Il trapianto di GFP che esprimono blastomeri per dell'immagine in tempo reale dello sviluppo della retina e del cervello in embrioni di zebrafish Chimerico

I blair sono le cellule embrionali che si formano durante la fase di scissione dello sviluppo. Qui i Blair marcati GFP vengono trasferiti da un embrione di zebrafish all'altro utilizzando un ago da trapianto. Questo metodo consente di seguire il comportamento e il destino dei blasfemi con background genetici alterati in un embrione altrimenti normale o viceversa mediante imaging microscopico dal vivo.

Ciao, sono il Dr.Zoran, il laboratorio del Dr.Shawe nel Dipartimento di Oftalmologia dell'Università di Pittsburgh. Oggi vi mostreremo una procedura per il trasporto del mial mammario nel zebrafish embr. Usiamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare la retina e lo sviluppo del cervello.

Quindi iniziamo. La sera, organizza incroci a coppie di pesci zebra per evitare accoppiamenti casuali. Prima del tempo desiderato, utilizzare i divisori per separare il pesce femmina e maschio. Qui.

pesci transgenici che esprimono GFP sono utilizzati come fonte di blastomeri donatori. La linea transgenica PT 1 0 4 esprime la GFP ubiquitariamente sotto il controllo del promotore EF one per preparare i pozzetti agros che conterranno gli embrioni versati all'1% di agros fuso preparato in E tre acqua di uova in una capsula di Petri. Far galleggiare uno stampo di plastica con sporgenze a forma di cuneo sulla soluzione agros.

Quindi lasciarlo raffreddare. Per solidificare con cura, togliere lo stampo e immergere il letto di agros in acqua E tre. Quindi, prepara gli aghi da trapianto.

Utilizzare un estrattore verticale per aghi con l'impostazione di potenza 11,5 per estrarre le pipette capillari in vetro. Le punte degli aghi devono essere affusolate con aste lunghe. Macinare le punte dell'ago con un angolo di 45 gradi con una micro smerigliatrice fino ad ottenere aperture smussate di 30-40 micrometri di diametro interno.

Per pulire le punte dell'ago, collegare un tubo all'estremità smussata, collegare il tubo a una siringa e quindi aspirare e rilasciare una soluzione di acido fluoridrico al 10%. Fino a rimuovere tutti i detriti visibili. Lavare le punte con acqua distillata.

Quindi, con etanolo al 100%, asciugare gli aghi all'aria fino a quando tutto l'etanolo evapora. È importante assicurarsi che le punte siano completamente asciutte. L'etanolo residuo rovinerà gli aghi durante la lucidatura ad alta temperatura.

Fase due, per ammorbidire e lucidare i bordi ruvidi delle punte degli aghi, cuocerle con il calore generato dal filamento di un micro falsario. Non lasciare che le punte dell'ago tocchino il filamento durante la lucidatura della quantità di elettricità che passa attraverso il filamento e della distanza tra il filamento e l'ago. Le punte possono essere regolate per raggiungere le condizioni di riscaldamento desiderate.

La temperatura non deve essere troppo alta. Questo scioglierà e deformerà le punte dell'ago dopo che i bordi ruvidi saranno levigati. Toccare con cautela il filamento riscaldato con la punta dell'ago, quindi tirare delicatamente il filamento per generare un'estremità appuntita.

Un ago affilato, liscio e pulito è fondamentale per ottenere blaster da donatore intatti senza danneggiare gli embrioni ospiti. Tirare una pipetta di vetro su una fiamma a gas per creare una sonda di vetro fine con un'estremità levigata. Questa sonda verrà utilizzata per posizionare gli embrioni nell'orientamento corretto prima del trapianto.

Il giorno dell'esperimento, rimuovere i divisori nelle cassette a croce per consentire ai pesci di accoppiarsi. Otto. Dopo 30 minuti, raccogli da 100 a 200 embrioni versandoli in una rete. Mettere gli embrioni in una capsula di Petri riempita con acqua E tre.

