Name: Rapida rilevazione omogenea dei saggi biologici Utilizzando Magnetic biopercezione sistema di modulazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Scopri un metodo di rilevazione omogenea e rapida di molecole biologiche con il sistema MMB, utilizzando microsfere magnetiche e marcatura fluorescente per rilevare IL-8 senza passaggi di lavaggio.

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Questo lavoro è stato in parte sostenuto dal Horowitz Ishaya Fondo.

IL-8 saggio: <ol><li> La miscela di reazione compresi i seguenti quattro componenti in 100 microlitri di volume finale di tampone nelle loro rispettive concentrazioni. 10 ml di sfere magnetiche con anticorpo di cattura a 100 perline / mL concentrazioni finali, 2 l di biotinilato IL-8 a 1 la concentrazione di anticorpi nano-gram/μl finale, 1 l di streptavidina proteina fluorescente a 20 nano-gram/μl concentrazione finale, e 1 ml di IL-8 target a 0,48 pico-gram/μl. I componenti vengono aggiunti uno ad uno per il tampone e poi agitato per 30 minuti. </li><li> Una reazione di controllo è preparato allo stesso modo senza l'IL-8 di destinazione. </li><li> Le reazioni sono poi collocati senza alcuna separazione o lavaggio in cuvette e controllati con il sistema MMB. </li></ol> MMB sistema: <ol><li> Posizionare la cuvetta nella sua posizione tra i due poli elettromagnetici. </li><li> Operare la corrente di modulazione ed attendere 30 secondi per consentire l'aggregazione e la condensazione delle perle </li><li> Misurare il segnale del amplificatore lock-in con un oscilloscopio. </li></ol> Rappresentante dei risultati: Ispezione visiva delle perle aggregati presentato una netta differenza tra la reazione con il target e la reazione senza il bersaglio. In tutte le reazioni con il bersaglio, le perle formano un unico aggregato denso che si muoveva dentro e fuori il raggio laser in modo uniscono. Tuttavia, in tutti la reazione senza il bersaglio, le perle erano meno aggregata e il loro movimento è stato meno unire (vedi Figura 1). <img src="/files/ftp_upload/1935/1935fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1: ispezione visiva del immunodosaggio a sandwich '(a) senza l'obiettivo di IL-8 (b) con l'obiettivo di IL-8. L'orologio di modulazione palo (giallo) e il segnale di uscita PMT (magenta), mentre la rilevazione 0,48 pico grammi IL-8 di destinazione sono presentati nella figura 1 (a). La modulazione di frequenza per ogni polo è a 2 Hz. Tuttavia, come è stato previsto teoricamente, quando le perline passare il raggio laser, la PMT rileva la luce fluorescente e non vi è un picco della tensione di uscita PMT. Pertanto, la frequenza di demodulazione è a 4 Hz. Quando il segnale di PMT e il raddoppio-modulazione dell'orologio (a 4 Hz), sono alimentati per il blocco amplificatore, il rilevatore di fase sensibile rileva la sincronizzazione e risultati con alta tensione (vedi Figura 2). <img src="/files/ftp_upload/1935/1935fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2: (a) l'orologio di modulazione (giallo) e il segnale di PMT (magenta) quando il rilevamento 0,48 pico grammi di IL-8 di destinazione. (B) Il blocco provocato tensione amplificatore a due diverse scansioni. Il blocco amplificatore non ha rilevato alcun segnale quando il campione di controllo è stato testato. Questo fatto, insieme con la differenza visiva di aggregazione suggerisce che il sistema MMB può chiaramente identificare la presenza di IL-8 di destinazione.

<ol><li>Danielli, A., Arie, A., Porat, N., Ehrlich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+fluorescent-labeled+probes+at+sub-picomolar+concentrations+by+magnetic+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Detection of fluorescent-labeled probes at sub-picomolar concentrations by magnetic modulation.</a> Optics Express. 16, 19253-19259 (2008).</li>
<li>Danielli, A., Porat, N., Arie, A., Ehrlich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+homogenous+detection+of+the+Ibaraki+virus+NS3+cDNA+at+pico-molar+concentrations+by+magnetic+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Rapid homogenous detection of the Ibaraki virus NS3 cDNA at pico-molar concentrations by magnetic modulation.</a> Biosensors and Bioelectronics. 25, 858-863 (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Bio-Rad+%22Human+angiogenesis+assay+panel%22%22">Bio-Rad "Human angiogenesis assay panel"</a>. , Bio-Plex Pro. Forthcoming.</li>
<li>Instruction Manual. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Bio-Plex+Precision+Pro+Cytokine+Assay%22">Bio-Plex Precision Pro Cytokine Assay</a>. , Bio-Rad Laboratories. Hercules, CA. Forthcoming.</li>
</ol>

In sintesi, abbiamo dimostrato che il sistema MMB può essere utilizzato per rilevare la presenza di IL-8 bersaglio a basse concentrazioni (0,5 pico grammi è il limite di rilevabilità del Bio-Plex saggi di citochine Precision Pro [3,4]). La capacità del sistema non si limita a IL-8 e può essere utilizzato per rilevare altre proteine. I vantaggi del sistema MMB sono la capacità di individuare il target rapidamente e senza alcuna separazione o fase di lavaggio. Così, facilita il processo di rilevamento e consente al sistem...

