Scatter microscopia ottica Sulla base bidimensionale Filtri di Gabor

In questo video, la microscopia ottica a dispersione viene utilizzata per quantificare la frammentazione mitocondriale durante l'apoptosi. Sebbene la microscopia ottica a dispersione non richieda normalmente la fluorescenza in questo protocollo, le immagini fluorescenti verranno acquisite a scopo di convalida. Dopo la configurazione del sistema di imaging, le cellule vengono etichettate con MIT tracker green e trattate con sporina di stor per indurre l'apoptosi.

I dati ottici vengono acquisiti per rilevare i cambiamenti nell'orientamento degli organelli cellulari entro due ore. L'insorgenza della frammentazione mitocondriale può essere misurata utilizzando i dati ottici diffusi, che mostrano una diminuzione del grado di orientamento delle particelle subcellulari. I dati vengono quindi convalidati correlando i dati ottici diffusi con le regioni fluorescenti contenenti mitocondri.

Ciao, sono Nada Bustani del Laboratorio di Bio Ottica del Dipartimento di Ingegneria Biomedica della Rutgers University. Sono Rob Pak del Bio Optics Lab, e sono Deen anche lui del Bio Lab. Oggi vi mostriamo una procedura per quantificare le dinamiche morfologiche subcellulari utilizzando un metodo che non si basa su coloranti fluorescenti.

Utilizziamo questa tecnica nel nostro laboratorio per studiare i cambiamenti dinamici nella struttura subcellulare durante l'apoptosi o programmare la morte cellulare. Quindi iniziamo. Inizia questa procedura sterilizzando le mani guantate con etanolo al 70%.

Quindi posizionare una soluzione madre preparata da 100 nano molari di miot tracker green e preriscaldare, terreno di coltura cellulare BAEC nella cappa con la luce spenta e sterilizzare tutte le superfici. Quindi, posizionare una piastra di coltura a sei pozzetti con celle piatte su un vetro di copertura sotto il cofano. Utilizzando una pipetta per pasta collegata a una linea del vuoto.

Rimuovere il terreno cellulare dai pozzetti. Quindi aggiungere immediatamente due millilitri del terreno marcato a ciascun pozzetto per etichettare le cellule. Mitocondri. Coprire la piastra di coltura tissutale per evitare l'esposizione alla luce diretta della stanza e riposizionare rapidamente le cellule nell'incubatore.

Incubare per 45 minuti a 37 gradi Celsius mentre le cellule incubano. Preparare la configurazione ottica, per prima cosa accendere l'arco di mercurio clamp. Quindi accendere le fotocamere del microscopio del computer e collegare il laser al dispositivo digitale a micro specchio o DMD al diffusore rotante.

Quindi, guarda attraverso l'oculare del microscopio per vedere se il lancio ottico è allineato. Il campo visivo deve essere illuminato in modo brillante dalla luce laser. Per caricare il campione, posizionare una o due piccole gocce di olio da immersione su un obiettivo da immersione in olio 63 x mentre è completamente abbassato.

Quindi sul palco montare una slitta costituita da una griglia di linee a intervalli regolari di 10 micrometri chiamata gradi, e sollevare l'obiettivo in modo che l'olio ne afferri il fuoco. Quindi, focalizzare il bordo esagonale del campo del condensatore. Fermarsi in modo che sia allineato nell'illuminazione centrale di Kohler.

Il bordo esagonale deve essere centrato nell'oculare e messo a fuoco in modo nitido. Quindi, utilizzando le manopole di posizione dell'arresto del campo del condensatore al centro, il campo del condensatore, l'arresto sul campo visivo. Avviare IP lab e inserire le impostazioni per utilizzare la telecamera.

Verificare che la fotocamera sia impostata sulla modalità di trasferimento fotogrammi. Esegui il comando di acquisizione dello stato attivo per avviare l'anteprima dal vivo. Quindi imposta il prefisso dell'indice e la posizione del file in cui verranno salvate le immagini.

