Name: Il trapianto di GFP che esprimono blastomeri per dellimmagine in tempo reale dello sviluppo della retina e del cervello in embrioni di zebrafish Chimerico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Impara il trapianto di blastomeri GFP in embrioni di zebrafish per studiare lo sviluppo della retina e del cervello. Questo metodo consente l'imaging in tempo reale delle dinamiche cellulari durante l'embriogenesi.

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Questo studio è stato supportato da una National Institutes of Health (NIH) Core Grant (5P30EY008098) ei fondi di seguito per XW: NIH Concessione R01EY016099 e della Ricerca per la prevenzione Career Development Award cecità. Ringraziamo Lathrop Kira per l&#39;assistenza nel campo dell&#39;imaging confocale.

Giorno 1. Preparazione 1. Impostare croci pesce Impostare attraversa coppie di pesce zebra in serata. Per evitare accoppiamenti casuali prima che il tempo desiderato, utilizzare divisori per separare i pesci femminili e maschili nei cassetti di accoppiamento. GFP-esprimere i pesci transgenici sono usati come fonte di blastomeri donatore. Il pt104 linea transgenica (Zou et al., 2008), qui utilizzato, esprime GFP ubiquitariamente sotto il controllo del promotore EF1. Espressione GFP permette la visualizzazione di cellule del donatore per immagini dal vivo. Altre linee di pesci transgenici che esprimono proteine ​​fluorescenti adatti possono essere utilizzati per esigenze specifiche. 2. Preparare a forma di cuneo agarosio pozzi per lo svolgimento degli embrioni Versare fuso 1% agarosio, preparata in acqua uovo E3 (Westerfield, 2007), in una piastra di Petri. Float uno stampo di plastica che è a forma di cuneo sporgenze sulla soluzione di agarosio e lasciare che la soluzione di agarosio solidificare completamente. Togliere lo stampo con attenzione e immergere il letto di agarosio con acqua E3. 3. Preparare aghi trapianto Utilizzare un estrattore verticale dell'ago (David KOPF Instruments) alla potenza impostazione 11,5 a fare gli aghi tirando pipette di vetro capillare (Precision Instrument World). Suggerimenti ago buono dovrebbe conici con alberi lunghi. Macinare le punte ago con un angolo di 45 gradi con un Grinder Micro (Marishige) fino aperture smussati di 40-45μm di diametro interno sono ottenuti (Fig. 1A). Per pulire la punta dell'ago, collegare un tubo alla fine smussata dell'ago, collegare il tubo di una siringa, e poi aspirare e rilasciare una soluzione al 10% di acido fluoridrico fino a quando tutti i detriti visibile viene rimosso. Successivamente, lavare le punte con acqua distillata, seguito da 100% di etanolo. Asciugare gli aghi fino a che tutti evapora etanolo. E 'importante assicurare che le punte siano completamente asciutti: l'etanolo residuo rovinerà gli aghi durante l'alta temperatura fase di lucidatura. Per ammorbidire e lucidare gli spigoli delle punte ad ago, cuocere le punte ago con il calore generato dal filamento di un falsario Micro (Marishige). Non lasciare che le punte ago toccare il filamento durante la lucidatura. La quantità di elettricità che passa anche se il filamento e la distanza tra il filamento e la punta dell'ago può essere regolata per raggiungere condizioni di riscaldamento desiderata. La temperatura non dovrebbe essere troppo alto: questa si scioglierà e deformare la punta dell'ago. Dopo gli spigoli sono levigati, con attenzione toccare il filamento riscaldato con la punta dell'ago e poi tirare delicatamente il filamento lontano da l'ago per generare una estremità appuntita (fig. 1B). Un ago tagliente, liscia e pulita è fondamentale per l'ottenimento di blastomeri donatore integro e per non danneggiare gli embrioni ospitante. 4. Preparare un embrione-posizionamento della sonda Tirare una pipetta di vetro sulla fiamma del gas per ottenere una sonda sottile vetro con un fine sfumate. Questa sonda sarà utilizzata per posizionare gli embrioni secondo il giusto orientamento prima del trapianto. 2 ° giorno. Blastomero trapianto 1. Raccogliere ed embrioni dechorionate Il giorno dopo, togliere i divisori nei cassetti croce per consentire ai pesci di accoppiarsi. Mettere gli embrioni in una piastra di Petri riempita con acqua E3. Poi, gli embrioni dechorionate manualmente strappare la chorions dagli embrioni con un paio di pinze fine. Utilizzare una pipetta di vetro con albero piegato per trasferire gli embrioni attentamente dechorionated in agarosio pozzi. Evitare il contatto degli embrioni con l'aria, che causano gli embrioni per scoppiare. Lasciate che gli embrioni si sviluppano a 28,5 ° C nei pozzi agarosio fino a 3 ore dopo la fecondazione, o HPF. 2. Istituire un apparato di trapianto Mentre gli embrioni progettare, organizzare un apparato trapianto collegando l'ago trapianto al bagno d'olio minerale micro-sistema di pompaggio. Assicurarsi che il sistema non perde e non bolle d'aria intrappolate nel sistema. Riempire di nuovo l'ago intero trapianto con olio minerale, ad eccezione del ,5-1 l di spazio in apertura punta. 