Name: Microiniezione di embrioni Medaka per essere utilizzato come organismo modello genetico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Impara la tecnica di microiniezione negli embrioni di medaka per studiare la funzione genica in vivo. Questo metodo permette di analizzare l'espressione proteica e i cambiamenti morfologici nel modello vertebrato.

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Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della MRC.

1. Accoppiamento e raccolta delle uova <ol><li> Medaka maschio e femmina può essere facilmente distingue per la dimensione e la forma delle pinne anali e dorsali. Le pinne anali dei maschi sono più grandi e parallelogramma di forma rispetto a quella delle femmine. La pinna anale femminile è più piccolo e di forma triangolare. La pinna dorsale maschio ha una tacca profonda ben visibile tra le ultime due raggi. </li><li> Medaka deporre fino a 40 uova al giorno e femmine Medaka trasportare uova raggruppate a loro ventre da filamenti attaccamento per diverse ore prima di essere spogliato presso gli impianti nel serbatoio. </li><li> Le femmine possono essere catturati in una rete e mantenuto all'interno delicatamente da entrambi i lati da una mano. Le uova possono essere delicatamente preso in giro dalla pancia con il dito indice dell'altra mano. La femmina può essere restituito al serbatoio. Le uova dovrebbero essere trasferiti ad un piatto di 6 centimetri Petri riempite con i media embrione da pinze contundente o con un dito. </li><li> Coppie Medaka raramente combattere quando sono tenuti in una scatola di accoppiamento di piccole dimensioni. Pertanto, essi possono essere tenuti in una vasca piccola con flusso d'acqua in modo che possano essere alimentati e le uova possono essere ritirati presso lo stesso paio tutti i giorni per un paio di mesi. </li><li> E 'importante che i pesci femmina non deve essere tenuto senza maschi, dal momento che l'ovulazione avviene ogni giorno nelle femmine Medaka. In caso contrario, le femmine non in grado di offrire uova e diventare male. </li></ol> 2. Embrioni di pulizia <ol><li> Trasferimento non clustered uova con una pipetta di vetro di carta vetrata (grana P2000, impermeabile) posta nel coperchio di un piatto nove centimetri Petri. Rimuovere l'eccesso di media, ma garantire un volume sufficiente resta contro l'essiccamento della embrioni. </li><li> Ruotare delicatamente embrioni sulla carta vetrata con il dito indice, applicando una pressione minima e mantenendo le dita parallele alla superficie della carta vetrata per circa 45-60 secondi per rimuovere alcuni dei peli superficie esterna del corion. Non tiro più di embrioni di 5-7 in una sola volta questa precauzione per minimizzare il rischio di schiacciare gli embrioni sotto l'altro. </li><li> Trasferimento degli embrioni puliti per un piatto fresco di medio dell'embrione. </li></ol> 3. Fare piastre di agarosio per lo svolgimento di embrioni durante la microiniezione Gli embrioni sono tenuti in depressioni durante l'iniezione fatti con uno stampo in plexiglass 1,5% agarosio (Figura 1). La concentrazione di agarosio è importante tenere gli embrioni in modo corretto. <ol><li> Innanzitutto, una cornice di agarosio a tenere lo stampo in plexiglass. Versare 1,5% di agarosio in acqua ad una profondità 0,5 centimetri in un piatto nove centimetri Petri e attendere che si solidifica completamente. Tagliare una zona del agarosio appena più grande della dimensione dello stampo. </li><li> Versare 1,5% agarosio per riempire l'area taglio e luogo lo stampo in modo che non formino bollicine d'aria e attendere agarosio solidifica. Questa piastra di agarosio può essere conservato in frigorifero per accelerare solidifaction. </li><li> Togliere lo stampo per creare depressioni per tenere le uova. Aggiungi medio abbastanza embrione di immergere lo stampo, coprire e conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso. <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Schematica di misura stampo usato per preparare mangiatoie in lastre agarosio per la microiniezione. </li></ol> 4. Microiniezione di embrioni Medaka In Medaka, il DNA, l'RNA, gli oligonucleotidi morfolino e coloranti traccianti sono microiniettati attraverso il corion nel citoplasma di quelle 1 64-cellula embrionale fase piuttosto che il tuorlo come in zebrafish. Poiché il citoplasma è più piccolo e meno visibile in Medaka, pratica iniettando coloranti come rodamina-destrano si raccomanda di sviluppare questa