<table><tbody><tr><td>Set Bio-Plex Pro Citochina Umana IL-8</td><td>Bio-Rad</td><td>171-B5008M</td><td></td></tr><tr><td>Target ricombinante umano IL-8</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>R202625</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale biotinilato da topo anti IL-8 umano G265-8</td><td>BD Biosciences</td><td>554718</td><td></td></tr><tr><td>Proteina fluorescente coniugata con streptavidina</td><td>Bio-Rad</td><td>Streptavidin PE</td><td></td></tr></tbody></table>

rapida rilevazione omogenea dei saggi biologici utilizzando magnetic biopercezione sistema di modulazione

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

Un sistema di modulazione magnetica sensori biologici (MMB) [1,2] rapidamente e omogeneamente rilevato bersagli biologici a basse concentrazioni, senza lavaggio o fase di separazione. Quando l&#39;IL-8 bersaglio era presente, un &#39;sandwich&#39; saggio basato su sfere magnetiche attaccato con IL-8 anticorpo di cattura per streptavidina accoppiato proteina fluorescente attraverso l&#39;IL-8 e un obiettivo biotinilato IL-8 anticorpi. Le sfere magnetiche sono manovrati in movimento oscillatorio applicando un gradiente di campo magnetico alternato attraverso due poli elettromagnetici. Le proteine ​​fluorescenti, che sono attaccati ai talloni magnetici sono condensate nella zona di rilevamento e il loro movimento dentro e fuori di un raggio laser ortogonali produce un segnale periodico fluorescente che viene demodulato utilizzando il rilevamento sincrono. Il sistema di sensori biologici di modulazione magnetica è stato precedentemente utilizzato per rilevare le sequenze codificanti della proteina non strutturale del virus Ibaraki 3 (NS3) DNA complementare (cDNA) [2]. Le tecniche che si dimostrano in questo lavoro per la manipolazione esterna e la condensazione delle particelle possono essere utilizzate per altre applicazioni, ad esempio la consegna di farmaci magneticamente accoppiati<em&gt; In-vivo</em&gt; O migliorare il contrasto<em&gt; In-vivo</em&gt; Applicazioni di imaging.

Magnetico modulazione del sistema sensori biologici è utilizzata in modo rapido, con sensibilità e semplicemente rilevare saggi biologici, come le molecole di DNA e proteine.

Rapida rilevazione omogenea dei saggi biologici Utilizzando Magnetic biopercezione sistema di modulazione

Un sistema di biosensing a modulazione magnetica (MMB) [1,2] ha rilevato in modo rapido e omogeneo target biologici a basse concentrazioni senza alcun lavaggio o ...

