Name: Linearizzazione del saggio proteine Bradford (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-12T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Scopri la procedura di linearizzazione del saggio Bradford per la quantificazione proteica con assorbimento a 590 nm e 450 nm. Questo metodo migliora la sensibilità di circa 10 volte e riduce l'interferenza dei detergenti nei campioni.

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Questo saggio è dedicato alla memoria del compianto Dr. Zvi Selinger, che ha ospitato la ricerca originale descritta qui.

Linearizzazione della curva di taratura Proteine ​​Bradford: Il brillante saggio di proteine ​​Coomassie blu, comunemente noto come il saggio Bradford 1, è ampiamente utilizzato per il suo protocollo rapidi e convenienti così come la sua sensibilità relativa. Purtroppo, c'è un ampio grado di curvatura su una vasta gamma di concentrazioni di proteine ​​(Fig. 1). Pertanto, solo una gamma ristretta di relativamente alte concentrazioni di proteine, 2-10 mg / ml BSA, viene utilizzato per la curva di taratura, che poi si adatta meglio di regressione lineare (Fig. 1, verde). Tuttavia, la non linearità richiede una concentrazione proteica dei campioni sconosciuti rientrano nella gamma limitata di curva di taratura allo scopo di evitare un errore grande, e riduce anche la precisione nel range limitato. La non linearità presenta un serio problema in particolare quando quantità microgrammi di proteina non sono disponibili, e richiede spesso più diluizioni dei campioni sconosciuti. Come sottolineato nel documento originale Bradford, "la fonte della non linearità è nel reagente stesso poiché non vi è una sovrapposizione nello spettro delle due forme colore diverso del colorante." 1. Infatti, tre forme del colorante Coomassie blu brillante in equilibrio acido-base al pH acido del solito saggio 2. Le forme rosso, blu e verde sono assorbanza massimi a 470, 590 e 650 nm, rispettivamente (Fig. 2). Il blu è la forma che lega la proteina, formando un complesso che assorbe intensamente la luce a 594 nm 3, 4 (Fig. 2). Bradford ha anche osservato che "il valore di fondo per il reagente è in costante riduzione come più colorante si lega alle proteine" 1 (Fig. 3). Pertanto, abbiamo cercato di calcolare la riduzione dello sfondo 590 nm come quantità proteico sono aggiunti, misurando la variazione di assorbanza a 450 nm, in cui la proteina-colorante non assorbe. Abbiamo trovato che lo sfondo diminuendo in parte, ma non completamente, spiega la non-linearità (Fig. 4). Abbiamo quindi ipotizzato che la diminuzione della concentrazione di colorante libero produce un'altra distorsione della risposta lineare, perché, come proteina-colorante legame è in equilibrio 5, formazione di complessi dipende non solo dalla concentrazione della proteina libero, ma anche su quello del colorante libero (Fig. 5). Tenendo conto sia questioni legate alla concentrazione variabile del colorante libero, abbiamo sviluppato una equazione matematica che descrive una relazione lineare tra la concentrazione di proteine ​​e il rapporto delle misure di assorbanza, 590 nm oltre 450 nm (Fig. 6). Una descrizione dettagliata dello studio teorico e sperimentale si possono trovare nel nostro 1996 pubblicazione nella biochimica analitica 6. L'equazione matematica è stata sperimentalmente testato ed è risultato fino ad ottenere una curva di calibrazione lineare su tutta la gamma concentrazioni di proteine ​​(Fig. 7). Inoltre, l'equazione è stata convalidata anche da una determinazione indipendente dal corretto pH-dipendente valore della Y intercettare 6. Protocollo dettagliato per la migliore analisi delle proteine ​​Bradford, utilizzando un lettore di micropiastre Assorbanza: <ol><li> Preparare un 0,1 mg / ml soluzione madre dello standard, albumina sierica bovina. Tutte le norme possono essere scelti altri, ma si noti che lo stesso standard deve essere usato in tutti gli esperimenti. </li><li> Diluire i campioni sconosciuti in acqua deionizzata. Puntate a 5-50 mg / ml. Tuttavia, le concentrazioni di proteine ​​superiori o inferiori sono accettabili, poiché non vi è alcun limite apparente per la gamma lineare del