3. Trapianto di blastomeri Per trapianto di blastomeri, utilizzare una sonda di posizionamento di vetro per orientare il lato blastomero del 3-4-HPF embrioni verso l'alto. Poi, inserire delicatamente l'ago in un trapianto di embrione donatore e succhiare lentamente in 5-20 blastomeri l'ago. Inserire il blastomero pieno ago in un embrione di accoglienza e rilasciare i blastomeri lentamente. Il sito in cui vengono rilasciati i blastomeri influenzerà in cui la loro progenie localizzare nelle fasi successive dello sviluppo. Per analizzare lo sviluppo della retina e del cervello, le cellule rilasciano al polo animale. Durante il trapianto, assicurarsi che la punta dell'ago non ha contatto con l'aria. Per ridurre al minimo i danni meccanici, gli embrioni ospitante deve essere lasciato nei pozzetti agarosio a 28,5 ° C fino al giorno successivo. Poi, transfer gli embrioni mosaico di piastre di pre-ricoperto con 0,5 ml di 1% agarosio 24-bene, con un embrione in ciascun pozzetto. 1 ml di acqua uovo E3 si aggiunge a ciascun pozzetto. Per prevenire le infezioni batteriche, aggiungere 10 ml di penicillina e streptomicina 100X all'acqua uovo E3. 3 ° giorno. Incorporare e immagini dal vivo degli embrioni mosaico 1. Incorporare gli embrioni Preparare 1,5% di agarosio a basso punto di fusione (PML) in acqua uovo E3 e mantenere la soluzione in un bagno d'acqua 30 ° C. Trasferimento di un embrione mosaico di un piatto FluoroDish coltura di tessuti con un fondo di vetro di 0,17 millimetri di spessore (Strumenti di precisione World). Eliminare l'acqua in eccesso E3 di lasciare l'embrione appena coperto da una minima quantità di E3. Aggiungere 30-50 microlitri LMP fuso 1,5% per l'embrione. Rapidamente posizione l'occhio o il cervello più vicino possibile al fondo di vetro il più possibile prima che la soluzione di agarosio solidifica. Dopo che la soluzione si raffredda, aggiungere ulteriori soluzione di agarosio per proteggere ulteriormente gli embrioni in posizione. Poi, immergere il blocco solidificato agarosio con 2-3 ml di acqua uovo E3. 2. Confocale Imaging Per la microscopia confocale, un acqua-immersion obiettivo invertito (Olympus, Planapo, 40 X/0.90 WLSM, Giappone) con la profondità attenzione spesso è utilizzato. Una goccia d'acqua si aggiunge sul obiettivo e poi inserire un FluoroDish piatto di coltura tissutale sull'obiettivo. Allo sviluppo dell'immagine, eseguire time-lapse imaging di scattare foto degli embrioni ogni 5 minuti. A seconda della natura degli esperimenti, gli intervalli di tempo tra uno scatto e deve essere regolato. Rappresentante risultati La figura 2 illustra un rappresentante di 24 HPF zebrafish mosaico. Espressione GFP evidenzia le cellule del donatore in verde. Le cellule della retina neuroepiteliale coprono l'intero spessore della parete della retina. Il filmato mostra i movimenti delle cellule del donatore nel cervello ospite a 24 HPF. Cellule preavviso morfologie cambiare nel tempo. <img src="/files/ftp_upload/1924/1924fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Forme di punte ad ago del trapianto. A. L'apertura smussato della punta di un ago era libero di detriti dopo ripetuti lavaggi acido fluoridrico. B. Una estremità appuntita è stata generata sulla punta dell'ago. <img src="/files/ftp_upload/1924/1924fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Visualizzazione di GFP che esprimono cellule del donatore in embrioni di zebrafish chimerico a 24 HPF. Il pannello di sinistra mostra i segnali GFP nel cervello e della retina. Il pannello centrale è una foto in campo chiaro dell'embrione. Il pannello di destra mostra l'immagine fusa. Movie 1. Live imaging di cellule del donatore GFP positive dimostrato la grandi cambiamenti nella morfologia delle cellule cerebrali neuroepiteliale durante lo sviluppo. La singoli fotogrammi del film sono stati raccolti ogni 5 minuti tra le 24 e 25 HPF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1924/1924_Wei_Movie1.wmv">Clicca qui per vedere il filmato</a> .

