Video Bioinformatica Analisi delle embrionali umane crescita Colony cellule staminali

Questo protocollo dimostra il metodo di bioinformatica video per misurare la crescita di colonie di cellule staminali embrionali umane analizzando video time-lapse raccolti in un incubatore CT icon bio station, dotato di una telecamera per l'imaging video. Le colonie di cellule staminali embrionali umane o HESC vengono coltivate al 70% di co, ripiastrate e incubate per 48 ore, dopodiché le colonie di HESC vengono filmate per ulteriori 48 ore nel Biot ct. Il tasso di crescita viene determinato utilizzando il miglioramento della segmentazione e le ricette di misurazione sviluppate con il software CL quant.

Le ricette sono convalidate rispetto ad Adobe Photoshop, uno strumento di analisi delle immagini che consente l'adattamento preciso della maschera manuale a ciascuna colonia. Il campo emergente della bioinformatica video può essere utilizzato per automatizzare l'elaborazione, l'analisi e l'estrazione di dati biologici da video microscopici. Ciao, sono Serena Lin del laboratorio del Dr.Prou Talbot presso il Dipartimento di Biologia Cellulare e Neuroscienze qui all'Università della California Riverside.

Ciao, sono Sean Fino, anche lui del Talbot Lab. Ciao, sono TI Satish del programma di laurea in Biologia Cellulare Molecolare e dello Sviluppo. Oggi vi mostreremo come misurare la crescita delle colonie di cellule staminali embrionali umane utilizzando strumenti di bioinformatica video.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per misurare gli effetti delle sostanze tossiche ambientali sul comportamento delle cellule staminali embrionali umane. Dimostreremo questa procedura nella nostra nuova struttura di base per le cellule staminali. Quindi iniziamo.

Per preparare l'HESC per l'analisi video, coltivare HESC su piastre a sei pozzetti rivestite con matrigel fino al 70% di terreno aspirato confluente da un pozzetto contenente HESC e risciacquare due volte con un millilitro di PBS. Aggiungere un millilitro di Accutane e incubare per un minuto a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5%. Quindi, aggiungi da 10 a 12 perle di vetro nel pozzetto e agita delicatamente la piastra fino a quando le colonie non si staccano completamente.

Neutralizzare Accutane utilizzando un millilitro di terreno condizionato con cellule staminali embrionali umane, terreno o fibroblasti embrionali di topo. Raccogliere le cellule staccate senza le perle in una provetta conica da 15 millilitri e centrifugare a 200 g per tre minuti. Decantare il natante SUP e rompere il pellet con 500 microlitri di terreno di mantenimento di cellule staminali embrionali umane fresche o piastra M-T-E-S-R 100 microlitri della sospensione HESC goccia a goccia in pozzetti multipli di una piastra rivestita di matrigel a 12 pozzetti.

Agitare delicatamente la piastra avanti e indietro e osservare le colture al microscopio ottico per fare in modo che i grumi cellulari siano distribuiti uniformemente in tutti i pozzetti. Posizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi e al 5% di anidride carbonica per 48 ore per garantire che le celle siano attaccate in modo piatto e abbastanza grandi da poter essere visualizzate facilmente. Dopo 48 ore, aspirare il terreno e lavare i pozzetti con 500 microlitri di PBS per rimuovere le cellule non attaccate, quindi aggiungere 500 microlitri di terreno M-T-E-S-R a ciascuno.

Bene, posiziona immediatamente la piastra nella Biot CT e inizia a raccogliere immagini time-lapse. Cerca di selezionare campi con colonie singole discrete che non rischiano di crescere in altre colonie. In questo protocollo, le cellule vengono videoregistrate per ulteriori 48 ore con fotogrammi a intervalli di sette minuti.

Per creare prima la ricetta di segmentazione, scansiona manualmente l'intero video per verificare che contenga una singola colonia che rimane focalizzata per tutto il periodo di registrazione. Successivamente, apri la procedura guidata di segmentazione nel software CL quants e fai clic sul pulsante Avanti. Seleziona il canale immagine corretto e fai clic sul pulsante successivo.

