Name: Determinazione del tessuto Utilizzando il trapianto Cap animali (ACT) Assay in Xenopus laevis /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-16T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Scopri come determinare il destino tessutale negli embrioni di Xenopus laevis utilizzando l'assay ACT. Questo metodo combina sovraespressione di RNA, trapianto di animal caps e marcatori fluorescenti per studiare la specificazione cellulare.

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Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti di ricerca per la Prevenzione della Cecità (Career Development Awards di MEZ e ASV e un finanziamento non vincolante per il Dipartimento di Oftalmologia), la Fondazione E. Matilda Zeigler (MEZ e ASV) e il National Eye Institute / NIH (MEZ , borse di studio e R01EY015748 R01EY017964).

Parte I. Set-up per l'analisi ACT <ol><li> Generare RNA ricoperto per iniezione come suggerito dal produttore, usando il loro fenolo: cloroformio metodo di purificazione (es. mMessage mMachine Kit; Applied Biosystems / Ambion, Austin, TX). RNA che codifica per una proteina fluorescente viene usato come tracciante. Trascriviamo sia proteina fluorescente gialla (YFP) o mCherry 5 cDNA, che si trova in un vettore di espressione pCS2 +. </li><li> Tirare tubi in vetro borosilicato capillari per formare punte di vetro affusolata con un estrattore micropipetta. Noi usiamo Sutter Micropipetta Puller, P-97 (Sutter Instruments, Inc., Novato, CA), come descritto in precedenza 6. </li><li> Fai soluzioni sterili nella tabella 1 da 10 X Marc modificato Ringer (MMR), soluzione madre (10 mM MgCl 2, 20 mM KCl, 20 mM CaCl 2, 50 HEPES mM, 1 M di NaCl, a pH 7,5, autoclave e conservati a RT). </li><li> Isolare testicoli da una rana maschio e conservare il tessuto a 4 ° C in una soluzione sterile di 1X MMR / gentamicina (50 mg / ml di gentamicina solfato; BioWhittaker, Cat # 17-518Z). Questo può essere fatto fino ad una settimana prima dell'inizio dell'esperimento, ma è perde la sua efficacia nel tempo. </li><li> Soluzione di deposizione delle uova (1X: 150 mM NaCl, 2,62 mM KCl, 0,8 mM Na 2 HPO 4, 20 mm Trizma base, 2,62 mM NaHCO 3 e 2,75 mM MgSO 4; portato a pH 7,6) può essere fatto come uno stock 8X, che può essere conservato a 4 ° C per un massimo di due settimane. Nota: attenzione per la contaminazione in questa soluzione, in quanto questo influenzerà la qualità della vostra uova. </li><li> Genera piastre iniezione. Per fare questo, si fondono l'1% di agarosio a 0.4X MMR in un forno a microonde, aggiungere ~ 6 ml di soluzione fuso agarosio in 60 piastre mm, delicatamente srotolare uno stampo in elastomero (Figura 1) sulla parte superiore della soluzione per evitare bolle e lasciate raffreddare per circa 20 minuti a RT. Per determinare il numero necessario, considerare il numero di condizioni sperimentali (ad esempio 1, YFP, 2, YFP Noggin +) e il numero di embrioni ospitare trapiantato necessario. Per i nostri esperimenti, abbiamo generare almeno 20 embrioni ospitare trapiantati per ogni condizione sperimentale. A 18-19 ° C, gli embrioni saranno allo stadio 15 per circa un'ora. Se ci vuole un'ora per effettuare 20 trapianti, poi due punti di tempo fecondazione sono necessari, assumendo gli embrioni ospitare accettare tutti i trapianti. Pertanto, quattro piatti di iniezione saranno necessari (2 condizioni x 2 punti exp tempo fecondazione = 4). Conservare le piastre a 4 ° C per un massimo di una settimana. </li><li> Genera piastre di isolamento tappo utilizzando 1% di agarosio + 0,7 X MMR con stampi come per la piastra di iniezione. Fai lo stesso numero di isolamento cap come piastre di iniezione più uno per ogni punto temporale fecondazione (4 + 2 punti di tempo fecondazione = 6). </li><li> Iniettare femmine con 500 unità di gonadotropina corionica umana alla fine della