Quindi, avviare l'immagine RS. Designare le impostazioni per utilizzare la fotocamera a scatto freddo. La modalità di cronometraggio deve essere impostata su normale.

Avviare il software DMD. Posiziona l'iride del campo scuro nel menu dello script. Quindi fare clic su carica e ripristina.

Per eseguire manualmente lo script, impostare la barra opzionale del microscopio nella finestra su LSM. Questo invierà l'immagine attraverso il DMD nell'ottica allineata. Proiezione dell'immagine in campo scuro sul CCD della telecamera Cascade five 12.

L'immagine del campo scuro dovrebbe apparire nell'anteprima dal vivo in IP lab. Se necessario, metti a fuoco l'immagine sull'anteprima dal vivo. Impostare il tempo di esposizione su un valore sufficientemente alto da garantire almeno 10.000 conteggi di segnale nell'immagine.

Quindi scatta un'istantanea del campo visivo utilizzando il comando di acquisizione singolo dopo l'acquisizione. Utilizzare il comando Salva come indicizzato per salvare l'immagine su disco. L'immagine della GTI misura la dimensione del campo visivo.

Ora sposta il campione GTI in modo che sia oltre il campo visivo e sia visibile solo lo sfondo. Cattura un'immagine di sfondo del campo con un tempo di esposizione sufficiente per acquisire almeno 5.000 conteggi. Questa immagine aiuterà nella sottrazione dello sfondo delle immagini non filtrate.

Ora per acquisire le immagini filtrate Gabor dello sfondo, caricare lo script Gabor Filter Bank sul software di controllo DMD. Eseguire l'intero script per memorizzare i filtri nel buffer nella memoria integrata del DMD. Questa operazione potrebbe richiedere alcuni minuti una volta che l'intero script è stato memorizzato nel buffer.

Utilizzare i marcatori di avvio e fine all'interno del software DMD per assicurarsi che venga caricato un solo set di filtri corrispondente a un filtro Gabor Like alla volta. Eseguire lo script per acquisire immagini filtrate dello sfondo. L'anteprima dell'immagine dal vivo dovrebbe cambiare dal campo scuro all'immagine filtrata.

Per quel filtro, aprire lo script di acquisizione in IP lab dal disco. Regolare il tempo di esposizione per assicurarsi che vengano acquisiti almeno 2000 conteggi. Mentre lo script DMD è in esecuzione, annullare l'anteprima dal vivo in IP lab ed eseguire lo script di acquisizione.

Questo acquisirà automaticamente l'indice e salverà l'immagine filtrata su disco. Una volta acquisita la prima immagine, interrompere l'esecuzione dello script in DMD. Elimina i comandi utilizzati dallo script.

Quindi sostituire i marcatori di inizio e fine all'inizio e alla fine del set di filtri successivo. Ripetere l'acquisizione in IP lab fino a quando l'intero banco di filtri non è stato utilizzato e tutte le immagini filtrate sono state acquisite e salvate. Prepararsi a placcare le celle collegando un saldatore sul banco di lavoro del laboratorio e riscaldando il terreno L 15 a 37 gradi Celsius.

Crea una postazione di lavoro con un tovagliolo di carta e una salvietta Kim per assorbire il mezzo versato e mantenere l'area pulita. Prepara diversi stoppini strappando e facendo roteare le salviette kimm. Gli stoppini verranno utilizzati per aspirare il fluido attraverso la piastra cellulare.

Quindi, utilizzare il portacampioni in metallo per creare un sandwich di cellule. Utilizzare una siringa per applicare un sottile cordone di grasso sottovuoto attorno alla periferia superiore del foro nella piastra metallica lavorata, estendendosi circa a metà fino alle estremità delle scanalature su ciascun lato. Passare delicatamente un vetrino coprioggetti numero uno pulito sul grasso.