Selezionare la corrispondenza temporanea e fare clic su Avanti. Selezionare una o due regioni di desiderio circondando il bordo esterno fino all'area centrale della colonia. Quest'area dovrebbe essere il più piccola possibile, ma dovrebbe essere rappresentativa dell'intera colonia.

Non scegliere troppe regioni in quanto ciò potrebbe comportare un'applicazione imprecisa della maschera. Fare clic sul pulsante Avanti. Selezionare Non desiderare regioni circondando le regioni che non fanno parte della colonia e non fanno parte dello sfondo.

Queste regioni hanno schemi che dovrebbero essere soppressi, come detriti e cellule morte. Fare clic su Avanti. Seleziona lo sfondo circondando regioni che non sono colonie, detriti o celle morte.

Lo sfondo deve essere uniforme e in grado di apparire in ogni fotogramma. In genere, selezioniamo lo sfondo grigio intorno alla colonia. Fare clic sul pulsante Avanti.

Se la maschera non copre accuratamente l'area di interesse, deve essere visualizzata una maschera colorata sull'area di interesse. L'intervallo della soglia di segmentazione nell'angolo in basso a destra dello schermo può essere aumentato o diminuito se è necessario cambiare la maschera. Selezionare Aggiorna le aree di corrispondenza temporanea.

Ciò consente di modificare le aree non desiderare o di sfondo. Se la maschera è soddisfacente, selezionare applica soglia e salvare la maschera. Quindi fare clic sul pulsante successivo.

La maschera verrà quindi visualizzata in un colore diverso. Selezionare Fine. La ricetta deve essere visualizzata nell'angolo in alto a destra del software come ricetta di segmentazione.

Rinominare la ricetta, se lo si desidera, facendo clic con il pulsante destro del mouse e inserendo un nuovo nome. Per applicare la ricetta. Fare clic con il pulsante destro del mouse e posizionare il mouse sopra.

Applicare la ricetta. Apparirà un menu che consente di selezionare il numero di fotogrammi da utilizzare. Impostate l'intervallo di fotogrammi su ogni 20 fotogrammi per garantire la fedeltà della maschera.

Controllate manualmente in modo casuale il 10% dei fotogrammi a cui è stata applicata la maschera per creare una ricetta di miglioramento che elimina le regioni indesiderate nei detriti. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla cartella delle ricette di miglioramento, quindi fare clic su Nuovo. Una nuova ricetta di miglioramento dovrebbe essere visualizzata dal campo visivo originale.

Sposta il mouse sulle icone nella barra degli strumenti per identificare il pulsante del modulo di miglioramento situato a destra dell'immagine e fai clic su di esso. Seleziona il menu a discesa dell'etichettatura. Seleziona l'etichettatura per connesso Seleziona l'etichettatura per i due collegati.

Dovrebbe essere visualizzata una nuova barra delle applicazioni. Prendi la maschera iniziale dalla ricetta di segmentazione e trascinala nella casella di input. La barra dovrebbe ora mostrare il numero della maschera di input.

Trascinare l'icona con il numero della maschera di input sull'icona zero della maschera. Trova la dimensione minima nella barra delle applicazioni e regola il numero finché non viene visualizzata solo la regione di interesse. Assicurati di fare clic su Esegui per ogni prova di adattamento.

Una volta che la regolazione della dimensione minima è soddisfacente, fare clic sulla ricetta di miglioramento precedente nella parte inferiore dello schermo, selezionare Salva nella ricetta. Il software ora richiede di sovrascrivere la ricetta selezionata e selezionare yes spot. Controllare la ricetta di miglioramento utilizzando la stessa procedura utilizzata per il controllo a campione della segmentazione.

Se sei soddisfatto delle ricette di segmentazione e miglioramento, continua con la creazione del modello di misurazione. Per iniziare la selezione, creare un modello di misurazione sulla barra degli strumenti a destra. Nella finestra di misurazione, seleziona sposta il cursore sulla figura della cella della clip art.

Tieni premuto il tasto Ctrl e seleziona la cella nella sezione morfologia, deseleziona il parametro predefinito e controlla il parametro dell'area. Quindi esci dalla finestra del modello. Seleziona l'icona.