giornata il giorno prima microiniezione. Donne conservare a 16-18 ° C durante la notte. </li></ol> Parte II. Microiniezione RNA di embrioni di Xenopus laevis A. Preparazione per la microiniezione <ol><li> Rimuovere femminile ormonale indotta e metterli nei singoli serbatoi contenenti 1X soluzione la deposizione delle uova (ELS). Nota: non usare le uova che sono state in ELS più di due ore come la qualità delle uova è ridotta. Pertanto, circa un'ora prima fecondazione in vitro, abbiamo scartare tutte le uova dal serbatoio in modo che solo uova fresche di cui sono raccolti. </li><li> Preparare l'ago per microiniezione dal tagliando la punta per ottenere un diametro di 25-35 micron. Posizionare l'ago sulla picoinjector e calibrare in modo che esso eroga 10 Nl per iniezione. </li><li> Impostare un incubatore a 14 ° C. </li><li> Una volta che le femmine hanno deposto le uova per circa un'ora, togliere le uova dal serbatoio con una pipetta di trasferimento e di inserirli in piatti mm 60 Petri. Rimuovere il ELS molto dalle uova possibile e sostituirlo con 1X MMR. Le uova possono essere fecondate subito o rimanere in MMR 1X per un massimo di un'ora. Per l'analisi dei trapianti, è meglio fertilizzare due piatti, 80% di occupazione di un singolo strato di uova in un massimo di tre lotti separati verso le 11 del mattino, mezzogiorno e 1 pm. Dopo l'iniezione, che verranno messi a 14 ° C in modo che si svilupperà per le fasi desiderato per l'isolamento tappo (stadio 8,5-9) e il trapianto (stadio 15; vedere la Parte I, # 6). </li><li> Per verificare la qualità dei testicoli, facciamo una fecondazione mattina presto (~ 8 del mattino), che ci permette di estrarre i testicoli di un altro maschio, se lo sperma dalla prima non è praticabile. Nota: abbiamo omogeneizzare ~ 0,25 testicoli in 1 ml 1X MMR e aggiungere circa 5-7 gocce per piastra di ovociti. </li><li> In vitro fertilizzare le uova con testicoli omogeneizzato e, un'ora dopo, togliere il cappotto gelatina sulle uova con de-gelatina soluzione (164μl 1M DTT + 10 ml 1M Tris, pH 8,8 fino a 50 ml di acqua Nanopure autoclavata). Attendere fino a raggiungere stadio di due cellule per iniziare l'ordinamento, che dura circa 2 ore a 18 ° C o 1,5 ore a temperatura ambiente (22 ° C). </li><li> Utilizzando un trasfer pipetta, gli embrioni sorta uniformemente pigmentate e uniformemente dividendo, come mostrato nella calotta animale abbia lasciato in Figura 3, nel pozzo di un piatto pieno di iniezione Ficoll 0.4X MMR + 6%. </li></ol> B. Microiniezione <ol><li> Stretch Parafilm sopra la parte superiore di un 60 millimetri coperchio Petri. Pipettare 2 ml di tuo primo campione di RNA sul Parafilm ed aspirare con il PLI-100 per riempire il vostro ago per l'iniezione. Assicuratevi di controllare che l'ago sia ancora erogazione nL 10 del campione prima di iniziare l'iniezione. </li><li> Iniettare 20-30 a due cellule embrioni stadio (entrambi blastomeri) con 500 pg YFP RNA in un piatto e il tuo gene di interesse (ad esempio 20 pg Noggin RNA) più YFP RNA in un altro piatto 7. </li><li> Luogo 100-200 non per iniezione embrioni per ogni punto ora in un altro piatto di iniezione con la soluzione di Ficoll. Muoversi dentro e fuori dell'incubatore, allo stesso tempo come gli embrioni iniettati. Questi sono i padroni di casa per essere utilizzato nella parte IV. </li><li> Dopo l'iniezione, tutti gli embrioni incubare a 14 ° C durante la notte. Ripetere l'operazione per tutti i punti di tempo. </li></ol> Parte III. Isolare tappi animale da embrioni iniettati <ol><li> Arrivo la mattina presto per mettere in scena gli embrioni. Il punto di primo tempo dovrebbe essere in fase 9. Rimuovere quelli che non sono sopravvissuti. Procedere con le seguenti operazioni di lavoro con ogni punto di volta in lotti. </li><li> Eliminare la soluzione di Ficoll da ogni piatto e aggiungere