test. Tuttavia, la misura deve essere all'interno della gamma lineare del lettore assorbanza. </li><li> Diluire il reagente di Bradford (Bio-Rad) 2,5 volte in acqua deionizzata. </li><li> Aggiungi 0 e 10-50 ml di soluzione madre di BSA pozzi triplice copia (la creazione di una curva di calibrazione mcg 0-5 BSA). Complemento con acqua deionizzata per raggiungere 100 l / pozzetto. </li><li> In diversi pozzetti, aggiungere 100 ml di campione sconosciuto in triplicato. Diverse concentrazioni del campione sconosciuto può essere utilizzato per aumentare la precisione. </li><li> Aggiungere 100 l di reagente diluito Bradford a tutti i pozzetti. Volume totale è di 200 microlitri / bene. </li><li> Attendere almeno 5 minuti, ma non più di 60 minuti per lo sviluppo del colore. </li><li> Il vuoto deve essere di 200 ml di acqua deionizzata (e non il colorante proteico pari a zero bene). </li><li> Misurare l'assorbanza a 590 nm e 450 nm. </li><li> Preparare una curva di taratura dividendo i valori di assorbanza netta a 590 nm e 450 nm. Si noti che la proteina zero (colorante solo) valore deve essere inclusa come un punto di dati (Fig. 8). </li><li> Calcolare la concentrazione del campione sconosciuto in base all'equazione lineare della curva di calibrazione (Fig. 9). </li></ol> Rappresentante dei risultati: A differenza l'assorbanza ad una singola lunghezza d'onda di 590 nm, il rapporto tra i valori di assorbanza, più di 590 nm a 450 nm, è lineare wconcentrazione di proteine-esimo (fig. 10). La concentrazione proteica del campione sconosciuto può essere semplicemente calcolato utilizzando l'equazione lineare della curva di calibrazione (Fig. 10, l'equazione). Tuttavia, una maggiore precisione si ottiene misurando diverse diluizioni del campione sconosciuto. A tal fine, preparare due grafici. La prima è una curva di taratura per lo standard con proteine ​​mcg sull'asse X (Fig. 11, a destra). Il secondo grafico è per il campione incognito, con l di campione originale non diluito sull'asse X (Fig. 11, a sinistra). Il valore di colorante solo dovrebbero essere incluse in entrambi i grafici (Fig. 11). La concentrazione proteica del campione sconosciuto si ottiene dividendo le pendici del campione sconosciuto e lo standard (Fig. 11, l'equazione). <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig2.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Convenzionale grafico di calibrazione Bradford. Il range lineare è rappresentata da simboli verdi. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig1.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Spectra della proteina-colorante e del colorante da solo. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Proteina-colorante equilibrio. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Riduzione del fondo corretta calcolato diminuisce parzialmente non-linearità. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig5.jpg" alt="Figura 5" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 5"> Figura 5. Proteina-colorante equilibrio. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig6.jpg" alt="Figura 6" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 6"> Figura 6. Fondamento matematico per la linearizzazione del dosaggio proteina Bradford. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig7.jpg" alt="Figura 7" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 7"> Figura 7. Linearizzazione della curva di taratura Bradford. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig8.jpg" alt="Figura 8" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 8"> Figura 8. Calcolo dei valori di rapporto tra l'assorbanza. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig9.jpg" alt="Figura 9" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 9"> Figura 9. Una calibrazione lineare Bradford grafico. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig10.jpg" alt="Figura 10" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 10"> Figura 10. Linearizzazione della curva di taratura Bradford. <img src="/files/ftp_upload/1918/1918fig11.jpg" alt="Figura 11" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 11"> Figura 11. Sconosciuto campione concentrazione calcolo.