Crea una ricetta di misurazione. Rinomina la ricetta. Nell'angolo in alto a destra, trascinare e rilasciare il modello di misurazione creato in precedenza nella finestra di misurazione.

Fare clic su Sì per continuare nella finestra della ricetta di misurazione, selezionare le mappature dei canali. Quindi l'intera cella seleziona le mappature delle maschere. Quindi selezionare l'opzione cella intera Per la maschera migliorata, selezionare la ricetta di misurazione nella scheda della ricetta.

Nella finestra principale, selezionare l'icona di salvataggio all'interno della finestra della ricetta di misurazione. Quindi chiudi la finestra Chiudi e riapri il campo visivo. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla cartella dell'elenco delle ricette, quindi fare clic su Nuovo, trascinare le ricette nell'ordine dell'applicazione necessaria nell'elenco delle ricette, selezionare Blocca elenco ricette ed eseguire le ricette in sequenza sui dati video utilizzando Adobe Photoshop.

Ogni 20 fotogrammi delle stesse colonie è stato analizzato. Apri manualmente un fotogramma di un'immagine di colonia in Adobe Photoshop. Fare clic sullo strumento bacchetta magica nella barra degli strumenti.

Fai clic sull'area intorno alla colonia in modo che l'intero campo sia coperto tranne la regione della colonia. Assicurati che la linea tratteggiata attorno alla colonia si adatti perfettamente alla periferia della colonia e non al suo interno. Se la linea tratteggiata non si trova attorno alla periferia, modificare di conseguenza il valore di tolleranza nella barra degli strumenti superiore.

Fai clic su modifica in modalità maschera veloce nella barra degli strumenti e fai clic sulla colonia in modo che la colonia venga selezionata. Vai alla finestra, menu a discesa e fai clic sull'istogramma. La cache deve essere impostata su uno.

Se la cache è due, fare clic sull'esclamazione per modificare la cache in una. Registra il valore del pixel in un foglio di calcolo. Ripeti il processo sopra per ogni 20° fotogramma.

I dati raccolti utilizzando Photoshop e i software CL quant possono quindi essere tracciati insieme. Il nostro protocollo per quantificare la crescita delle colonie di HESC dimostra un'applicazione della bioinformatica video a un problema biologico. Qui mostriamo un grafico che confronta l'aumento delle dimensioni delle colonie nell'arco di 48 ore, come determinato utilizzando il software CL quant e Adobe Photoshop.

Il grafico mostra cinque diverse colonie, ciascuna analizzata da entrambi i pacchetti software. Ogni colonia è rappresentata da un colore diverso. Le linee continue sono state derivate utilizzando il software sail quant mentre le linee tratteggiate sono state raccolte utilizzando Photoshop.

Il grafico dei dati grezzi mostra che entrambi i metodi di misurazione sono in buon accordo per tenere conto del fatto che le colonie hanno una dimensione iniziale diversa. Questa figura mostra i dati riportati come aumento percentuale delle dimensioni della colonia. I tassi di crescita sono simili indipendentemente dalle dimensioni della colonia iniziale ed entrambe le misure di analisi danno risultati simili.

Il grafico seguente mostra le medie dei precedenti dati di variazione percentuale sulla crescita delle colonie di HESC. Questo grafico mostra chiaramente una buona concordanza tra l'analisi effettuata utilizzando la bioinformatica video e Adobe Photoshop. Ti abbiamo appena mostrato come misurare la crescita di colonie di cellule staminali embrionali umane utilizzando strumenti di bioinformatica video.

Quando si esegue questa procedura utilizzando la microscopia a contrasto di fase, assicurarsi di includere l'alone attorno alla colonia per una selezione precisa della colonia da parte del software. È anche importante ricordare che altri metodi per la coltivazione, l'incubazione e la raccolta video possono essere utilizzati al posto del protocollo che abbiamo dimostrato. Una volta che le ricette sono state sviluppate e convalidate, eseguiranno l'analisi molto più rapidamente e con meno variazioni sperimentali rispetto all'analisi manuale.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.