MMR posteriore 0,7 X / soluzione di gentamicina. Per un piatto di isolamento del tappo, aggiungere una generosa quantità di 0,7 X MMR / gentamicina soluzione. Sloggiare embrioni da pozzi di iniezione loro piatto con una pipetta di trasferimento e posto nel piatto tappo appena preparato isolamento. </li><li> Isolare tappi animale in 0,7 X MMR soluzione + gentamicina, mantenendo 2 o 3 embrioni intatti per la stadiazione. O il Gastromaster, munito di una punta giallo piegato a 400 micron, o un paio di pinze taglienti numero 5 può essere utilizzato. </li><li> Mettere cappucci indietro nel 14 ° C incubatore fino al giorno successivo. Gli embrioni host deve essere rimosso dal termostato al tempo stesso i tappi per tenerli nella stessa fase di sviluppo come il tessuto del donatore. </li></ol> Parte IV. Il trapianto di tappi sul fianco <ol><li> Togliere i tappi e gli embrioni dal punto prima volta dal 14 ° C incubatore e lo stadio degli embrioni. Ordina per uniforme di colore giallo o rosso fluorescente-positivi tappi, a seconda del tracciante iniettato (Figura 2). </li><li> Contare il numero di tappi e rimuovere raddoppiare il numero di embrioni stadio 12-13 per un piatto di iniezione preparati al momento con 0,7 X MMR / soluzione di gentamicina. Con forte pinze # 5, rimuovere la membrana vitellina da ciascuno. Trasferirli alla piastra con i tappi, ma state attenti. Senza il loro membrana vitellina, gli embrioni possono dissociare rapidamente sulla superficie dell'acqua. </li><li> Utilizzando il gastromaster (punta gialla, 200-250μm filo piegato, impostazione più elevata) o # 5 pinzette, rimuovere un 200 micron quadrato sul lato di un embrione allo stadio 14-15 (Figura 3). Poi, tagliate un cappuccio a metà (con il gastromaster o la # 5 forcipe) e posizionare il tessuto nel foro praticato nel embrione ospitante. Ruotare l'embrione contro il bene di permettere la guarigione. Fate questo per gli embrioni che puoi mentre sono in fase 15. Ripetere l'operazione per tutti i punti di tempo. </li><li> L'embrione di solito guariscono in 30 minuti. Rimuovere le cellule morte (bianco) con un delicato movimento spazzolatura con una pinza # 5. Farle crescere a 18 ° C durante la notte. </li><li> Sotto il microscopio a fluorescenza dissezione, degli embrioni sorta con fluorescenza marcata, tessuto trapiantato. Rimetterli a 18 ° C a crescere fino allo stadio 42-43. </li><li> Anestetizzare gli animali in tricaine. A questo punto, è possibile scattare foto al microscopio a fluorescenza dissezione. Dopo aver fatto, fissare, sezione e immunostain o eseguire ibridazione in situ utilizzando marcatori per il vostro tessuto di interesse. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Progettazione di plexiglass per la fusione dello stampo elastomero usato per fare i piatti tenendo embrione. A x 38 38 mm tondo punte quadrate (~ 5 mm di profondità) è stato indirizzato da un pezzo di plexiglass che è di 50 x 50 mm quadrati e 25 mm di spessore. Circolare, equidistanti pozzi (1,5 mm di diametro) sono stati perforati 1 mm nella plastica. Per fare lo stampo in elastomero per i piatti microiniezione, abbiamo versato elastomero Sylgard in plexiglass e ha permesso di consolidare, come da istruzioni del produttore. Questo stampo elastomero è usato per fare l'iniezione e piastre di isolamento cap. <img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Cappello animale cernita che precedono il trapianto è importante, come espressione può variare. Tappo animali a sinistra esprime mCherry uniformemente sull'intero tessuto mentre l'espianto di destra è espressione spotty e saranno eliminati. <img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Un host tadpole ha sviluppato un occhio-come la struttura sul suo fianco da cellule trapiantate cap animali. Un'immagine fluorescente è stato sovrapposto l'immagine campo chiaro.

