Proboscide Estensione di risposta (PER) Assay in Drosophila

Ciao. In questa presentazione vorremmo mostrarvi come eseguire il saggio della risposta all'estensione del proboscide nell'esofago. La risposta all'estensione del proboscide, o PER, è un saggio del comportamento gustativo utilizzato sia nelle mosche che nelle api mellifere. Quando il proboscide entra in contatto con una sostanza attraente, la mosca estende il proprio proboscide per consumare la sostanza.

Soluzioni di diversi zuccheri come saccarosio, glucosio e fruttosio sono molto attraenti per la mosca. La PR può essere osservata anche attraverso un contatto effettuato con la zampa, ma in questa presentazione desideriamo concentrarci sul contatto del probo. Pertanto, il primo passo per il saggio della PR è la privazione alimentare della mosca.

Ottimizzare la condizione di digiuno è uno dei fattori più importanti per questo saggio. In questo contesto, sono particolarmente rilevanti due aspetti: uno è il tempo di digiuno e l'altro è la dimensione corporea della mosca prima del digiuno.

E sembra esserci una correlazione positiva tra questi due fattori. E se la mosca è grande e grassa, è necessario sottoporla a un digiuno più lungo. Ora, la dimensione del corpo dipende dalla nutrizione presente nell'alimento per mosche e dalla densità delle mosche nella provetta.

Permettetemi di mostrarvi un buon esempio. Come potete vedere in questa provetta, i moscerini non sono sovraffollati. Ce ne sono circa, vediamo, da cento a 150 PPE nella provetta.

Quindi, non appena la mosca viene chiusa qui, si consiglia di mantenerla in un alimento fresco per altri tre o cinque giorni, quindi trasferirla in una provetta vuota, contenente un pezzo di carta. Questo deve essere mantenuto umido per tutto il tempo, e il periodo di digiuno può variare da 24 a 96 ore. Torneremo più avanti a descrivere il periodo di digiuno.

Ecco come fissare una mosca per il PER. Per prima cosa, prendete una mosca e un aspiratore. Poi posizionate una punta gialla da 200 microlitri sull'apertura.

Ora capovolgete contemporaneamente e soffiate su di esso. Potete spingere delicatamente la mosca verso l'alto nel beccuccio giallo, applicando un po' d'aria per far risalire la mosca fino a un punto in cui non può più muoversi. Utilizzando un rasoio, fate un segno approssimativamente all'altezza dell'occhio della mosca, quindi risucchiate la mosca e tagliate via la punta. Ora soffiate delicatamente all'indietro, riportando la mosca in posizione.

Ma subito prima di arrivare alla fine, effettuare un taglio SL nella posizione in cui si troverà la proboscide. È possibile procedere senza il taglio SL, ma ciò renderebbe sicuramente più semplice il processo successivo se presente. Ora, tagliare la punta gialla sotto la mosca, riempire la base con argilla e posizionarla in posizione verticale.

È possibile effettuare l'ultima regolazione aggiungendo altro argilla alla punta. Una cosa importante è cercare di non spingere troppo forte la mosca. Lasciatemi concentrare qui e forse la spingerò solo un po' più in alto.

Quindi la testa della mosca sarebbe leggermente sopra questo punto. Ecco come apparirebbe al microscopio quando si tenta l'operazione, mostrato in vista laterale e in vista frontale. Ora siete pronti a testare pr.

Il WIC che utilizziamo per somministrare il gusto viene preparato nel modo seguente. Utilizziamo tamponi Kim e li passiamo attraverso un tritadocumenti, ottenendo una striscia di questo tipo. La larghezza della striscia è di circa sei millimetri, sei millimetri, all'incirca da cinque a sei millimetri.

Ora ciò che bisogna fare è arrotolare questa striscia per formare un filo, arrotolandola con cura. Sto arrotolando, e ora abbiamo un filo che assume questa forma. Successivamente si prende una pinzetta, si tira e si separano delicatamente questi piccoli ciuffi dal filo.

