questa procedura.Ok, per tutta questa procedura di dissezione dell'embrione e saggio di adesione, utilizzo innanzitutto strumenti speciali esterni. Questo è un vetrino x 1 priv

dissection-organizer-animal-pole-explants-from-xenopus-laevis-embryos

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo test valuta la capacità di una molecola di segnalazione, qui proteina morfogenetica dell'osso 7 (BMP7), di riorientare gli assoni commissurali. Un espianto di midollo embrionale dorsale spinale è colta adiacente a un aggregato di cellule secernenti COS i fattori di crescita candidato. Riorientato assoni commissurali crescita all'interno del espianto sono visualizzati mediante immunoistochimica.

Capacità di analizzare il diffusibili molecole di segnalazione per l&#39;orientamento embrionali assoni spinali commissurali

Animale tappi iperespressione del gene prodotto (s) sono trapiantati al fianco di...

Determinazione del tessuto Utilizzando il trapianto Cap animali (ACT) Assay in Xenopus laevis</em

Xenopus embrionale epiteli sono un sistema modello ideale per studiare i comportamenti delle cellule, come lo sviluppo di polarità e cambiare forma durante la morfogenesi epiteliale. Istologia tradizionale di campioni fisso è sempre più integrato da live-cell imaging confocale. Qui mostriamo metodi per isolare i tessuti rana e visualizzare dal vivo le cellule epiteliali e le loro citoscheletro con live-cell microscopia confocale.

Live-cell imaging e analisi quantitativa della embrionali in cellule epiteliali Xenopus laevis</em

Xenopus ectoderma embrionale è diventato un modello attraente per gli studi di polarità cellulare. Un saggio è descritta, in cui la distribuzione subcellulare delle proteine ​​fluorescenti è valutata in cellule ectoderma. Questo protocollo aiuterà a trattare questioni relative al controllo spaziale della segnalazione.

Traslocazione polarizzato di proteine ​​fluorescenti in Xenopus</emEctoderma> in risposta alla segnalazione Wnt

Culture Explant neurali di<em&gt; Xenopus laevis</em

Xenopus laevis fornisce un sistema modello ideale per studiare il destino specificazione delle cellule e la funzione fisiologica delle singole cellule retiniche in colture cellulari primarie. Presentiamo qui una tecnica per la dissezione e la generazione di tessuti retinici colture cellulari primarie che vengono esposte ad attività calcio e analizzati mediante ibridazione in situ.

Dissezione, Cultura, e analisi di<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tessuto embrionale della retina

Questo protocollo descrive come sezionare premigratory cresta neurale cranica (NC) da Xenopus laevis neurulas. Tali espianti possono essere placcati in fibronectina e coltivate in vitro, o innestate di nuovo in embrioni di accoglienza. Questa tecnica consente di studiare i meccanismi di NC epitelio a mesenchima transizione, migrazione e differenziazione.

Dissezione dei<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Cresta neurale per<em&gt; In vitro</em&gt; Espianto Cultura o<em&gt; In vivo</em&gt; Trapianto

Il manoscritto qui fornisce un semplice insieme di metodi per analizzare la secrezione e la diffusione di fluorescenza ligandi marcati nel Xenopus. Ciò fornisce un contesto per valutare la capacità di altre proteine ​​di modificare la distribuzione ligando e permettendo esperimenti che possono dare comprensione dei meccanismi che regolano gradienti morphogen.

Utilizzando Analisi confocale di<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Per Indagare modulatori di Wnt e Shh morphogen gradienti

Negli embrioni di Xenopus, le cellule del tetto del blastocele sono pluripotenti e possono essere programmate per generare vari tessuti. Qui, descriviamo i protocolli per utilizzare gli espianti di tetti di blastocele di anfibi come sistema di analisi per studiare le caratteristiche chiave in vivo e in vitro dello sviluppo neurale precoce.

Cellule staminali simil-<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionali espianti di studiare Caratteristiche precoce dello sviluppo neurale<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Vi presentiamo un protocollo in due parti che combina l'imaging fluorescente del calcio con l'ibridazione in situ, permettendo allo sperimentatore di correlare i modelli di attività del calcio con i profili di espressione genica a livello unicellulare.

Imaging fluorescente del calcio e successiva ibridazione in situ per la caratterizzazione neuronale del precursore in Xenopus laevis

Descriviamo un semplice protocollo per sviluppare organoidi epiteliali mucociliari da cellule ectodermi profonde isolate dagli embrioni xenopus laevis. I progenitori multipotenti rigenerano i precursori delle cellule del calice epiteliale e permettono il tracciamento vivo dell'iniziazione e della progressione delle transizioni cellulari sulla superficie degli organoidi.

Organoidi epiteliali mucociliari di cellule embrionali xenopus: generazione, coltura e imaging dal vivo ad alta risoluzione

Impara la dissezione di esplanti di polo animale e organizzatore da embrioni di Xenopus laevis e il montaggio di un saggio di adesione cellulare. Questo metodo consente di studiare le caratteristiche di adesione e migrazione cellulare.

Dissezione di organizzatore e Espianti Polo animali da embrioni di Xenopus laevis e montaggio di un saggio Adesione Cellulare

Esplora altri video