<ol><li>Smith, W. C., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+cloning+of+noggin%2C+a+new+dorsalizing+factor+localized+to+the+Spemann+organizer+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos.</a> Cell. 70, 829-840 (1992).</li>
<li>Lamb, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+induction+by+the+secreted+polypeptide+noggin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neural induction by the secreted polypeptide noggin.</a> Science. 262, 713-718 (1993).</li>
<li>Green, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Methods+in+Developmental+Biology%3A+Xenopus+%26+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus & Zebrafish.</a> Methods in Developmental Biology. , Humana Press. Towata, N.J. (1999).</li>
<li>Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+eyes+from+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of functional eyes from pluripotent cells.</a> PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Lan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noggin+Elicits+Retinal+Fate+in+Xenopus+Animal+Cap+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. , (2009).</li>
</ol>

In questo video, abbiamo dimostrato la nostra versione di tecniche classiche utilizzate dai biologi Xenopus, che noi ruotare per ottenere il tappo test animali trapianto. A temperatura ambiente, embrioni di Xenopus sviluppano molto rapidamente attraverso le fasi 9 e 15. Ponendoli a 14 ° C, lo sviluppo dell&#39;embrione viene rallentato e trapianti di molti altri possono essere eseguite in un esperimento. Se è necessario far crescere gli embrioni a stadi vecchi (&gt; 42/43), poi si consiglia di utilizza...

<table><tbody><tr><td>Kit mMessage mMachine SP6</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Tubi capillari in borosilicato (1,0 mm di diametro esterno x 0,5 mm di diametro interno)</td><td>FHC, Inc.</td><td>27-30-1</td><td></td></tr><tr><td>Tiratore di micropipette Sutter</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di gentamicina [50 mg/ml]</td><td>Fisher Scientific</td><td>BW17-528Z</td><td></td></tr><tr><td>Kit Sylgard/elastomero 1,1 lb</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9644388</td><td></td></tr><tr><td>Piatto di Petri in polistirene 60 x 15 mm</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>8609-0160</td><td></td></tr><tr><td>gonadotropina corionica umana</td><td>Intervet Inc.</td><td>22219</td><td></td></tr><tr><td>Sistemi di microiniezione Pico-Injector</td><td>Harvard Apparatus</td><td>650003</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore Torrey Pines Scientific ECHOtherm</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-680-21</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta di trasferimento</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>6290-20635A</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette Dumostar n. 5</td><td>Fisher Scientific</td><td>11295-10</td><td></td></tr></tbody></table>

determinazione del tessuto utilizzando il trapianto cap animali (act) assay in xenopus laevis</em

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Molte proteine ​​svolgono un duplice ruolo nello sviluppo embrionale. Quelle che regolano il destino determinazione delle cellule in un tessuto specifico può anche influenzare lo sviluppo di una regione più ampia dell&#39;embrione. Questo rende la definizione del suo ruolo in un tessuto particolare difficile da analizzare. Per esempio,<em&gt; Noggin</em&gt; Sovraespressione in<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embrioni provoca l&#39;espansione di tutta la regione anteriore, tra cui l&#39;occhio<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Da questo risultato, non si sa se Noggin gioca un ruolo diretto nella determinazione degli occhi o che, provocando l&#39;espansione del tessuto neurale, Noggin colpisce indirettamente la formazione di occhi. Avendo questo fenotipo complesso fa studiare il suo occhio-specifico ruolo nella determinazione del destino della cellula difficili da analizzare. Abbiamo sviluppato un metodo che risolve questo problema. Approfittando della natura pluripotenti del<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Animale cappuccio<sup&gt; 3</sup&gt;, Abbiamo sviluppato un test per testare la capacità del prodotto del gene (s), come<em&gt; Noggin</em&gt; O fattori di trascrizione campo dell&#39;occhio (EFTFs), per trasformare tappi in particolare tessuto o di tipi di cellule da trapiantare questo tessuto sul lato dell&#39;embrione<sup&gt; 4</sup&gt;. Anche se abbiamo trovato sia il trattamento Noggin proteina o un insieme di fattori di trascrizione possono determinare il destino delle cellule della retina in capsule animali, questa procedura potrà essere utilizzato per identificare prodotto del gene (s) coinvolti nello specificare altri tessuti come bene.