E così è come produciamo il risveglio. In questo filmato, desideriamo dimostrare la posizione corretta per stabilire il contatto con il Pro Bois. Useremo un filo inzuppato con saccarosio al 4% e vorremmo mostrare la differenza di sensibilità toccando diverse regioni lungo l'asse dorso-ventrale.

Il centro del legume è qui, ed è la posizione più sensibile. Pertanto, si dovrebbe sempre cercare di stabilire il contatto al centro, in questo modo. Ora, quando si tocca la parte superiore o l'area dorsale del labro, la mosca non risponderà.

Quindi stiamo stabilendo un contatto lì, ma si può notare che la mosca non sta estendendo le ssis. La stessa cosa accade quando si tocca la parte più ventrale del labio. È un po' più difficile, ma vediamo se riusciamo a stabilire un buon contatto con la parte più bassa del labio.

Effettueremo un approccio delicato, molto delicato. E vediamo qui. Toccherò nuovamente il centro per assicurarmi che questa mosca sia ancora dentro.

Interessati al sapore dolce. Pertanto, nel lume, dobbiamo sempre toccare il centro, questa regione centrale. Quando si osserva verticalmente nel saggio, il centro del lume è orientato leggermente verso il basso in questa direzione.

Quindi, quando ci si avvicina al legume esclusivamente in orizzontale, cioè in questa direzione, questa direzione, il punto più vicino si trova tra la regione sensibile e quella non sensibile. In questo caso, si verifica una risposta. Ma se l'avvicinamento avviene appena al di sopra, non ci sarà alcuna risposta.

Quindi lasciatemi esplorare. Ora nessuna risposta nella prima fila della silla, seconda fila, terza fila, sì. Quindi è necessario andare almeno al di sotto della terza fila della silla.

Ora eseguirò una procedura analoga partendo dal basso. Questo è leggermente più difficile. Sto toccando la seconda riga a partire dal basso.

Ora salgo lì. La terza riga, la quarta riga, no, non risponde. La quinta riga lì.

Pertanto, si desidera toccare almeno dalla quarta alla quinta riga a partire dal basso. Ciò significa che è necessario toccare costantemente il centro, altrimenti si aumenterebbe notevolmente la varianza dei dati. Potrebbe essere utile esercitarsi ripetutamente.

E il fattore chiave è stabilire il contatto leggermente al di sotto del punto più vicino, partendo da un approccio orizzontale, che è questo qui. Successivamente, vorrei mostrarvi la differenza di sensibilità tra l'area mediale e quella laterale del labro. Sposto la posizione della mosca in modo che risulti rivolta verso l'alto in questa immagine.

Prima toccherò la parte centrale o mediale del labro della mosca, e potete vedere che la mosca risponde correttamente. Ora, successivamente toccherò il sensore situato nella parte più laterale del labro e potete osservare che in questo punto la mosca non risponde. Ora esplorerò dalla parte laterale verso il centro, toccando proprio il lato esterno.

Sto avanzando verso il centro un po' alla volta. E come potete vedere, non appena raggiunge esattamente il centro, la mosca risponde. Ripeto ancora una volta partendo dal lato e muovendomi verso il centro.

Pertanto, è importante toccare il centro del livello in entrambe le direzioni, verticalmente e orizzontalmente. In questa sezione, vorrei dimostrare come stabilire il contatto con l'osis. In generale, si desidera rendere il contatto il più delicato possibile.

Un buon indicatore dell'impatto è il movimento risultante della testa della mosca. Pertanto, il contatto ideale è quello in cui non si osserva alcun arretramento della testa. L'altro fattore importante è la forma dello stoppino.

Mostrerò alcuni esempi. La forma dello stoppino qui è molto buona. Non è né troppo spesso né troppo sottile.

Se è troppo spesso, diventa difficile ottenere un contatto preciso e l'impatto tende a essere maggiore. Se è troppo sottile, non si riesce a sapere se la soluzione viene erogata correttamente fino alla punta, il che è peggio rispetto a uno strato spesso. Lasciatemi toccare il labbro alcune volte con questo.

E lì, lì, lì, e quasi non si vede alcun movimento della testa a causa del contatto in quel punto. A volte si ottiene una miccia che ha questo aspetto. Quindi la parte della punta è chiaramente troppo sottile.