abilità. L'aggiunta di rosso fenolo come tracciante è anche incoraggiati a consentire la conferma di iniezioni. Come il corion circostante embrioni Medaka è dura, una breve e ago per l'iniezione forte e ampia è necessario (Figura 2). Preparare questo ago forte iniezione di gamma da un filamento di vetro contenenti capillare. <ol><li> Preparare la soluzione di iniezione con rosso fenolo come tracciante e caricarla in l'ago dalla parte posteriore con un microloader Eppendorf. Collegare l'ago alla pompa iniettore aria. </li><li> Le uova devono essere raccolti e non clustered il più presto possibile dopo la fecondazione di iniettare al unicellulare stadio. Più embrioni può essere iniettato memorizzandoli su ghiaccio (non più di 30 minuti) per arrestare la divisione cellulare. <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Confronto di aghi Medaka e zebrafish. Si noti la punta dell'ago MF (in alto) è più corta e più larga quindi più forte per pungere il corion duro circostante embrioni Medaka. </li><li> Trasferire le uova nella piastra di agarosio e allinearle in depressioni con una pinza. Poco prima iniezione, cinque uova dovrebbero essere ruotata in modo la membrana cellulare delle cellule di un citoplasma può essere colpito da ªe aghi perpendicolarmente. Citoplasma della sola cellula può essere trovata con la ricerca di una zona priva di piccole goccioline di olio che si trova di fronte al lato dell'uovo con gocce di olio più denso. L'area identificata può essere confermato di essere il citoplasma dalla visione di lato. </li><li> Posizionare l'ago vicino alle uova. Aprire la punta dell'ago delicatamente toccando la punta dell'ago al corion o utilizzando microforceps (Figura 3). Una piccola quantità di sostanza di iniezione deve essere visto per defluire. </li><li> Puntura attraverso il corion di inserire la punta di un ago all'interno del corion. Regolare la pressione di mantenimento degli iniettori ad essere relativamente elevata, per garantire che non reflusso si verifica a causa della pressione alta sulla puntura attraverso il corion dura (impostazioni di 80-100hPA per la pressione holding e 500-700hPa per la pressione di iniezione). </li><li> Inserire la punta dell'ago nel citoplasma da bruscamente colpendo la sua membrana. Evitare di inserire la punta di un ago nel tuorlo. A differenza di zebrafish, materiale iniettato nel tuorlo non sarà trasferito nel citoplasma. Liquidi iniettati avere una delimitazione distinta quando iniettato nel tuorlo, mentre il confine è sfocata, quando nel citoplasma (Figura 4). Occasionalmente l'ago potrebbe diventare bloccato da agarosio / detriti. Pinze possono essere utilizzate per toccare / rebreak fine dell'ago e rimuovere il blocco. Se l'ago break in qualsiasi momento durante l'iniezione, spumeggiante si vedrà nel medio embrione e la sostanza si inietta andranno persi. Le iniezioni devono essere praticate sistematicamente dall'alto verso il basso lungo i canali di agarosio e da sinistra a destra attraverso lo stampo. </li><li> Embrioni iniettati dovrebbero essere trasferiti in un piatto pulito contenente medio embrione e sviluppato a temperatura adeguata. <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Rompere la punta dell'ago prima dell'iniezione. 1: Spostare punta dell'ago vicino al corion dell'embrione; 2: Toccare il corion e spostare l'ago avanti e indietro con delicatezza per rompere punta; 3: quando una piccola quantità di sostanza iniezione esce alla fine dell'ago ciò conferma la rottura della punta. </li></ol> 5. Rappresentante risultati <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Immagini rappresentative di embrioni iniettati Medaka. Un pannello mostra un'immagine rappresentativa di iniezione corretta rodamina-destrano nel citoplasma di un embrione stadio unicellulare Medaka. Pannello B mostra un'immagine rappresentativa di iniezione errata di rodamina-destrano nel sacco vitellino di un embrione stadio unicellulare Medaka. Pannelli C e D mostrano gli embrioni da pannelli A e B rispettivamente di circa 30 ore dopo l'iniezione. EM: embrione, è anteriore verso l'alto in pannelli C e D e di vista è dorsale. Si noti il ​​corpo dell'embrione nel pannello D non è rosso come il colorante è stato erroneamente iniettato nel sacco vitellino. Frecce in B e D indicano rodamina-destrano iniettata in modo non corretto nel sacco vitellino nota il confine distinte circolari. Linee tratteggiate in A e B indicano sagoma di citoplasma di una cellula, vista laterale.