Animale tappi iperespressione del gene prodotto (s) sono trapiantati al fianco di sviluppo<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embrioni al fine di stabilire se il tessuto è determinata.

Determinazione del tessuto Utilizzando il trapianto Cap animali (ACT) Assay in Xenopus laevis</em

Molte proteine svolgono un ruolo duplice nello sviluppo embrionale. Quelle che regolano la determinazione del destino cellulare in un tessuto specifico possono influenzare anche lo sviluppo...

L'obiettivo generale del saggio A CT è verificare se un gene o più geni di interesse possano determinare il destino cellulare di un derma primitivo verso un particolare tipo cellulare. La procedura inizia con la sovraespressione delle RNA codificanti un gene reporter fluorescente e del gene o dei geni di interesse in embrioni in sviluppo di XUS lavis. Il passaggio successivo consiste nell'isolare il cappuccio animale o l'odum primitivo che esprime le RNA sovraespressi e coltivarli fino allo stadio 15.Il terzo passaggio della procedura consiste nel rimuovere il tessuto dal fianco di un embrione ospite allo stadio 15. L'ultimo passaggio prevede il trapianto della metà del tessuto della calotta dell'animale donatore sul fianco dell'embrione ospite e la coltivazione dell'ospite fino allo stadio 42-43. I risultati mostrano la formazione di tessuti ectopici, come strutture simili all'occhio, mediante sezionamento e immunomarcatura per marcatori specifici del tessuto.Ciao, sono e sine del Dipartimento di Oftalmologia della Upstate Medical University. Oggi vi mostrerò un procedimento che chiamiamo saggio di trapianto dell'ectoderma animale, sviluppato in collaborazione con Mike Suber. Utilizziamo questo saggio in entrambi i nostri laboratori per studiare i geni sufficienti per la formazione dell'occhio.Iniziamo. Per iniziare questa procedura, preparare gli RNA di cap da iniettare, trascrivendo noggin o un altro gene di interesse e YFP da utilizzare come tracciante. Preparare inoltre le soluzioni a base di MMR, una soluzione stock di otto x per la deposizione delle uova e gli aghi per l'iniezione degli embrioni.Viene utilizzato uno stampo in elastomero su misura per la realizzazione di piastre porta-embryos. Preparare una piastra di iniezione per ogni condizione sperimentale sciogliendo l'1% di AROS in 0,4 XMMR in un forno a microonde. Trasferire circa sei millilitri della soluzione in una piastra da 60 millimetri.Posizionare delicatamente uno stampo in elastomero sopra la soluzione per evitare bolle e lasciare raffreddare per circa 20 minuti. A temperatura ambiente, preparare una piastra di isolamento per capsula per ogni condizione sperimentale, utilizzando 1%AGROS più 0,7 XMMR con stampi, come appena mostrato per le piastre di iniezione. Preparare piastre aggiuntive per ogni punto temporale.Consultare il protocollo scritto allegato per i dettagli sul calcolo dei punti temporali. Successivamente isolare. Testare questi da una rana maschio e conservare il tessuto a quattro gradi Celsius in una soluzione sterile di 1 XMMR integrata con 50 microgrammi per millilitro di Gentamicina.Questa operazione può essere eseguita fino a una settimana prima dell'inizio dell'esperimento, ma si noti che lo sperma perde efficacia nel tempo; effettuare l'iniezione nelle femmine con 500 unità di gonadotropina corionica umana alla fine della giornata precedente la microiniezione. Mantenere le femmine a 16-18 gradi Celsius per tutta la notte.Ora tutto è pronto per la microiniezione il giorno seguente. Iniziare rimuovendo le femmine indotte ormonalmente e posizionandole in vasche individuali contenenti un XELS. Preparare l'ago per la microiniezione tagliandone la punta.Per ottenere un diametro compreso tra 25 e 35 micrometri, posizionare l'ago sull'iniettore pico PLI 100 e tararlo in modo che eroghi 10 nanolitri per iniezione. Impostare un incubatore a 14 gradi Celsius