Non puoi essere sicuro che la concentrazione sulla punta sia quella che desideri somministrare. Quindi, quello che puoi fare con questi è utilizzare la parte gialla della punta e piegarla alcune volte così, e facendo ciò, puoi modellarla in questa forma ideale, lasciami stabilire il contatto con questo. In questo modo puoi notare che non si vedono molti movimenti della testa.

C'è stato un leggero movimento dell'anca, ma sì, questo è un altro buon esempio. Non è sempre necessario scartare i campioni più spessi, purché si riesca a stabilire un contatto preciso e delicato. Si possono comunque utilizzare anche questi.

Il movimento della testa potrebbe essere leggermente più ampio rispetto a quelli sottili, ma finché si ha una mano ferma, è comunque possibile ottenere un buon contatto come questo. Questa è una cosa che non dovreste usare. Ci sono troppe fibre che fuoriescono e risulta difficile raggrupparle insieme.

È necessario scartare questi e trovarne un altro. Anche questo non è adatto. La punta è troppo sottile e troppo corta per essere piegata e ottenere una punta più spessa.

E le parti circostanti sono troppo spesse per stabilire un contatto preciso. Anche queste vanno scartate. Il problema di questo campione è che presenta troppo liquido e risulta difficile ottenere un contatto preciso.

Lascerebbe una quantità maggiore di liquido sul bastoncino di legno, il che potrebbe interferire con la procedura successiva. Anche se si avesse un ottimo stoppino, non sarebbe comunque corretto se non si effettuasse un contatto delicato. Ecco un esempio sbagliato.

Si può vedere la testa della mosca muoversi violentemente. Un forte impatto potrebbe scoraggiare la mosca dal rispondere a una sostanza e la mosca potrebbe facilmente perdere interesse per eventuali assaggi successivi. Successivamente, vorrei dare alcuni consigli su come ridurre l'impatto.

Per prima cosa, fermare lo stoppino sopra la punta gialla appena prima che entri in contatto. In questo modo, è possibile osservare l'ampiezza del tremolio della mano nel momento in questione. Osservando questo fenomeno, si può visualizzare la distanza dell'avvicinamento finale e muovere lo stoppino in modo che il punto più esterno del tremolio della mano raggiunga l'illa del velino.

E, ovviamente, sarebbe meglio se non si avesse alcun movimento delle mani. Tuttavia, questo metodo consente di lavorare nonostante ciò e ridurrebbe l'impatto complessivo. Una cosa che notiamo è che, anche se si fa volare la mosca per lo stesso periodo di tempo, si ottiene un gruppo di mosche che non risponde a nulla a causa di un tempo insufficiente di digiuno.

In alternativa, potreste trovare un lotto di moscerini completamente morti. Pertanto, sottoporre a test moscerini dopo un tempo fisso di digiuno, indipendentemente dal loro stato fisiologico, non è una scelta molto accurata. Questo approccio aumenterebbe così tanto la variabilità dei dati da poter oscurare il fenomeno che state cercando di osservare.

Per migliorare questa situazione, desideriamo presentarvi una serie di controlli per valutare lo stato della mosca. Il primo passo consiste nel testare la PER di un controllo positivo, costituito da saccarosio al 4%. Questa concentrazione è sufficientemente elevata da indurre una risposta.

Per la maggior parte delle mosche stellate, se la mosca non risponde a questo controllo positivo, significa che potrebbe essere necessario un tempo maggiore di digiuno oppure che è inattiva per diverse altre ragioni, come ad esempio lesioni. Pertanto, è necessario scartare queste mosche. Ora, se invece hanno risposto, provate con un controllo negativo, che consiste in acqua.

Se la mosca ha risposto all'acqua, ciò significa che ha sete, oppure che risponde a qualsiasi stimolo o che è stata condizionata a mangiare qualsiasi cosa si avvicini. Ciò è dovuto alla sostanza attraente utilizzata come controllo positivo in questo caso. E la mosca ha imparato che un oggetto in avvicinamento è probabilmente dolce.