<ol><li>Zou, J., Lathrop, K., Sun, M., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+RPE+maintained+by+Nok+is+essential+for+retinal+epithelial+polarity+and+cellular+patterning+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Intact RPE maintained by Nok is essential for retinal epithelial polarity and cellular patterning in zebrafish.</a> Journal of Neuroscience. 28 (50), 13684-13695 (2008).</li>
<li>Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22THE+ZEBRAFISH+BOOK%22">THE ZEBRAFISH BOOK</a>. , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).</li>
<li>Ho, R. K., Kane, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-autonomous+action+of+zebrafish+spt-1+mutation+in+specific+mesodermal+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell-autonomous action of zebrafish spt-1 mutation in specific mesodermal precursors.</a> Nature. 348, 728-730 (1990).</li>
<li>Catalano, A., Raymond, P., Goldman, D., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+dou+yan+Mutation+Causes+Patterning+Defects+and+Extensive+Cell+Death+in+the+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Zebrafish dou yan Mutation Causes Patterning Defects and Extensive Cell Death in the Retina.</a> Developmental Dynamics. 236 (5), 1295-1236 (2007).</li>
</ol>

In questo video, si dimostra un metodo per blastomero trapianto di analizzare lo sviluppo della retina e del cervello in zebrafish. Questo protocollo può essere utilizzato anche per analizzare lo sviluppo di altri organi e tessuti, semplicemente rilasciando il blastomeri donatore di posizioni corrispondenti negli embrioni di accoglienza. L&#39;etichettatura con le molecole GFP produce uno sfondo più pulito rispetto etichettatura con colorante fluorescente coniugato Destrano (Ho e Kane 1990). Questo perché i residui di c...

E3 uovo acqua: <ul><li> 5 mM NaCl </li><li> 0,17 mM KCl </li><li> 0,33 mM CaCl 2 </li><li> 0,33 mM MgSO 4 </li><li> Blu di metilene 0,1% </li></ul>

il trapianto di gfp che esprimono blastomeri per dell&#39;immagine in tempo reale dello sviluppo della retina e del cervello in embrioni di zebrafish chimerico

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cellule cambiare ampiamente nelle loro posizioni e proprietà durante l&#39;embriogenesi. Questi cambiamenti sono regolati dalle interazioni tra le cellule e il loro ambiente. Embrioni chimerici, che sono composti da cellule di diverso background genetico, sono grandi strumenti per studiare le interazioni cellula-cellula mediata da geni di interesse. La trasparenza embrionale del pesce zebra in primi stadi di sviluppo permette la visualizzazione diretta della morfogenesi dei tessuti e organi a livello cellulare. Qui, dimostriamo un protocollo per generare retine chimerico e cervelli in embrioni di zebrafish e di eseguire l&#39;imaging dal vivo delle cellule del donatore. Il protocollo riguarda la preparazione di aghi trapianto, il trapianto di GFP che esprimono blastomeri donatore per GFP-negativi padroni di casa, e l&#39;esame del comportamento delle cellule del donatore vivo sotto microscopia confocale. Con lievi modifiche, questo protocollo può essere usato anche per studiare lo sviluppo embrionale di altri tessuti e organi in zebrafish. I vantaggi di usare buone pratiche agricole per le cellule del donatore etichetta vengono anche discussi.

Dimostriamo un protocollo per generare embrioni di zebrafish chimerico per vivere comportamento imaging cellulare durante l&#39;embriogenesi.