posizionando l'uscita a questa temperatura più bassa; dopo aver iniettato l'RNA, lo sviluppo dell'embrione rallenta e in un singolo esperimento è possibile eseguire molte più trapianti. Circa un'ora prima della fecondazione, rimuovere le uova dal serbatoio. Una volta che le femmine hanno deposto le uova, attendere un'ulteriore ora e quindi utilizzare una pipetta trasferibile per rimuovere le uova appena deposte dal serbatoio.Attenzione a non utilizzare uova che sono state nella soluzione ELS per più di due ore. Poiché la qualità delle uova diminuisce, posizionare le uova in piatti di Petri da 60 millimetri. Il piatto è riempito all'incirca all'80% da uno strato singolo di uova.Rimuovere dalle uova il più possibile ELS e sostituirlo con un XMMR. Le uova possono rimanere in un XMMR fino a un'ora. Successivamente, fecondare in vitro le uova con testicoli omogeneizzati.È preferibile fecondare gli embrioni in tre lotti separati intorno alle 11:00, a mezzogiorno e alle 13:00, in modo che possano svilupparsi fino allo stadio desiderato, 8,5-9 per l'isolamento del cap e stadio 15 per il trapianto. Un'ora dopo la fecondazione delle uova, rimuovere la guaina gelatinosa utilizzando la Soluzione D per il lavaggio della gelatina. Lavare con abbondanti quantità di 0,1 XMMR e quindi attendere finché le uova fecondate non raggiungono lo stadio a due cellule.Per iniziare il processo di selezione, preparare una piastra di iniezione riempita con 0,4 XMMR più 6% F ccal. Una volta che gli embrioni raggiungono lo stadio a due cellule, utilizzare una pipetta di trasferimento per selezionare gli embrioni con pigmentazione uniforme e divisione regolare, trasferendoli nel pozzetto della piastra di iniezione.Procedere con la microiniezione stendendo prima il profilo sopra la parte superiore del coperchio di una piastra di Petri da 60 millimetri. Pipettare due microlitri del campione di RNA sul biofilm e aspirare. Utilizzare l'iniettore pico per riempire l'ago di iniezione.Assicurarsi di verificare che l'ago stia ancora erogando 10 litri di campione prima di iniziare l'iniezione. L'RNA viene iniettato in entrambi i blastomeri di un embrione a due cellule. Iniettare da 20 a 30 embrioni, ciascuno con 500 picogrammi di Y-F-P-R-N-A, e posizionarli in una singola piastra.Iniettare altri 20-30 embrioni ciascuno con 20 picogrammi di RNA di Nain pre-miscelato con Y-F-P-R-N-A e posizionarli nella piastra. In aggiunta, posizionare da 100 a 200 embrioni non iniettati per ogni punto temporale in un'altra piastra di iniezione contenente la soluzione FICO. Spostare questi embrioni dentro e fuori dall'incubatore nello stesso momento degli embrioni iniettati.Questi sono gli ospiti da utilizzare per il trapianto delle caliptrie dopo l'iniezione. Incubare tutti gli embrioni a 14 gradi Celsius durante la notte. Ripetere per tutti i punti temporali previsti.Dopo l'incubazione notturna, si può isolare il cappuccio animale. Arrivare presto al mattino per determinare lo stadio degli embrioni. Ricordarsi di rimuovere anche gli embrioni ospiti non iniettati dall'incubatrice.Il primo punto temporale deve corrispondere allo stadio nove. Inizialmente, rimuovere gli embrioni non sopravvissuti. Procedere quindi all'isolamento delle calotte animali dagli embrioni vitali, lavorando ogni punto temporale in lotti destinati a una capsula di isolamento.Aggiungere una quantità generosa di soluzione 0.7 XMMR più gentamicina. Quindi versare la soluzione fol ogni piastra contenente gli embrioni iniettati e aggiungere nuovamente la soluzione 0.7 XMMR più gentamicina. Staccare gli embrioni dalle cavità della piastra di iniezione utilizzando una pipetta di trasferimento e posizionarli nella piastra per l'isolamento dei cap appena preparata.Utilizzare il gastro master dotato di una punta gialla piegata a 400 micrometri oppure una coppia di pinzette sottili numero cinque per isolare le calotte animali in