Quindi stiamo cercando di misurare un comportamento legato al gusto, non un comportamento legato all'apprendimento. Inoltre, non si desidera che il trial precedente influenzi il trial successivo a causa dell'apprendimento. Sembra che, quando una concentrazione più elevata viene utilizzata come controllo positivo, aumentino le probabilità di una risposta al controllo negativo.

Ora, puoi sottoporre la mosca al test PER con qualsiasi sostanza o condizione tu abbia, ma dopo il test dovresti riprovare i controlli positivo e negativo. Infatti, se la mosca non risponde al controllo positivo, ciò significa che ha perso interesse per gli stimolanti durante il test e non potresti sapere se la mancata risposta al test è dovuta a una generica mancanza di interesse della mosca. Successivamente, se la mosca risponde al controllo negativo, significa che ha avvertito sete o si è condizionata rispetto a un oggetto in avvicinamento. Se invece la mosca non risponde al controllo negativo, allora finalmente hai un dato che puoi accumulare.

Quindi, questa finestra dura di solito circa da cinque a 10, 15 minuti. E in alcuni casi ho osservato che questa finestra può protrarsi fino a 30 minuti. Dopo un po’ ci siamo resi conto che questa è una rappresentazione grafica della relazione tra il tempo trascorso dalla stella marina e la mortalità.

Quindi questo è il tempo e questa è la percentuale di moscerini vivi in un provetta. E ovviamente cominceranno a morire, con notevoli differenze. Una cosa che ho notato è che fino a un certo punto non ci saranno moscerini che rispondono al controllo positivo, ma improvvisamente inizierà ad apparire qualche moscerino che comincia a rispondere.

E ovviamente, man mano che il tempo passa, puoi continuare a utilizzarlo. Ma a un certo punto abbiamo notato che un numero crescente di moscerini risponde al controllo negativo. Pertanto, questo sarà l'intervallo di tempo entro cui è opportuno effettuare le ER.

Quindi la domanda è: quando avverrà questo fenomeno? E secondo la mia esperienza, in condizioni ottimali, ciò si verifica di solito tra le 36 e le 48 ore, ma a volte può arrivare fino a 72 ore e in realtà varia molto. Pertanto, è fondamentale disporre di diverse provette e avere un allestimento tale da poter cogliere questa breve finestra temporale.

Anche questa volta, anche con gli stessi tempi di digiuno star, lo stesso cibo, tutto uguale, questo varia davvero molto. Quindi anche con lo stesso patrimonio genetico, in un contesto genetico molto simile, questa caratteristica varia notevolmente. Per questo è proprio ciò di cui si deve fare molta attenzione.

Abbiamo parlato dei moscerini che sono stati condizionati agli stimoli e che ora rispondono a qualsiasi cosa. Un modo per prevenire questo fenomeno è non somministrare ripetutamente un sapore attraente e alternarlo con controlli negativi. Ora vi mostrerò come funziona.

Questo è quindi un controllo positivo. Si tratta di saccarosio al 4%, somministrato due volte qui. Pertanto, se si continua a somministrare ripetutamente questa sostanza dolce, alla fine si otterrà una condizionamento.

Ora, invece, aggiungeremo un controllo negativo. Come potete vedere, non c'è alcuna risposta al controllo negativo. Ripeto l'operazione.

Primo controllo positivo, 4% con 4% di saccarosio. Permettetemi di modificare leggermente questo parametro. Una risposta di riposo nuovamente molto intensa e molto rapida.

E ora ancora una volta, passeremo al controllo negativo. Vediamo, non c'è un buono, lasciatemi girare questo. Ok, qui.

Questo è quindi l'acqua di controllo negativo. Come si può vedere, non risponde nel controllo negativo. Ora vi mostrerò un esempio negativo.

Quindi qui stiamo somministrando il 8% di saccarosio, una concentrazione superiore a quella del controllo positivo che utilizziamo. La mosca lo apprezza molto e cerca attivamente di raggiungerlo; permettetemi di riprovare. Vediamo un contatto delicato qui.

E sta cercando molto attivamente. È ancora nei suoi vantaggi estesi. Quindi aspettiamo un po' e stabiliamo un altro contatto lì.