<ol><li>Furutani-Seiki, M., Sasado, T., Morinaga, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+genome-wide+screen+for+mutations+affecting+organogenesis+in+Medaka%2C+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">A systematic genome-wide screen for mutations affecting organogenesis in Medaka, Oryzias latipes.</a> Mech Dev. 121, 647-658 (2004).</li>
<li>Furutani-Seiki, M., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medaka+and+zebrafish%2C+an+evolutionary+twin+study%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Medaka and zebrafish, an evolutionary twin study.</a> Mech. Dev. 121, 629-6237 (2004).</li>
</ol>

In questo video, si dimostra un metodo per tracciante cellulare, mRNA, DNA o anti-senso iniezione oligonucleotide in una cella di embrioni fase Medaka. Questa tecnica ci ha permesso di studiare vari processi di sviluppo in-vivo in tempo reale. Questo processo e la successiva analisi dettagliata che offre ha il potenziale per migliorare significativamente la nostra comprensione della organogenesi vertebrati e la biologia delle cellule sottostanti. Tale conoscenza può essere importante per, e la resa applicazioni terapeutiche nel campo della medicina rigenerativa.

<table><tbody><tr><td>4&quot; rete fine</td><td>Strumenti</td><td>J K Aquatics Ltd.</td><td>MD001</td><td>Utilizzata per catturare i pesci durante il prelievo delle uova.</td></tr><tr><td>Mezzo per embrioni</td><td>Reagente</td><td>Fatto in casa</td><td></td><td>200 ml di soluzione madre 50X, 1 ml di blu di metilene all'1% in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O/10 litri di acqua RO (soluzione madre 50X: NaCl 14,7 g, KCl 0,6 g, CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 2,4 g, MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 4,0 g/1 litro di acqua RO).</td></tr><tr><td>Carta vetrata impermeabile fine - grana p2000</td><td>Strumenti</td><td>Hermes Abrasives Ltd.</td><td></td><td>Grana estremamente fine per rotolare/pulire gli embrioni con corione.</td></tr><tr><td>Capillari in vetro borosilicato</td><td>Strumento</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC100-10F</td><td>Per la fabbricazione di aghi per microiniezione.</td></tr><tr><td>Tiratore di micropipette</td><td>Attrezzatura</td><td>Narishige International</td><td>Modello PP-830</td><td>Per la fabbricazione di aghi per microiniezione.</td></tr><tr><td>Microloader Eppendorf</td><td>Strumento</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td>Per il caricamento degli aghi per microiniezione.</td></tr><tr><td>Apparato di microiniezione</td><td>Attrezzatura</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Modello 5242.</td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Attrezzatura</td><td>Narishige International</td><td></td><td>Modello MN151.</td></tr><tr><td>Piastra per iniezione in agarosio</td><td>Strumenti</td><td>Fatta in casa</td><td></td><td>Per il fissaggio degli embrioni durante l'iniezione.</td></tr></tbody></table>

microiniezione di embrioni medaka per essere utilizzato come organismo modello genetico

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In questo video, dimostriamo la tecnica della microiniezione in una cella di embrioni fase Medaka. Medaka è un piccolo deposizione delle uova di pesce d&#39;acqua dolce che permette le analisi genetiche ed embriologica ed è uno degli organismi modello vertebrato, in cui sono state effettuate genome-wide schermi mutante fenotipo-scacciati 1, come nel pesce zebra e il mouse. Divergenza di sovrapposizione funzionale di geni correlati tra Medaka zebrafish e consente l&#39;identificazione di fenotipi romanzo che sono identificabili in una singola specie 2, così Medaka e zebrafish sono complementari per la dissezione genetica delle funzioni del genoma dei vertebrati. Per usufruire di pesce Medaka cui gli embrioni sono trasparenti e sviluppano esternamente, microiniezione è una tecnica essenziale per iniettare cellule traccianti per le cellule etichettatura, mRNA o anti-senso oligonucleotidi per eccesso di esprimere e bussare a tendina geni di interesse, e di DNA per fare linee transgeniche.