soluzione di 0,7 XMMR più Gentamicina. Conservare due o tre embrioni integri per lo staging. Dopo aver isolato le calotte animali, riporle nell'incubatrice a 14 gradi Celsius insieme agli embrioni ospiti fino al giorno successivo, quando le calotte verranno trapiantate sul fianco degli embrioni ospiti.Rimuovere i cappucci e gli embrioni ospiti dal primo punto temporale dall'incubatrice a 14 gradi Celsius e stadiare gli embrioni selezionando i cappucci fluorescenti positivi uniformi. Contare il numero di cappucci e rimuoverli. Raddoppiare il numero di embrioni ospiti trasferendoli in una nuova piastra per iniezioni preparata con soluzione 0,7 XMMR più Gentamicina, utilizzando pinzette sottili numero cinque.Rimuovere la membrana lene da ciascun embrione ospite. Trasferirli nella piastra con i coperchi, facendo attenzione poiché, senza le membrane lene, gli embrioni possono dissociarsi rapidamente sulla superficie dell'acqua utilizzando il gastro master dotato di punta gialla con un filo piegato di 200-250 micrometri alla massima impostazione oppure utilizzando pinzette numero cinque.Rimuovere un quadrato di 200 micrometri dal lato dell'embrione allo stadio 14-15. Quindi, utilizzando nuovamente il gastro master o le pinzette numero cinque, tagliare a metà un tappo e posizionare il tessuto nel foro creato nell'embrione ospite.Ruotare l'embrione contro la cavità per favorire la guarigione. Eseguire questa operazione per quanti più embrioni possibile mentre si trovano allo stadio 15. Ripetere per tutti i punti temporali.L'embrione di solito guarisce entro 30 minuti. Con pinzette numero cinque, rimuovere le cellule morte, che appaiono bianche, mediante un delicato movimento di spazzolamento. Far sviluppare gli embrioni trapiantati a 18 gradi Celsius per tutta la notte.Dopo l'incubazione notturna, lavorare sotto il microscopio stereoscopico a fluorescenza per selezionare gli embrioni con il tessuto trapiantato marcato fluorescentemente. Riposizionare gli embrioni selezionati a 18 gradi Celsius per farli crescere fino allo stadio 42-43. Quando gli animali raggiungono lo stadio desiderato, anestetizzarli in trica ed esaminarli al microscopio stereoscopico a fluorescenza, quindi acquisire le immagini.Gli embrioni trapiantati possono quindi essere fissati, sezionati e immunoistocolorati, oppure si può eseguire un'ibridazione in situ utilizzando marcatori per un tessuto di interesse. Di seguito sono riportati risultati rappresentativi di una girino ospite con tessuto donatore che esprime un tracciante fluorescente e noggin un giorno dopo il trapianto. Si noti come il tessuto si raggruppi lateralmente sul girino.Gli embrioni ospiti che ricevono tessuto donatore controllato esprimente soltanto il tracciante fluorescente iniziano già a incorporare le cellule del cappuccio animale sul loro fianco. Alcuni giorni dopo, i girini che ricevono cellule donatrici esprimenti nain formano strutture simili all'occhio lungo il loro fianco, mentre i girini che ricevono il tessuto donatore di controllo presentano cellule fluorescenti sulla superficie della loro pelle. Vi abbiamo appena mostrato come eseguire il saggio di trapianto del cappuccio animale in Zaps Lavis.Quando si esegue questo saggio, è importante ricordare di avere tutto pronto prima della procedura del giorno stesso, in modo che gli embrioni non si sviluppino più velocemente di quanto si riesca a seguirli. È tutto.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Xenopus embrionale epiteli sono un sistema modello ideale per studiare i comportamenti delle cellule, come lo sviluppo di polarità e cambiare forma durante la morfogenesi epiteliale. Istologia tradizionale di campioni fisso è sempre più integrato da live-cell imaging confocale. Qui mostriamo metodi per isolare i tessuti rana e visualizzare dal vivo le cellule epiteliali e le loro citoscheletro con live-cell microscopia confocale.