Oh, ecco. Quindi sta ancora cercandolo. Lo sta cercando.

Assicurarsi, sì, va ancora bene. E forse un'altra volta, ancora una volta, un'ultima volta. Oh, ecco, sì, è una risposta molto intensa.

Ora, invece del saccarosio all'8%, proviamo a utilizzare un controllo negativo. Dunque, portiamo qui questa miccia. È un po' troppo sottile.

Ora lo piego per creare una bella scala. Ma questa è acqua. Quindi potete vedere, in questo caso, come la mosca risponde all'acqua.

In questo esempio, abbiamo somministrato una sostanza molto attraente per cinque volte. Ciò non significa che due volte vada bene, ma cinque volte sia dannosa. Esistono molti casi in cui il moscerino viene condizionato già con una singola applicazione di 4% di gross o anche con un costo inferiore, ossia una concentrazione più bassa.

E il messaggio importante è cercare di ridurre il numero di applicazioni ripetute di una sostanza attraente. E se si dispone di una serie di concentrazioni di una sostanza dal sapore attraente, è più sicuro iniziare dalla concentrazione più bassa e passare gradualmente a una più alta, ritirando il sapore nel modo più rapido possibile in modo che la mosca non possa consumarne una quantità significativa, riducendo così anche il condizionamento della mosca. Salve, in questa presentazione abbiamo illustrato tutti i passaggi per il saggio della risposta di protrusione del proboscide.

Il metodo in sé sembra piuttosto semplice, ma proprio come molti altri saggi comportamentali, ci sono piccoli aspetti che possono impedire il corretto svolgimento del saggio. Abbiamo affrontato molte di queste fasi che richiedono particolare attenzione. Qui desidero sottolineare nuovamente alcuni dei fattori più importanti.

E la prima cosa è la forma dello stoppino. Ho mostrato alcune immagini di esempi molto buoni, ma in realtà tutto rientrerà in uno spettro continuo tra molto buono e molto cattivo. All'inizio potreste utilizzare qualcosa che si trova in questa fascia molto buona, ma giorno dopo giorno potrebbe cominciare a spostarsi.

La qualità, le settimane in cui potreste utilizzarla potrebbero iniziare a spostarsi verso un intervallo non più ottimale. E la percezione umana di ciò che è considerato buono può cambiare molto facilmente, senza che ce ne accorgiamo. Un modo per prevenire questo fenomeno è scattare un'immagine di riferimento di un WIC che funziona molto bene e osservare tale immagine immediatamente prima di testare P. Ora, il secondo fattore importante è l'impatto.

E questo è più facile da gestire perché il contatto migliore, l'impatto ottimale, sarebbe un contatto in cui non si vede affatto muoversi la testa. Quindi, se riuscite a rendere il contatto il più delicato possibile e se non vedete la testa della mosca spostarsi in alcun modo, quello sarebbe il migliore. Ora, la condizione di digiuno, il terzo fattore, è la condizione più difficile da controllare.

E in molti saggi comportamentali del gusto o saggi comportamentali olfattivi, un periodo di digiuno di 24 ore viene spesso utilizzato e potrebbe essere molto comodo per noi esseri umani per eseguire l'esperimento. Ma se allevate le mosche in condizioni ottimali, queste 24 ore sono piuttosto brevi. Tuttavia, anche utilizzando un alimento per mosche molto ricco e controllando con precisione la densità delle mosche, questa finestra sperimentale può variare, ad esempio, da 36 a 72 ore.

Quindi, come esperimento, devo dire che è molto scomodo per un essere umano o per delle persone eseguire questo esperimento, ma c'è un altro fattore che rende più difficile il compito per gli sperimentatori. Di fatto, ci sarebbero molte serie in cui la finestra temporale dell'esperimento potrebbe essere molto breve o addirittura potrebbe non esistere affatto. Pertanto, ci sono alcuni ostacoli significativi da superare.

Ma la cosa più importante sono il controllo positivo e il controllo negativo. Mantenendo rigorosamente questi standard, sarà possibile raccogliere set di dati affidabili.