Medaka e zebrafish sono complementari per la dissezione genetica delle funzioni del genoma dei vertebrati. Questo protocollo mette in evidenza i punti chiave per il successo microiniezione in embrioni Medaka, una tecnica importante per l&#39;analisi embriologiche e genetiche utilizzando Medaka zebrafish e in un laboratorio.

Microiniezione di embrioni Medaka per essere utilizzato come organismo modello genetico

In questo video, dimostriamo la tecnica di microiniezione in embrioni di medaka allo stadio di una cellula. Il medaka è un piccolo pesce d'acqua dolce ovíparo che permette...

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare la funzione genica o proteica interrompendo i normali schemi di espressione del gene o della proteina di interesse. Questo viene ottenuto innanzitutto preparando lo stampo in aros e gli aghi per iniezione. Il secondo passaggio della procedura consiste nel raccogliere embrioni medi allo stadio di una singola cellula.Il terzo passaggio della procedura consiste nell'orientare gli embrioni allo stadio ad una cellula nella posizione corretta per l'iniezione. L'ultimo passaggio della procedura prevede l'iniezione di traccianti cellulari, mRNA o oligonucleotidi antisenso negli embrioni midar allo stadio ad una cellula. Alla fine, i risultati possono essere ottenuti mediante osservazione al microscopio, che evidenzia cambiamenti morfologici, fisiologici o molecolari associati alla proteina influenzata dalla sostanza iniettata.Ciao, sono Sean Brazinski del laboratorio del Dottor Makoto Fki del Dipartimento di Biologia e Biochimica dell'Università di Bath. Sono affiliato anche al laboratorio Seki completo. Oggi vi mostreremo un procedimento per la microiniezione di embrioni di Meca con traccianti cellulari, mRNA e oligonucleotidi antisenso.Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare la funzione di un gene di interesse in vivo a livello di singola cellula. Cominciamo dunque. A differenza del pesce zebra, maschi e femmine di maka possono essere facilmente distinti in base alle loro pinne dimorfiche.Le pinne femminili hanno una forma arrotondata con un margine liscio. Sia la pinna anale che quella dorsale del maschio sono più grandi rispetto a quelle della femmina, e la pinna dorsale presenta un'incisione profonda tra gli ultimi due raggi. Mantenere una coppia riproduttiva di meca in un acquario di accoppiamento con o senza flusso d'acqua.Questo P può essere mantenuto nel serbatoio con acqua corrente per un massimo di due mesi. Per l'iniezione giornaliera, la femmina depone fino a 40 uova al giorno, che si raggruppano nell'addome grazie a filamenti di attacco. Utilizzare una rete per catturare e rimuovere una femmina dal serbatoio e trattenere il pesce con una mano per fissarlo all'interno della rete. Staccare delicatamente le uova con il dito indice.Riportare la femmina nel serbatoio. Utilizzare pinzette o un dito indice per trasferire le uova in una piastra di Petri da sei centimetri riempita con mezzo per embrioni. Sotto un microscopio stereoscopico, utilizzare due paia di pinzette per tagliare i filamenti di attaccamento e separare le uova.Prelevare gli embrioni con una pipetta per pasta per separarli da feci e alghe e trasferire un massimo di 40 uova in una piastra con mezzo embrionale fresco. Porre le uova sul ghiaccio se si intende microiniettare immediatamente. In alternativa, regolare la velocità di sviluppo verso stadi successivi variando la temperatura di incubazione.