Il trapianto di GFP che esprimono blastomeri per dell&#39;immagine in tempo reale dello sviluppo della retina e del cervello in embrioni di zebrafish Chimerico

Durante l'embriogenesi, le cellule subiscono cambiamenti significativi sia nella loro posizione che nelle loro proprietà. Tali cambiamenti sono regolati dalle interazioni tra le cellule e il loro...

Le blastocisti sono le cellule embrionali formate durante la fase di segmentazione dello sviluppo. Qui, blastocisti marcate con GFP vengono trasferite da un embrione di pesce zebra a un altro mediante un ago per trapianti. Questo metodo consente di seguire, mediante imaging microscopico in tempo reale, il comportamento e il destino delle blastocisti con background genetici modificati all'interno di un embrione altrimenti normale, o viceversa.Ciao, sono il dottor Zoran, del laboratorio della dottoressa Shawe del Dipartimento di Oftalmologia dell'Università di Pittsburgh. Oggi vi mostreremo una procedura per il trasporto di cellule muscolari mammarie nel pesce zebra embrionale. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare lo sviluppo della retina e del cervello.Iniziamo. La sera, organizzare incroci incrociati di zebrafish per evitare accoppiamenti casuali. Prima dell'orario desiderato, utilizzare divisori per separare i pesci femmina e maschio. Qui.I pesci transgenici esprimenti GFP vengono utilizzati come fonte di blastomeri donatori. La linea transgenica PT 1 0 4 esprime GFP in modo ubiquo sotto il controllo del promotore EF one per preparare i pozzetti in agarosio che conterranno gli embrioni: versare nell'agarosio fuso al 1% preparato in acqua per uova E three una piastra Petri. Far galleggiare un stampo di plastica con protrusioni a forma di cuneo sulla soluzione di agarosio.Poi lasciarlo raffreddare. Per solidificare con attenzione, rimuovere lo stampo e immergere il letto di agarosio nell'acqua E3. Successivamente, preparare gli aghi per il trapianto.Utilizzare un estrattore verticale di aghi impostato sul livello di potenza 11,5 per tirare pipette capillari di vetro. Le punte degli aghi devono presentare un restringimento graduale con steli lunghi. Affilare le punte degli aghi con un microaffilatore a un angolo di 45 gradi fino a ottenere aperture smussate con un diametro interno compreso tra 30 e 40 micrometri.Per pulire le punte degli aghi, collegare un tubo alla estremità smussata, connettere il tubo a una siringa ed aspirare e rilasciare una soluzione di acido fluoridrico al 10%. Ripetere fino alla rimozione di tutti i detriti visibili. Lavare le punte con acqua distillata.Quindi, con etanolo al 100%, lasciare asciugare all'aria gli aghi fino a quando tutto l'etanolo non sarà evaporato. È fondamentale assicurarsi che le punte siano completamente asciutte. L'etanolo residuo rovinerebbe gli aghi durante la lucidatura ad alta temperatura.Passaggio due: per ammorbidire e lucidare i bordi irregolari delle punte dell'ago, riscaldarle con il calore generato dal filamento di un microforgiatore. Non permettere che le punte dell'ago tocchino il filamento durante la lucidatura; regolare la quantità di elettricità che passa attraverso il filamento e la distanza tra il filamento e l'ago. Le punte possono essere regolate per ottenere le condizioni di riscaldamento desiderate.La temperatura non deve essere troppo elevata, altrimenti si rischia di fondere e deformare le punte degli aghi dopo che i bordi irregolari sono stati levigati. Toccare con attenzione il filamento riscaldato con la punta dell'ago e poi tirare delicatamente il filamento per ottenere un'estremità appuntita.Un ago affilato, liscio e pulito è fondamentale per ottenere blastomeri donatori integri senza danneggiare gli embrioni ospiti. Tirare una pipetta di vetro sopra una fiamma a gas per realizzare una sonda di vetro fine con un'estremità lisciata. Questa sonda verrà utilizzata per posizionare gli embrioni nell'orientamento corretto prima del trapianto.Nel giorno dell'esperimento, rimuovere le partizioni nelle cassette a croce per permettere ai pesci di accoppiarsi. Otto. Dopo 30 minuti, raccogliere da 100 a 200 embrioni versandoli in una rete. Posizionare gli embrioni in una piastra di Petri riempita con acqua E tre.Quindi, utilizzando pinzette fini, si decortichino manualmente gli embrioni strappando via i COR. Successivamente, si usi