Capovolgere la piastra e applicare il grasso attorno al foro. Spegni le luci della stanza indossando guanti da esame di prova NI sterilizzati con etanolo. Recupera le cellule dall'incubatore.

Rimuovere il vetrino coprioggetto che verrà utilizzato per l'esperimento dalla piastra a sei pozzetti. Asciugare accuratamente il vetrino coprioggetto. Quindi premere la cella di scorrimento del coperchio con il lato rivolto verso il basso nella piastra metallica unta sopra il foro di visualizzazione.

Inserimento delle celle all'interno della piastra. Assicurarsi che non rimangano intercapedini d'aria e che il grasso abbia formato una tenuta stagna in modo che il fluido possa essere caricato. Ora capovolgere nuovamente la piastra, pipettando 200 microlitri alla volta.

Aggiungere il preriscaldatore L 15 medium nel sandwich attraverso la scanalatura tra il vetrino copricoperchio superiore e la piastra metallica fino a quando il liquido non raggiunge quasi la scanalatura sull'altro lato. Quindi, lavare le cellule tenendo uno stoppino nella scanalatura opposta e pipettando altri 200 microlitri di terreno nel sandwich. Il mezzo scorrerà da un lato all'altro mentre lo stoppino rimuove il vecchio mezzo.

Fare attenzione a evitare che si formino bolle all'interno del liquido durante questa fase. Ripeti questo processo due o tre volte usando un nuovo stoppino per ogni risciacquo. Ora capovolgere ancora una volta la piastra sostenendo la piastra dai bordi in modo da intrappolare il liquido nel serbatoio della cella.

Immergi il saldatore nel becher veap per sciogliere rapidamente un po' di veap, che poi si aggrapperà alla punta del saldatore. Usando la punta del saldatore, applicare con cura la punta della muta attorno ai bordi del vetrino copricapo inferiore. Continuare a immergere e applicare tutto il perimetro del vetrino coprioggetto, sigillandolo alla piastra metallica.

In questo modo si crea una buona tenuta meccanica in modo che il vetrino coprioggetto non si stacchi dalla piastra durante la visualizzazione. Pulire eventuali residui dal fondo. Coprioggetti sulla superficie strillando una salvietta kim e pulendo il coperchio.

Scivolare con un unico movimento scorrevole per assicurarsi che il vetrino coprioggetto sia più pulito al centro dove verrà visualizzato. Rimetti la piastra a sei pareti nell'incubatrice. Porta le celle placcate al laboratorio di ottica e montale sull'obiettivo.

Come prima, trova un campo di cellule dall'aspetto sano e acquisisci un'immagine in campo scuro del campo visivo. Quindi allineare il microscopio in DIC e assicurarsi che i tempi di esposizione siano adeguati. Acquisisci un'immagine DIC con una fotocamera a cascata.

In questa configurazione, le immagini fluorescenti vengono acquisite utilizzando la fotocamera SNAP mentre il microscopio è ancora allineato in DIC. Impostare il VAR del microscopio su una x e la finestra di visualizzazione su 100% binoculare e deviare l'immagine dall'oculare alla fotocamera. Posizionare un LED blu sul condensatore per illuminare il campo.

Quindi visualizza in anteprima il campo visivo nell'immagine RSS e regola la messa a fuoco fine. Se necessario, acquisire un'immagine DIC e salvarla su disco. Si noti come il campo visivo sia diverso da quello ottenuto dalla telecamera a cascata.

Queste immagini dovranno essere registrate durante la fase di analisi dell'esperimento. Quindi, spostare il cubo del filtro fluorescente in posizione e acquisire un'immagine a fluorescenza attivando brevemente l'eccitazione a fluorescenza utilizzando l'otturatore del microscopio, quindi spegnerlo non appena l'acquisizione è completata. Per ridurre al minimo il fotosbiancamento, salvare l'immagine a fluorescenza su disco.