<ol><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Chial, H. J., Thompson, H. B., Splittgerber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spectral+study+of+the+charge+forms+of+Coomassie+blue+G%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A spectral study of the charge forms of Coomassie blue G.</a> Anal Biochem. 209, 258-266 (1993).</li>
<li>Chial, H. J., Splittgerber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+binding+of+Coomassie+brilliant+blue+to+proteins+at+low+and+neutral+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A comparison of the binding of Coomassie brilliant blue to proteins at low and neutral pH.</a> Anal Biochem. 213, 362-369 (1993).</li>
<li>Compton, S. J., Jones, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+dye+response+and+interference+in+the+Bradford+protein+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay.</a> Anal Biochem. 151, 369-374 (1985).</li>
<li>Congdon, R. W., Muth, G. W., Splittgerber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+binding+interaction+of+Coomassie+blue+with+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">The binding interaction of Coomassie blue with proteins.</a> Anal Biochem. 213, 407-413 (1993).</li>
<li>Zor, T., Selinger, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linearization+of+the+Bradford+protein+assay+increases+its+sensitivity%3A+theoretical+and+experimental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: theoretical and experimental studies.</a> Anal Biochem. 236, 302-308 (1996).</li>
</ol>

Il dosaggio di proteine ​​Bradford è popolare grazie alla sua facilità di prestazioni e di sensibilità relativa. La linearizzazione sulle concentrazioni proteina intera gamma ottenuto dal protocollo presentato qui semplifica ulteriormente l&#39;analisi, come campioni sconosciuti non hanno bisogno di rientrare nel campo della curva di calibrazione. È importante sottolineare che il protocollo migliorata Provvede inoltre i seguenti vantaggi rispetto l&#39;originale Bradford protocollo: <ol>...

<table><tbody><tr><td>Reagente di Bradford</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Amersco</td><td>0332</td><td></td></tr><tr><td>Lettore multipiastra per assorbanza</td><td>BioTek</td><td>Synergy2</td><td></td></tr></tbody></table>

linearizzazione del saggio proteine ​​bradford

Linearization of the Bradford Protein Assay

Determinazione delle quantità di microgrammi di proteina nel saggio Bradford brillante blu Coomassie si ottiene la misura di assorbanza a 590 nm. Questo test permette di quantificare più comuni proteine ​​rapido e semplice in lisati di cellule, frazioni cellulari, o campioni di proteine ​​ricombinanti, ai fini della normalizzazione delle misure biochimiche. Tuttavia, un non-linearità intrinseca compromette la sensibilità e la precisione di questo metodo. E &#39;dimostrato che in condizioni di test standard, il rapporto tra le misure di assorbanza a 590 nm e 450 nm è strettamente lineare con la concentrazione di proteine. Questa semplice procedura aumenta la precisione e migliora la sensibilità del dosaggio circa 10 volte, permettendo la quantificazione fino al 50 ng di sieroalbumina bovina. Inoltre, l&#39;interferenza introdotta da detergenti comunemente utilizzati per creare i lisati cellulari è notevolmente ridotta dal nuovo protocollo. Una equazione lineare sviluppato sulla base di azione di massa e la legge Beer si adatta perfettamente ai dati sperimentali.

La precisione e la sensibilità di determinazione delle proteine ​​da parte del test rapido e conveniente Bradford è compromessa dalla non linearità intrinseca. Mostriamo una semplice procedura di linearizzazione che aumenta notevolmente la precisione, migliora la sensibilità del test di circa 10 volte, e riduce significativamente le interferenze da detergenti.

Linearizzazione del saggio proteine ​​Bradford

La determinazione di quantità di proteine nell'ordine dei microgrammi nel saggio di Bradford al Coomassie brilliant blue viene effettuata misurando l'assorbanza a 590 nm. ...

