Applicazione di metodi Stopped-flow Cinetica per Indagare sulla Meccanismo d'azione di una proteina di riparazione del DNA

Questa è una presentazione di due metodi a flusso arrestato per misurare la cinetica delle reazioni della proteina di riparazione degli errori di appaiamento del DNA mush due mush sei A. Mush due sei riconosce gli appaiamenti errati delle basi nel DNA e avvia la riparazione mediante una reazione alimentata da ATP. Il primo metodo misura il legame di mush due mush sei al DNA attraverso l'aumento della fluorescenza di una base di due amino purina posizionata adiacente a una coppia di basi GT con errore di appaiamento nel DNA. I reagenti vengono mescolati in uno strumento a flusso arrestato e monitorati nel tempo per determinare la costante di velocità.

Il secondo metodo misura l'attività della mush due mush sei ATPasi utilizzando un reporter costituito da una proteina fluorescente legante il fosfato. I reagenti vengono mescolati in un apparato a flusso arrestato e monitorati nel tempo. Per determinare le costanti di velocità dell'idrolisi dell'ATP e del rilascio del fosfato, i dati cinetici ottenuti chiariscono il meccanismo d'azione della mush due mush sei nella riparazione delle dissomiglianze del DNA.

Ciao, sono Noah Biro del Laboratorio di MONI del dipartimento di biologia molecolare e biochimica dell'Università di Wesleyan. Ehi, sono DJ J, anch'io del Laboratorio di Man all'Università di Wesleyan. E sono Chris Dset, anch'io del Laboratorio di JI'S.

Oggi vi mostreremo due saggi basati su fluorescenza per monitorare la cinetica di una reazione su scala temporale del millisecondo. Utilizziamo questi metodi nel nostro laboratorio per studiare come la proteina DA ripari meh sei si leghi alle coppie di basi appaiate in modo errato nel DNA e avvii la riparazione. Cominciamo dunque.

Prima che questa procedura possa iniziare, devono essere disponibili i reagenti proteici e di DNA richiesti. Ottenere la proteina MutS–MutL–Msh6 precedentemente sovraespressa in coli e purificata mediante cromatografia a scambio ionico e affinità. Per generare i reagenti di DNA, acquistare DNA a singolo filamento modificato con l'analogolo nucleotidico fluorescente amino purina, purificare i filamenti mediante elettroforesi su gel di poliacrilamide denaturante ed eluirli per generare un DNA duplex con appaiamento errato contenente due amino purine adiacenti a un appaiamento errato GT.

In modo analogo, preparare il DNA non marcato a partire da DNA a singolo filamento non modificato. Le sequenze di DNA utilizzate in questo caso sono riportate nella parte scritta del presente protocollo. Durante l'intero procedimento, garantire un'elevata integrità sperimentale utilizzando reagenti di alta qualità per minimizzare le impurità fluorescenti.

Filtrare inoltre tutte le soluzioni stock attraverso una membrana da 0,2 micrometri per rimuovere le particelle che potrebbero ostruire lo strumento a flusso interrotto. Per preparare gli esperimenti di legame al DNA, preparare i campioni con un volume finale di 400 microlitri per campione, quantità sufficiente per circa 10 tracce cinetiche. Mantenere i campioni sul ghiaccio.

Per mantenere l'attività proteica, preparare il campione di DNA a 0,12 micromolare e il campione mush due mush sei a 0,8 micromolare in tampone di legame al DNA. Ciò porterà a concentrazioni finali di 0,06 micromolare di DNA e 0,4 micromolare di mush. Due M sei dopo un mescolamento uno a uno nello stopped flow.

Uno strumento a flusso arrestato utilizza un motore di avanzamento per spingere simultaneamente e rapidamente le soluzioni reagenti dalle siringhe di avanzamento verso un dispositivo di mescolamento. La soluzione mescolata fluisce quindi in una cella di osservazione per la raccolta dei dati, preparando lo strumento. Per prima cosa, assicurarsi che il computer e il controllore siano spenti.

Quindi accendere il bagno di acqua circolante per raffreddare la lampada e accendere la lampada. Impostare il monocromatore sulla lunghezza d'onda di eccitazione desiderata, pari a 315 nanometri. Per la due amino purina, impostare la larghezza dello SL sul valore desiderato.

