Rapida rilevazione omogenea dei saggi biologici Utilizzando Magnetic biopercezione sistema di modulazione

La BIOSENSORIZZAZIONE con modulazione magnetica o MMB è una tecnica innovativa per il rilevamento di molecole biologiche. Qui viene mostrato un saggio dimostrativo in cui l'interleuchina otto viene rilevata quando l'interleuchina otto, chiamata anche IL otto, viene aggiunta a una miscela di reazione contenente microsferette magnetiche rivestite con anticorpi e anticorpo anti-IL otto marcati con streptavidina fluorescente. Viene così creato un sandwich molecolare che collega efficacemente la molecola fluorescente alla microsfera magnetica.

La reazione viene posta in un vete e in un campo magnetico alternato. I gradienti sono applicati attraverso due poli elettromagnetici, che muovono le perle in un moto oscillatorio. Il movimento periodico della perla, a cui sono legate proteine fluorescenti, all'interno e all'esterno di un fascio laser ortogonale produce un segnale fluorescente che viene raccolto da un PMT e demodulato.

Utilizzando un amplificatore a blocco, il movimento delle perline può essere visualizzato mediante una telecamera CCD al posto del movimento sincrono del PMT, osservato in campioni in cui le perline magnetiche sono state legate a proteine fluorescenti tramite IL eight. Ciao, sono Adia del Laboratorio di Ottica Non Lineare e Laser del Dipartimento di Elettronica Fisica dell'Università di Tel Aviv. Sono NoGo del Dipartimento di Scienze Biologiche dell'Università dell'Illinois a Chicago, e sono Marcelo Erlich del Dipartimento di Ricerca Cellulare e Immunologia dell'Università di Tel Aviv.

Oggi vi mostreremo un metodo per il rilevamento omogeneo rapido di saggi biologici mediante un sistema di biosensing a modulazione magnetica. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per rilevare specifiche proteine e sequenze di DNA a basse concentrazioni. Cominciamo dunque.

Iniziare questa procedura preparando ed etichettando un tubo per ogni reazione, inclusi un campione bersaglio e un campione di controllo non bersaglio. In ciascun tubo, aggiungere i seguenti componenti del saggio citochina bio plex Precision Pro, uno alla volta: perle magnetiche accoppiate, anticorpo di rilevamento IL eight, streptavidina PE e IL eight.Target. Portare il volume a 100 microlitri con buffer del saggio, quindi agitare per 30 minuti su un agitatore orbitale compatto.

Dopo aver agitato i campioni per 30 minuti a temperatura ambiente, posizionarli direttamente nelle cuvette per l'analisi. Utilizzando il sistema MMB, pulire le cuvette con tessuto per la pulizia delle lenti e etanolo al 70%. Lo strumento utilizzato per l'analisi è costituito da un laser a 488 nanometri, raddoppiato in frequenza, impiegato come sorgente luminosa di eccitazione, diretto attraverso un divisore di fascio dicromatico a 562 nanometri verso una lente obiettivo del microscopio.

L'obiettivo del microscopio focalizza il laser in un fascio di 27 micrometri di diametro all'interno di un tubo di vetro silicato BO largo 400 micrometri. La luce emessa viene filtrata spettralmente mediante due filtri passa-banda successivi, rilevata da un fotomoltiplicatore o PMT e demodulata utilizzando un amplificatore con rilevamento sincrono. Viene utilizzato un modulatore di corrente autocostruito per inviare un'onda quadra successivamente a ciascun elettromagnete.

L'ampiezza deve essere di 1,4 ampere con una frequenza compresa tra uno e sei hertz, poiché le microsfere entrano ed escono dal fascio laser due volte per ogni ciclo. La frequenza di demodulazione sull'amplificatore a blocco di fase è compresa tra due e 12 hertz. Avviare il sistema ruotando la chiave del laser a 488 nanometri sulla posizione di accensione e attivando l'alimentazione.

Quindi impostare la potenza del laser al minimo, circa quattro-sei milliwatt. Accendere l'oscilloscopio, quindi accendere il PMT. Successivamente, posizionare il campione tra i due poli elettromagnetici.

Utilizzare la fase rotazionale del vete per assicurarsi che il fascio laser attraversi il vete senza colpire le pareti del vete. Utilizzare la fase di traslazione XY e Z del vete per modificarne la posizione rispetto all'obiettivo e ai poli elettromagnetici. Per ottimizzare l'accoppiamento della luce fluorescente nel rivelatore, il vete deve essere posizionato leggermente al di là della linea dei poli.

Ora impostare l'oscilloscopio sulla misurazione del tracciato temporale. Impostare il controllo del guadagno del PMT su 0,5 volt. Successivamente, accendere il modulatore di corrente e impostare la frequenza a tre hertz.

Attendere 30 secondi per consentire l'aggregazione e la condensazione delle perle. Le perle magnetiche inizieranno a oscillare avvicinandosi alla parte anteriore del tubo. Quando il fascio laser colpisce le perle in oscillazione, si dovrebbe osservare un bagliore di luce laser riflessa proveniente dalle perle.

Si noti che le perle si muovono più velocemente all'aumentare della modulazione della corrente e più lentamente al suo diminuire. La posizione delle perle nel tubo può essere regolata utilizzando delle fasi controllate da micrometro. Per spostare i poli, il movimento delle perle può essere visualizzato mediante una telecamera CCD posizionata al posto del PMT.

L'oscilloscopio rileva il segnale periodico proveniente dalle perle marcate con fluorescenza e registra la traccia temporale dell'oscilloscopio. I dati salvati possono essere analizzati utilizzando MATLAB. Miscele di reazione con e senza IL otto sono state saggiate mediante MMB. In tutte le reazioni con la sequenza bersaglio, le perle hanno formato un singolo aggregato denso che si muoveva all'interno e all'esterno del fascio laser in sincronia.

Tuttavia, in assenza del bersaglio, le perle erano meno aggregate e il loro movimento era meno coordinato. Qui, il segnale del clock di modulazione del polo mostrato in giallo e il segnale di uscita del PMT mostrato in magenta rappresentano la frequenza di modulazione per ciascun polo a due hertz. Pertanto, la frequenza di demodulazione è di quattro hertz, come previsto teoricamente.

Quando le perle attraversano il fascio laser, il PMT rileva la luce fluorescente e si verifica un picco nella tensione di uscita del PMT quando il segnale del PMT e l'orologio a doppia modulazione vengono inviati all'amplificatore lock-in. Il rilevatore di fase sensibile garantisce la sincronizzazione e produce una tensione elevata. I due colori indicano due scansioni diverse alla stessa concentrazione target.

Le linee nere rappresentano la media di ciascun segnale. L'amplificatore a rilevamento di fase non ha rilevato alcun segnale quando è stato testato il campione di controllo. L'amplificatore a rilevamento di fase non ha fornito alcun segnale bloccato per questo caso.

Questo fatto, unito alla differenza visiva nell'aggregazione, suggerisce che il sistema MMB e la differenza nelle misurazioni nel tempo del segnale di uscita del PMT possono identificare chiaramente la presenza del bersaglio ILH. Vi abbiamo appena mostrato come rilevare rapidamente e in modo omogeneo molecole biologiche utilizzando la modulazione magnetica. Biosensing con IL otto come esempio.

Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di seguire le norme di sicurezza relative ai laser. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.