Il saggio proteico di Bradford inizia con l'aggiunta di uno standard di BSA in quantità crescenti e di diluizioni di un campione sconosciuto in una piastra a 96 pozzetti; viene aggiunta acqua deionizzata per portare a volume costante. Il reagente di Bradford viene quindi aggiunto a tutti i pozzetti tranne al bianco, che deve contenere solo acqua dopo cinque minuti. L'assorbanza viene letta a 590 nanometri per la rilevazione del complesso proteina-colorante e a 450 nanometri.Per la linearizzazione del grafico, il rapporto tra i valori di assorbanza a 590 nanometri e a 450 nanometri è strettamente lineare con la quantità di proteina. Ciao, sono del Dipartimento di Biochimica di Tel Aviv, università di Israele, sono o T del laboratorio. Oggi vi mostreremo un procedimento per determinare la concentrazione proteica utilizzando un protocollo di Bradford linearizzato migliorato.Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per normalizzare la quantità di proteina in SZaS, ad esempio, prima di caricare i gel. Cominciamo. Nel saggio di Bradford, tre forme del colorante blu brillante di Kumasi sono in equilibrio acido-base al pH acido tipico del saggio.Le forme rossa, blu e verde presentano massimi di assorbimento rispettivamente a 470, 590 e 650 nanometri. La forma blu è quella che si lega alla proteina formando un complesso che assorbe intensamente la luce a 594 nanometri. Questo saggio ampiamente utilizzato presenta un elevato grado di curvatura su un ampio intervallo di concentrazioni proteiche.Pertanto, per il grafico di calibrazione si utilizza solo un intervallo ristretto di concentrazioni proteiche relativamente elevate, che si adatta meglio a una regressione lineare. Una causa della non linearità è l'assorbanza a 590 nanometri del colorante libero, che diminuisce con l'aumentare delle quantità di proteina aggiunte. La non linearità è parzialmente ridotta misurando la variazione di assorbanza a 450 nanometri, dove il colorante stesso, ma non il complesso proteina-colorante, assorbe.E riducendo il bianco calcolato corretto, la diminuzione della concentrazione del colorante libero produce un'ulteriore distorsione della risposta lineare, poiché, essendo il legame tra proteina e colorante in equilibrio, la formazione del complesso dipende non solo dalla concentrazione della proteina libera, ma anche da quella del colorante libero. Tenendo conto di entrambi i fattori legati alla concentrazione variabile del colorante libero, è stata sviluppata un'equazione matematica che descrive una relazione lineare tra la concentrazione proteica e il rapporto tra le misure di assorbanza a 590 nanometri e 450 nanometri.L'equazione matematica è stata verificata sperimentalmente e si è rivelata in grado di produrre una curva di calibrazione lineare nell'intero intervallo di concentrazione proteica. Per iniziare, preparare una soluzione standard di albumina sierica bovina a 0,1 milligrammi per millilitro. È possibile scegliere un altro standard, ma si noti che lo stesso standard deve essere utilizzato in tutti gli esperimenti.Diluire i campioni sconosciuti in acqua deionizzata. Mirare a una concentrazione compresa tra cinque e 50 microgrammi per millilitro, anche se concentrazioni proteiche superiori o inferiori sono accettabili poiché non vi è un limite apparente per il range lineare del saggio. Tuttavia, tenere presente che la misurazione deve rientrare nel range lineare del lettore di assorbanza.Inoltre, diluire il reagente di Bradford di 2,5 volte in acqua deionizzata. Successivamente, aggiungere zero e da cinque a 50 microlitri della soluzione madre di BSA in pozzetti tripli di una piastra a 96 pozzetti per creare una curva di calibrazione di BSA da zero a cinque microgrammi, completando con acqua deionizzata fino a raggiungere 100 microlitri per pozzetto in pozzetti diversi. Utilizzando 100 microlitri di campione sconosciuto in triplicato, è possibile usare diverse concentrazioni del campione sconosciuto per aumentare l'accuratezza.Infine, aggiungere 100 microlitri del reagente di Bradford diluito in tutte le pozzette. Il volume totale è di 200 microlitri per pozzetta. Preparare inoltre un bianco per la misurazione dell'assorbanza.Devono essere 200 microlitri di acqua deionizzata e non il colorante per proteine zero. Attendere almeno cinque minuti, ma non più di 60 minuti, per lo sviluppo del colore.Procedere alla misurazione dell'assorbanza a 590 nanometri e a 450 nanometri. Ricordare di utilizzare acqua per la misurazione del bianco. Preparare un grafico di calibrazione dividendo i valori di assorbanza netta a 590 nanometri e a 450 nanometri.Si noti che il valore zero di proteina deve essere incluso come punto dati. Calcolare la concentrazione del campione sconosciuto in base all'equazione lineare della curva di calibrazione. A differenza dell'assorbanza a una singola lunghezza d'onda di 590 nanometri, il rapporto tra i valori di assorbanza a 590 nanometri e 450 nanometri è lineare rispetto alla concentrazione proteica.La concentrazione proteica del campione incognito può essere semplicemente calcolata utilizzando l'equazione lineare della curva di calibrazione. Tuttavia, si ottiene una maggiore accuratezza misurando diverse diluizioni del campione incognito. A tal fine, preparare due grafici.Il primo è un grafico di calibrazione per lo standard con microgrammi di proteina sull'asse delle x. Il secondo grafico riguarda il campione sconosciuto con microlitri del campione originale non diluito sull'asse delle x. Il valore del solo colorante deve essere incluso in entrambi i grafici.La concentrazione proteica del campione sconosciuto si ottiene dividendo la pendenza del campione sconosciuto per quella del campione standard. Vi abbiamo appena mostrato come misurare la concentrazione proteica utilizzando un protocollo linearizzato migliorato di Bradford. L'utilizzo di questa procedura aumenta notevolmente l'accuratezza del saggio, migliora la sensibilità di circa 10 volte e riduce in modo significativo le interferenze causate dai detergenti durante l'esecuzione della procedura.È importante ricordare di utilizzare il campione bianco appropriato, che è l'acqua, piuttosto che il campione di colorante senza proteine. Questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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