Inserire un filtro con lunghezza d'onda di taglio a 350 nanometri al fotomoltiplicatore o PMT per raccogliere il segnale fluorescente delle due purine amminiche. Accendere il controller e il computer. Successivamente, accendere il bagno d'acqua circolante.

Questo riempie la camicia d'acqua intorno alle siringhe di comando per mantenere la reattanza alla temperatura desiderata durante l'esperimento. Infine, eseguire il programma di arresto del flusso tramite il menu di controllo P-M-T-H-V. Impostare la tensione del PMT, che inizialmente può essere variata per regolare la sensibilità del PMT, ma deve essere mantenuta costante.

Durante l'esperimento, misurare la corrente oscura per correggere il rumore elettrico di fondo. Successivamente, lavare le siringhe del drive a flusso arrestato e la cella di osservazione. Impostare la valvola di caricamento del campione sulla posizione di caricamento.

Riempire una siringa da un millilitro con acqua deionizzata filtrata. Collegare la siringa al portello di caricamento situato sotto la siringa motrice e spingere l'acqua tra le due siringhe. Ripetere il processo due volte per ciascuna.

Spostare la siringa da utilizzare nell'esperimento. Quindi riempire le siringhe di azionamento con acqua per lavare la cella di osservazione. Passare la valvola di caricamento del campione sulla posizione di fuoco.

Utilizzare il comando di regolazione della siringa per abbassare la piastra di spinta e far passare l'acqua attraverso la cella di osservazione e nel tubo di uscita. Prestare attenzione a non spingere lo stantuffo fino all'estremità della siringa di spinta. Infine, sollevare la piastra di spinta e commutare la valvola sulla posizione di caricamento.

Lavare una volta con il buffer di reazione e svuotare le siringhe. Per iniziare gli esperimenti di legame del DNA, trasferire ciascun campione dal tubo a una siringa fresca da un millilitro. Collegare ciascuna siringa a una porta di carico e spingere la soluzione nella siringa motrice.

Rimuovere eventuali bolle d'aria spingendo manualmente la soluzione tra le due siringhe con pause intermittenti. Quindi abbassare la piastra di avanzamento fino a quando non entra in contatto con la parte superiore delle siringhe di avanzamento. Per la raccolta dei dati, aprire la finestra dei canali temporali impostati.

Selezionare la modalità del canale di raccolta dati per l'analisi e il numero di tracce da acquisire. Inserire il tempo di raccolta dati durante il quale verranno acquisiti 1000 punti dati. Successivamente, impostare la valvola sulla posizione di accensione e fare clic sul pulsante per la raccolta dei dati.

Questa azione avvia il mescolamento del mush due, del mush sei e del DNA, seguito dall'inizio dell'osservazione della reazione. L'emissione fluorescente cellulare derivante dalla due amino purina viene monitorata nel tempo. Acquisisci almeno cinque tracciati cinetici per ottenere un insieme di dati di alta qualità e salva il file al termine dell'esperimento.

Aprire ciascun file di dati e mediare più tracce cinetiche. Successivamente, salvare il file di dati mediato ed esportarlo in un programma di grafica per l'analisi. Infine, spegnere la lampada e lavare accuratamente le siringhe e la cella di osservazione con acqua.

Quindi spegnere il resto dell'equipaggiamento, lasciando acceso soltanto il bagno a circolazione d'acqua. Questo deve rimanere acceso per ulteriori 15 minuti al fine di raffreddare la lampada. I dati cinetici relativi al legame di mush due mush sei al DNA non appaiato sono meglio descritti da una funzione esponenziale singola, che fornisce una velocità rapida di associazione dell'ordine di 10 alla settima per molare al secondo. Analoghi esperimenti con tecnica di stopped flow forniscono la velocità di dissociazione del complesso mush due mush sei con DNA non appaiato, che avviene molto lentamente, tra 0,01 e 0,02 al secondo.

Questi risultati forniscono una misura diretta della velocità e dell'affinità con cui mush due mush sei si lega. Mush due mush sei riconosce una coppia di basi non complementari durante la reazione di riparazione del DNA. Successivamente, verrà eseguito un esperimento con tecnica del flusso arrestato per misurare l'attività ATPasica di mush due mush sei.