La BIOSENSORIZZAZIONE con modulazione magnetica o MMB è una tecnica innovativa per il rilevamento di molecole biologiche. Qui viene mostrato un saggio dimostrativo in cui l'interleuchina otto viene rilevata quando l'interleuchina otto, chiamata anche IL otto, viene aggiunta a una miscela di reazione contenente microsferette magnetiche rivestite con anticorpi e anticorpo anti-IL otto marcati con streptavidina fluorescente. Viene così creato un sandwich molecolare che collega efficacemente la molecola fluorescente alla microsfera magnetica.La reazione viene posta in un vete e in un campo magnetico alternato. I gradienti sono applicati attraverso due poli elettromagnetici, che muovono le perle in un moto oscillatorio. Il movimento periodico della perla, a cui sono legate proteine fluorescenti, all'interno e all'esterno di un fascio laser ortogonale produce un segnale fluorescente che viene raccolto da un PMT e demodulato.Utilizzando un amplificatore a blocco, il movimento delle perline può essere visualizzato mediante una telecamera CCD al posto del movimento sincrono del PMT, osservato in campioni in cui le perline magnetiche sono state legate a proteine fluorescenti tramite IL eight. Ciao, sono Adia del Laboratorio di Ottica Non Lineare e Laser del Dipartimento di Elettronica Fisica dell'Università di Tel Aviv. Sono NoGo del Dipartimento di Scienze Biologiche dell'Università dell'Illinois a Chicago, e sono Marcelo Erlich del Dipartimento di Ricerca Cellulare e Immunologia dell'Università di Tel Aviv.Oggi vi mostreremo un metodo per il rilevamento omogeneo rapido di saggi biologici mediante un sistema di biosensing a modulazione magnetica. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per rilevare specifiche proteine e sequenze di DNA a basse concentrazioni. Cominciamo dunque.Iniziare questa procedura preparando ed etichettando un tubo per ogni reazione, inclusi un campione bersaglio e un campione di controllo non bersaglio. In ciascun tubo, aggiungere i seguenti componenti del saggio citochina bio plex Precision Pro, uno alla volta: perle magnetiche accoppiate, anticorpo di rilevamento IL eight, streptavidina PE e IL eight.Target. Portare il volume a 100 microlitri con buffer del saggio, quindi agitare per 30 minuti su un agitatore orbitale compatto.Dopo aver agitato i campioni per 30 minuti a temperatura ambiente, posizionarli direttamente nelle cuvette per l'analisi. Utilizzando il sistema MMB, pulire le cuvette con tessuto per la pulizia delle lenti e etanolo al 70%. Lo strumento utilizzato per l'analisi è costituito da un laser a 488 nanometri, raddoppiato in frequenza, impiegato come sorgente luminosa di eccitazione, diretto attraverso un divisore di fascio dicromatico a 562 nanometri verso una lente obiettivo del microscopio.L'obiettivo del microscopio focalizza il laser in un fascio di 27 micrometri di diametro all'interno di un tubo di vetro silicato BO largo 400 micrometri. La luce emessa viene filtrata spettralmente mediante due filtri passa-banda successivi, rilevata da un fotomoltiplicatore o PMT e demodulata utilizzando un amplificatore con rilevamento sincrono. Viene utilizzato un modulatore di corrente autocostruito per inviare un'onda quadra successivamente a ciascun elettromagnete.L'ampiezza deve essere di 1,4 ampere con una frequenza compresa tra uno e sei hertz, poiché le microsfere entrano ed escono dal fascio laser due volte per ogni ciclo. La frequenza di demodulazione sull'amplificatore a blocco di fase è compresa tra due e 12 hertz. Avviare il sistema ruotando la chiave del laser a 488 nanometri sulla posizione di accensione e attivando l'alimentazione.Quindi impostare la potenza del laser al minimo, circa quattro-sei milliwatt. Accendere l'oscilloscopio, quindi accendere il PMT. Successivamente, posizionare il campione tra i due poli elettromagnetici.Utilizzare la fase rotazionale del vete per assicurarsi che il fascio laser attraversi il vete senza colpire le pareti del vete. Utilizzare la fase di traslazione XY e Z del vete per modificarne la posizione rispetto all'obiettivo e ai poli elettromagnetici. Per ottimizzare l'accoppiamento della luce fluorescente nel rivelatore, il vete deve essere posizionato leggermente al di là della linea dei poli.Ora impostare l'oscilloscopio sulla misurazione del tracciato temporale. Impostare il controllo del guadagno del PMT su 0,5 volt. Successivamente, accendere il modulatore di corrente e impostare la frequenza a tre hertz.Attendere 30 secondi per consentire l'aggregazione e la condensazione delle perle. Le perle magnetiche inizieranno a oscillare avvicinandosi alla parte anteriore del tubo. Quando il fascio laser colpisce le perle in oscillazione, si dovrebbe osservare un bagliore di luce laser riflessa proveniente dalle perle.Si noti che le perle si muovono più velocemente all'aumentare della modulazione della corrente e più lentamente al suo diminuire. La posizione delle perle nel tubo può essere regolata utilizzando delle fasi controllate da micrometro. Per spostare i poli, il movimento delle perle può essere visualizzato mediante una telecamera CCD posizionata al posto del PMT.L'oscilloscopio rileva il segnale periodico proveniente dalle perle marcate con fluorescenza e registra la traccia temporale dell'oscilloscopio. I dati salvati possono essere analizzati utilizzando MATLAB. Miscele di reazione con e senza IL otto sono state saggiate mediante MMB. In tutte le reazioni con la sequenza bersaglio, le perle hanno formato un singolo aggregato denso che si muoveva all'interno e all'esterno del fascio laser in sincronia.Tuttavia, in assenza del bersaglio, le perle erano meno aggregate e il loro movimento era meno coordinato. Qui, il segnale del clock di modulazione del polo mostrato in giallo e il segnale di uscita del PMT mostrato in magenta rappresentano la frequenza di modulazione per ciascun polo a due hertz. Pertanto, la frequenza di demodulazione è di quattro hertz, come previsto teoricamente.Quando le perle attraversano il fascio laser, il PMT rileva la luce fluorescente e si verifica un picco nella tensione di uscita del PMT quando il segnale del PMT e l'orologio a doppia modulazione vengono inviati all'amplificatore lock-in. Il rilevatore di fase sensibile garantisce la sincronizzazione e produce una tensione elevata. I due colori indicano due scansioni diverse alla stessa concentrazione target.Le linee nere rappresentano la media di ciascun segnale. L'amplificatore a rilevamento di fase non ha rilevato alcun segnale quando è stato testato il campione di controllo. L'amplificatore a rilevamento di fase non ha fornito alcun segnale bloccato per questo caso.Questo fatto, unito alla differenza visiva nell'aggregazione, suggerisce che il sistema MMB e la differenza nelle misurazioni nel tempo del segnale di uscita del PMT possono identificare chiaramente la presenza del bersaglio ILH. Vi abbiamo appena mostrato come rilevare rapidamente e in modo omogeneo molecole biologiche utilizzando la modulazione magnetica. Biosensing con IL otto come esempio.Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di seguire le norme di sicurezza relative ai laser. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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