Live-cell imaging e analisi quantitativa della embrionali in cellule epiteliali Xenopus laevis</em

Xenopus laevis fornisce un sistema modello ideale per studiare il destino specificazione delle cellule e la funzione fisiologica delle singole cellule retiniche in colture cellulari primarie. Presentiamo qui una tecnica per la dissezione e la generazione di tessuti retinici colture cellulari primarie che vengono esposte ad attività calcio e analizzati mediante ibridazione in situ.

Dissezione, Cultura, e analisi di<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tessuto embrionale della retina

Una tecnica per il trapianto "Extreme anteriore dominio" dei tessuti del viso tra Xenopus laevis embrioni è stato sviluppato. Tessuto può essere spostato da un gene espressione sfondo in un'altra, permettendo lo studio delle esigenze locali di sviluppo craniofacciale e di segnalazione interazioni tra regioni facciali.

Trapianti viso a<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embrioni

Il manoscritto qui fornisce un semplice insieme di metodi per analizzare la secrezione e la diffusione di fluorescenza ligandi marcati nel Xenopus. Ciò fornisce un contesto per valutare la capacità di altre proteine ​​di modificare la distribuzione ligando e permettendo esperimenti che possono dare comprensione dei meccanismi che regolano gradienti morphogen.

Utilizzando Analisi confocale di<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Per Indagare modulatori di Wnt e Shh morphogen gradienti

Negli embrioni di Xenopus, le cellule del tetto del blastocele sono pluripotenti e possono essere programmate per generare vari tessuti. Qui, descriviamo i protocolli per utilizzare gli espianti di tetti di blastocele di anfibi come sistema di analisi per studiare le caratteristiche chiave in vivo e in vitro dello sviluppo neurale precoce.

Cellule staminali simil-<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionali espianti di studiare Caratteristiche precoce dello sviluppo neurale<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em

Descriviamo un sistema di ovociti e cappucci animali di Xenopus per il clonaggio dell'espressione di geni in grado di indurre una risposta in un ectoderma competente, e discutiamo le tecniche per la successiva analisi di tali geni. Questo sistema è utile nell'identificazione funzionale di un'ampia gamma di prodotti genici.

Clonazione funzionale utilizzando un<em&gt; Xenopus</em&gt; Ovociti Expression System

Questo articolo presenta un metodo conveniente e rapido per la visualizzazione di diverse popolazioni cellulari neuronali nel sistema nervoso centrale di embrioni di Xenopus mediante immunofluorescenza su sezioni.

La valutazione primaria neurogenesi in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrioni Utilizzando Immunocolorazione

Questo protocollo dimostra un metodo basato su fluorescenza per visualizzare la vascolarizzazione e per quantificare la sua complessità in Xenopus tropicalis . I vasi sanguigni possono essere immagazzinati minuti dopo l'iniezione di un colorante fluorescente nel cuore battente di un embrione dopo manipolazioni genetiche e / o farmacologiche per studiare lo sviluppo cardiovascolare in vivo .

Visualizzazione e analisi quantitativa di angiogenesi embrionale in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Descriviamo un protocollo per lo xenotrapianto nel tuorlo di embrioni trasparenti di zebrafish ottimizzato con un metodo di stadiazione semplice e rapido. Le analisi post-iniezione includono la sopravvivenza e la valutazione del carico di malattia delle cellule xenotrapiantate mediante citometria a flusso.

Un metodo semplice, rapido ed efficace per l'analisi dello xenotrapianto tumorale in embrioni trasparenti di zebrafish

Questa è la prima parte di un protocollo di campionamento completo di Xenopus . I tessuti campionati sono il ventricolo cardiaco, il tronco arterioso, il lobo del fegato sinistro, la cistifellea, il polmone, il pancreas, la milza, la laringe, l'esofago, lo stomaco, l'intestino, i testicoli, i corpi adiposi, l'ovidotto, i reni accoppiati, il plesso sciatico, la pelle, il timo e l'intero occhio.

Tecniche efficienti per il campionamento completo di tessuti accessibili in Xenopus adulto

Scopri come determinare il destino tessutale negli embrioni di Xenopus laevis utilizzando l'assay ACT. Questo metodo combina sovraespressione di RNA, trapianto di animal caps e marcatori fluorescenti per studiare la specificazione cellulare.

Determinazione del tessuto Utilizzando il trapianto Cap animali (ACT) Assay in Xenopus laevis

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