In condizioni di stato pre-studio per questo saggio, è assolutamente essenziale evitare l'uso del vetro in tutte le fasi della preparazione dei reagenti, inclusa la purificazione di proteine e DNA, al fine di minimizzare i livelli di fosfato di fondo. La proteina legante il fosfato, o PBP, purificata da e coli e marcata con il fluorocromo MDCC, viene utilizzata come reporter per misurare il rilascio di fosfato successivo all'idrolisi dell'ATP. M-D-C-C-P-B-P è un reporter affidabile della cinetica di idrolisi dell'ATP e del rilascio di fosfato nello stato pre-studio. Questa molecola lega il fosfato in modo rapido e con elevata affinità, determinando un forte aumento della fluorescenza MDCC.

Preparare un campione con quattro micromolar di mush, due mush sei proteine con o senza sei micromolar di DNA non appaiato. Preparare un altro campione con un millimolar di HEP appena disciolto e 20 micromolar di M-D-C-C-P-V-P per eliminare eventuali fosfati contaminanti. Aggiungere purina, nucleoside, fosforilasi e sette metil guanina ai campioni e incubare sul ghiaccio per almeno 20 minuti.

Preparare lo strumento a flusso interrotto come descritto in precedenza. Inoltre, rimuovere eventuali contaminanti fosfato dalle siringhe di avanzamento mediante purina, nucleoside, fosforilazione e sette metil guanina. Incubare per 20 minuti. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione a 425 nanometri e utilizzare un filtro taglia a 450 nanometri con il PMT per la rilevazione della fluorescenza di M-D-C-C-P-B-P.

Caricare le siringhe del drive con i campioni come descritto in precedenza. Impostare i parametri di acquisizione dati e fare clic su "acquisisci dati" per mescolare mush due mush sei con un TP e monitorare il rilascio di fosfato da parte di mush due mush sei e l'aumento accoppiato della fluorescenza di M-D-C-C-P-P-P. Nel tempo, acquisire almeno cinque tracce cinetiche per ottenere un insieme di dati di alta qualità, salvare il file, mediare più tracce cinetiche ed esportare il file dati per l'analisi come descritto in precedenza. Preparare una curva di calibrazione per determinare la relazione lineare tra concentrazione di fosfato e fluorescenza di M-D-C-C-P-P-P: mescolare prima M-D-C-C-P-P-P con diverse concentrazioni di fosfato nelle stesse condizioni sperimentali nel flusso arrestato.

Quindi tracciare la fluorescenza massima M-D-C-C-P-P-P in funzione di ciascuna concentrazione di fosfato per la curva di calibrazione e utilizzare il coefficiente angolare per determinare la concentrazione di fosfato nelle reazioni mush due mush sei. Riportare la concentrazione di fosfato in funzione del tempo ed interpolare i dati con una funzione esponenziale e una lineare. Questa funzione descrive un burst di idrolisi di A TP e rilascio di fosfato nello stato pre-studio, seguito dalla fase lineare allo stato stazionario della reazione. I dati cinetici mostrano che mush due mush sei idrolizza l'A TP e rilascia fosfato rapidamente a 1,4 al secondo nel primo ciclo catalitico.

Segue quindi un passaggio lento nella reazione che limita i successivi cicli a una costante catalitica allo stato stazionario sette volte più lenta, pari a 0,2 al secondo. Tuttavia, quando mush to mush sei è legato al DNA con appaiamento errato, il brusco rilascio di idrolisi del TP e di fosfato viene soppresso. Questi risultati dimostrano direttamente che, al legame con una coppia di basi non complementari, il DNA mush to mush sei passa a uno stato con TP legato.

Questa commutazione rappresenta un passaggio fondamentale nella reazione di riparazione del DNA. Vi abbiamo appena mostrato come utilizzare uno strumento di tipo stop-flow per misurare in tempo reale le velocità di una reazione. Tali misurazioni hanno permesso di approfondire la comprensione del meccanismo d'azione di MASH2 e MASH6 e della riparazione del DNA mediante riconoscimento degli errori di appaiamento.

Quando si eseguono questo tipo di esperimenti, è importante ricordare di utilizzare reagenti di alta qualità, inclusi DNA e proteine molto puri, e prestare particolare attenzione alla contaminazione da fosfati nel saggio degli ATP. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.