una pipetta di vetro con asta piegata per trasferire con attenzione gli embrioni decortichati nelle cavità di una piastra aros. Non si permetta agli embrioni di entrare in contatto con l'aria, poiché ciò potrebbe causarne la rottura.Lasciare sviluppare gli embrioni a 28,5 gradi Celsius nelle pozzette di aros fino a tre ore dopo la fecondazione, o HPF, mentre gli embrioni si sviluppano. Preparare un apparato per trapianto collegando l'ago da trapianto a un sistema di pompaggio microscopico riempito con olio minerale. Assicurarsi che il sistema non presenti perdite e non contenga bolle d'aria intrappolate.Riempire completamente l'ago di trapianto con olio minerale, lasciando liberi soltanto da 0,5 a un microlitro di spazio all'apertura della punta. Prelevare gli embrioni dall'incubatrice e posizionarli sul piano del microscopio per il trapianto del blasmafene. Utilizzare una sonda di posizionamento in vetro per orientare verso l'alto il lato del blasmafene degli embrioni di tre-quattro HPF.Quindi inserire delicatamente l'ago di trapianto in un embrione donatore e aspirare lentamente da cinque a venti blastomeri nell'ago, assicurandosi che la punta dell'ago non venga a contatto con l'aria durante il trapianto. Inserire l'ago contenente i blastomeri in un embrione ospite e rilasciare lentamente i blastomeri. Il sito in cui i blastomeri vengono rilasciati influenzerà la localizzazione delle loro cellule figlie in stadi successivi dello sviluppo; per analizzare lo sviluppo della retina e del cervello, rilasciare le cellule al polo animale.Se si desidera analizzare lo sviluppo di altri tessuti e organi, è necessario considerare opportunamente diverse posizioni di rilascio. Per ridurre al minimo i danni meccanici durante il trapianto, gli embrioni ospiti vengono lasciati nelle pozzette di agros a 28,5 gradi Celsius fino al giorno successivo. Successivamente, trasferire gli embrioni mosaic in piastre a 24 pozzetti pre-ricoperte con 0,5 millilitri di aros al 1% e riempite con un millilitro di acqua per uova E3.Aggiungere un embrione per ogni pozzetto per prevenire infezioni batteriche con 10 microlitri di penicillina e streptomicina 100x. In ogni pozzetto, pesare e preparare agarosio a basso punto di fusione o LMP e mantenere la soluzione in un bagno d'acqua a 30 gradi Celsius. Trasferire un embrione mosaic in una piastra flora con fondo in vetro spesso 0,17 millimetri.Rimuovere l'eccesso di acqua E3 in modo che l'embrione sia appena coperto. Quindi aggiungere rapidamente da 30 a 50 microlitri di LMP al 1,5% fuso all'embrione, prima che la soluzione ARO si solidifichi. Posizionare l'occhio o il cervello il più vicino possibile al fondo in vetro.Dopo che la soluzione si è raffreddata, aggiungere ulteriore soluzione di agarosio per fissare ulteriormente gli embrioni in posizione. Immergere il blocco di agarosio solidificato in due o tre millilitri di acqua per uova E3 per la microscopia confocale. Si utilizza un obiettivo invertito a immersione in acqua 40x con grande profondità di fuoco.Aggiungere una goccia d'acqua sull'obiettivo e posizionare una piastra per colture di tessuti flora sul portapreparati, quindi mettere a fuoco per lo sviluppo dell'immagine. Eseguire l'acquisizione temporizzata scattando fotografie agli embrioni ogni cinque minuti. A seconda della natura degli esperimenti, gli intervalli di tempo tra gli scatti possono essere regolati.Qui viene mostrata un'immagine rappresentativa di un pesce seber a 24 HPF. L'espressione di GFP evidenzia le cellule donatrici in verde. Le cellule neuroepiteliali retiniche si estendono per tutta la spessore della parete retinica.Questo filmato mostra i movimenti delle cellule donatrici nel cervello dell'ospite a 24 HPF. Osservare come la morfologia cellulare cambi nel tempo. Mostra semplicemente come eseguire il trasporto speculare del seno nel pesce zebra.Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di preparare un buon ago nell'area del seno destinata al trapianto con delicatezza. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con il vostro esperimento.

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Il trapianto di GFP che esprimono blastomeri per dell'immagine in tempo reale dello sviluppo della retina e del cervello in embrioni di zebrafish Chimerico

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