Quindi, utilizzando una pinza fine, decappottare gli embrioni strappando manualmente i COR. Quindi utilizzare una pipetta di vetro con uno stelo piegato per trasferire con cura gli embrioni rivestiti nei pozzetti. Non lasciare che gli embrioni entrino in contatto con l'aria, che li farà scoppiare.

Lasciare che gli embrioni si sviluppino a 28,5 gradi Celsius nei pozzetti aros fino a tre ore dopo la fecondazione o HPF mentre gli embrioni si sviluppano. Installare un apparato di trapianto collegando l'ago da trapianto a un sistema di micropompaggio riempito di olio minerale. Assicurarsi che il sistema non perda e non abbia bolle d'aria intrappolate.

Riempire l'intero ago da trapianto con olio minerale ad eccezione dello spazio da 0,5 a un microlitro di spazio all'apertura della punta. Recupera gli embrioni dall'incubatrice e posizionali sul tavolino di un microscopio per trapiantare la bestemmia. Utilizzare una sonda di posizionamento in vetro per orientare verso l'alto il lato della bestemmia dei tre o quattro embrioni HPF.

Quindi inserire delicatamente l'ago da trapianto in un embrione donatore e aspirare lentamente da cinque a 20 bestemmie nell'ago, assicurandosi che la punta dell'ago non entri in contatto con l'aria durante il trapianto. Inserisci l'ago pieno di blasfemia in un embrione ospite e rilascia lentamente la bestemmia. Il sito in cui i bestemmiatori vengono rilasciati influenzerà la localizzazione della loro progenie nelle fasi successive dello sviluppo per analizzare lo sviluppo retinico e cerebrale che rilascia cellule al polo animale.

Se si deve analizzare lo sviluppo di altri tessuti e organi, si devono considerare di conseguenza diversi luoghi di rilascio. Per ridurre al minimo i danni meccanici durante il trapianto, gli embrioni ospiti vengono lasciati nei pozzetti dell'agros a 28,5 gradi Celsius fino al giorno successivo. Quindi trasferire gli embrioni del mosaico in piastre a 24 pozzetti pre-rivestite con 0,5 millilitri di aros all'1% e riempite con un millilitro di acqua E tre uova.

Un embrione deve essere aggiunto a ciascun pozzetto per prevenire infezioni batteriche a 10 microlitri di 100 x penicillina e streptomicina. Per ciascuno, pesare bene e preparare aros a basso punto di fusione o LMP e conservare la soluzione in un bagno d'acqua a 30 gradi Celsius. Trasferisci un embrione di mosaico in un piatto di flora con un fondo di vetro spesso 0,17 millimetri.

Rimuovere l'acqua in eccesso per lasciare l'embrione appena coperto. Quindi, a 30-50 microlitri di LMP fuso all'1,5%, rapidamente prima che la soluzione ARO si solidifichi. Posiziona l'occhio o il cervello il più vicino possibile al fondo del vetro.

Dopo che la soluzione si è raffreddata, aggiungere altra soluzione agros per fissare ulteriormente gli embrioni in posizione. Immergere il blocco agros solidificato in due o tre millilitri di acqua d'uovo E tre per microscopia confocale. Viene utilizzato un obiettivo invertito a immersione in acqua 40 x con grande profondità di messa a fuoco.

Aggiungere una goccia d'acqua sull'obiettivo e posizionare una piastra per la coltura dei tessuti sul tavolino e mettere a fuoco lo sviluppo dell'immagine. Esegui l'imaging time-lapse scattando foto degli embrioni ogni cinque minuti. A seconda della natura degli esperimenti, gli intervalli di tempo tra gli scatti possono essere regolati.

Qui viene mostrata un'immagine rappresentativa di un pesce seber 24 HPF. L'espressione di GFP evidenzia le cellule del donatore in verde. Le cellule neuroepiteliali retiniche coprono l'intero spessore della parete retinica.

Questo filmato mostra i movimenti delle cellule del donatore nel cervello ospite a 24 HPF. Si noti che le morfologie cellulari cambiano nel tempo. Ti mostro solo come eseguire il trasporto dello specchio del seno nel pesce zebra.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordarsi di preparare delicatamente un buon ago sull'area del seno trapiantato. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con il tuo esperimento.