È necessario un modello in plexiglass per preparare le piastre in agarosio per il posizionamento degli embrioni durante l'iniezione. Per ulteriori dettagli, consultare la parte scritta del presente protocollo. Versare 0,5 centimetri di agarosio all'1,5% in acqua in una capsula di Petri da nove centimetri.Quando l'aase si è solidificato, ritagliare un'area leggermente più piccola rispetto allo stampo in modo che lo stampo non affondi sul fondo. Costruire l'area ritagliata con ulteriore aase al 1,5% e posizionare lo stampo in plexiglass sopra di essa. Evitare di introdurre bolle d'aria quando l'Aris si è solidificato.Rilasciare in genere lo stampo per creare delle scanalature. Coprire l'Aris con mezzo embrionale. Coprire la piastra e conservare a quattro gradi Celsius fino al momento dell'uso.Preparare un ago per iniezione largo e robusto a partire da un capillare di vetro contenente un filamento. Utilizzare un microcaricatore per riempire dal retro l'ago per iniezione con la soluzione di iniezione, inclusa la fenolo rosso come tracciante; collegare quindi l'ago a un supporto per iniettore con pompa ad aria. Posizionare il tutto accanto a un microscopio stereoscopico.Trasferire le uova dello stadio appropriato sulla piastra di iniezione con agarosio. Gli embrioni possono essere mantenuti sul ghiaccio per un massimo di 30 minuti per arrestare lo sviluppo durante l'esecuzione dell'iniezione sotto il microscopio stereoscopico. Utilizzare pinzette per allineare da sette a dieci uova in ogni solco.Ruotare le uova in modo che l'ago di iniezione colpisca le uova perpendicolarmente. La singola cellula dell'embrione si trova opposta alle goccioline di dent selciato. Pertanto, la gocciolina d'olio deve essere orientata verso sinistra, in modo che la singola cellula si trovi a destra per l'iniezione.Nelle meca, gli acidi nucleici e i coloranti traccianti vengono microiniettati attraverso la coriona direttamente nel citoplasma dell'embrione, piuttosto che nel tuorlo. Come nel caso del pesce zebra, avvicinare l'ago alle uova. Appoggiare la punta dell'ago sulla coriona oppure utilizzare pinzette microchirurgiche per rompere leggermente la punta dell'ago, in modo che una piccola quantità della soluzione iniettabile fuoriesca dall'estremità.Rompere nuovamente l'ago in caso di ostruzione, perforare il Corian e spostare la punta dell'ago di iniezione appena all'interno dello strato interno per ridurre la probabilità di reflusso nell'ago. Regolare la pressione di mantenimento dell'iniettore a circa 80-100 hectopascal in modo preciso. Pungere la membrana e inserire l'ago nel citoplasma.Iniettare l'embrione. Osservare l'embrione lateralmente per confermare la distribuzione uniforme del materiale iniettato all'interno del citoplasma. I liquidi correttamente iniettati nel citoplasma presentano un contorno sfumato; il materiale iniettato troppo in profondità nel tuorlo ha un contorno distinto e non verrà trasferito nel citoplasma.Trasferire gli embrioni iniettati in una piastra pulita contenente mezzo per embrioni e lasciarli sviluppare secondo le necessità in un incubatore a temperatura adatta. Il pannello A mostra un'immagine rappresentativa dell'iniezione corretta di rumine dextran nel citoplasma di un embrione Meca allo stadio monocellulare. Il pannello B mostra un'immagine rappresentativa dell'iniezione errata di rumine dex str nel sacco vitellino di un embrione Meca allo stadio monocellulare. Le linee tratteggiate indicano il contorno del citoplasma della singola cellula.I pannelli C e D mostrano gli embrioni dei pannelli A e B rispettivamente a circa 30 ore dopo l'iniezione. Si noti che il corpo dell'embrione nel pannello D non è rosso poiché il colorante è stato iniettato erroneamente nel sacco vitellino. Vi abbiamo appena mostrato come eseguire l'iniezione microscopica di acidi nucleici o traccianti nello stadio a una sola cellula degli embrioni più scuri.Quando si esegue questa procedura, è importante disporre di un embrione correttamente stadiato per un'iniezione di successo. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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