Per acquisire immagini filtrate, reimpostare il microscopio sul campo e inviare la luce attraverso la porta LSM. Come in precedenza, eseguire l'intero script del banco di filtri Gabor come prima per completare l'acquisizione dei dati per un punto temporale mentre le celle sono ancora sul tavolino e senza disturbare il campo visivo. Utilizzare il metodo di traspirazione per sostituire il normale terreno L 15 con lo stesso contenente una soluzione mono micromolare di STS.

Nel corso dell'esperimento, aggiungere ulteriore terreno per evitare che si secchi pipettando il terreno nella scanalatura della piastra cellulare senza rimuoverla dal tavolino o disturbare il campo visivo. A questo punto, ripeti questi passaggi per i punti temporali successivi fino al completamento dell'esperimento. I dati raccolti includeranno un gran numero di immagini filtrate che devono essere elaborate per estrarre i dati strutturali subcellulari.

Qui vengono mostrati due esempi di esperimenti. Questa figura mostra le immagini sequenziali di un campione di alghe diatomee marine. Le caratteristiche orientate sono chiaramente visibili.

Nell'imaging in campo oscuro. Le immagini filtrate otticamente etichettate cinque uguale a zero gradi a cinque uguali a 160 gradi vengono mostrate accanto all'immagine non filtrata del campione. Per confronto, l'insieme di nove immagini filtrate da Gabor della diatomea è stato elaborato pixel per pixel per l'orientamento dell'oggetto.

Ad ogni pixel, il segnale massimo è stato diviso per il segnale medio in funzione dell'orientamento del filtro per ottenere un valore di proporzioni. In questo caso, un rapporto d'aspetto vicino a uno indicato dal blu è presente nelle aree in cui non esiste un angolo di risposta preferito. Valori maggiori indicati dal rosso indicano aree in cui è presente una risposta angolare preferita più elevata.

La luminosità e il significato del codice della risposta totale del filtro GABOR, l'orientamento del filtro, che fornisce il segnale massimo ad ogni pixel corrispondono alla direzione perpendicolare all'orientamento dell'oggetto sottostante. L'orientamento delle particelle della sottostruttura è codificato in un grafico faretra in cui ogni linea concorda strettamente con l'orientamento dell'oggetto locale sottostante visibile in campo scuro non filtrato. Il grafico della faretra mostra l'orientamento degli oggetti con intensità di risposta superiori al 10% del massimo.

Queste immagini in campo scuro e filtrate otticamente di un campo contenevano cellule endoteliali bovine vive, le immagini filtrate sono state successivamente acquisite ogni 20 minuti per un periodo di tre ore dopo il trattamento con l'induttore dell'apoptosi stor sporin. Qui, la mappa delle proporzioni nel pannello superiore e l'imaging a fluorescenza dei mitocondri nel pannello inferiore sono mostrati in funzione del tempo. La tonalità del colore rappresenta il grado di orientamento, poiché prima di questi grafici temporali confronta la diminuzione del grado di orientamento delle particelle in cellule endoteliali trattate con s torosporina, le singole tracce rappresentano grafici temporali all'interno di singole cellule.

L'orientamento al drop-in è limitato alle regioni delle cellule che si registrano con le regioni fluorescenti. Ora, la convalida contro la fluorescenza è stata raggiunta. Diventa archivistico.

Pertanto, nei prossimi esperimenti, le misurazioni mitocondriali possono essere effettuate omettendo le fasi di imaging a fluorescenza e utilizzando direttamente il metodo della dispersione ottica. Ti abbiamo appena mostrato come monitorare la frammentazione mitocondriale durante l'apoptosi utilizzando firme di diffusione della luce basate su filtri Gabor. Quando si esegue questa procedura, è importante avere una buona preparazione dello stile di vita e assicurarsi che la configurazione ottica sia ben allineata e calibrata.

Quindi prendiamo il senso per guardare e CoLab con gli esperimenti dell'interfaccia utente.