La zona subventricolare En-face: colorazione Wholemount e flusso ependimale

Ciao, sono Zaman. Sono Arturo Alvarez Bia. Oggi siamo nel laboratorio di Arturo, parte del Dipartimento di Neurochirurgia e del Centro Eli Edith Broad per la Medicina Rigenerativa e la Ricerca sulle Cellule Staminali, e vi mostreremo come prepariamo i preparati in toto delle pareti dei ventricoli laterali.

Questi preparati interi possono essere utilizzati fissati per la colorazione immunoistochimica oppure come preparati vitali per analizzare il flusso penale. La tecnica del preparato intero che Mann illustrerà oggi è stata sviluppata nel corso degli anni in laboratorio e perfezionata per lo studio dell'intera parete dei ventricoli laterali, inclusi le cellule penali e l'attività germinale sottostante nella zona subventricolare, dove si trovano le cellule staminali neurali. Tale tecnica fu inizialmente sviluppata da Fiona Dutch e successivamente perfezionata da HIE Victor e Casu Moto.

Tutti loro non sono più in laboratorio. I seguenti diagrammi illustrano come preparare un preparato in toto della parete laterale del ventricolo laterale. Il cervello viene innanzitutto diviso in due emisferi.

Un taglio coronale viene effettuato posteriormente per evidenziare l'ippocampo, la cui sezione trasversale è mostrata qui in viola. La parete mediale, che ricopre l'ippocampo ed è mostrata in viola, viene quindi staccata dalla parete laterale, che ricopre il lobo amigdaloide e viene mostrata in rosa. Le due pareti verranno allargate l'una rispetto all'altra come nell'apertura di un libro, e la parete mediale verrà rimossa lasciando esposta la parete laterale.

La prima sezione di questo video illustra la dissezione in toto, ma questo potrebbe non essere il primo passaggio. Cronologicamente, se si prevede di analizzare un flusso penale, si prega di fare riferimento al protocollo scritto per i dettagli. Prima di ogni dissezione, assicurarsi che tutti gli strumenti siano sterili e a portata di mano. Posizionare una piastra di dissezione da sei centimetri contenente mezzo L 15 Leitz a 37 gradi Celsius sotto un microscopio stereoscopico a fluorescenza, quindi collocare un cervello di topo appena dissezionato nella piastra sotto il microscopio stereoscopico.

Utilizzare pinzette fini per dissezionare i bulbi olfattivi. Usare un coltello da dissezione per dividere il cervello nei suoi due emisferi. Tagliare in senso coronale all'estremità posteriore di un emisfero.

Per esporre l'ippocampo cordale e la sezione trasversale, inserire il coltello da dissezione nel piccolo spazio ventricolare tra la corteccia e l'ippocampo e tagliare per staccare la corteccia nel punto in cui si collega dorsalmente all'ippocampo. Rimuovere una porzione a cuneo di corteccia all'angolo e utilizzare pinzette fini per staccarla lentamente dall'ippocampo. Continuare a staccare la corteccia man mano che si avvolge fino al margine ventrale dell'ippocampo.

Utilizzare un coltello a punta per staccare l'ippocampo dalle parti ventrali della corteccia. Usare il coltello e pinzette fini per allontanare l'ippocampo dalla corteccia. Procedere con attenzione in direzione anteriore senza danneggiare le pareti dei ventricoli.

Le due pareti dovrebbero aprirsi in direzioni opposte. Come un libro con un coltello, rimuovere le parti della corteccia che sporgono oltre la parete laterale. Per visualizzare meglio questa superficie man mano che la resistenza alla retrazione aumenta, sarà necessario effettuare due tagli aggiuntivi.

Un taglio dorsale in corrispondenza del punto in cui si incontrano la parete mediale e quella laterale, e un taglio simile in posizione ventrale. Utilizzare piccoli movimenti del bisturi per eseguire questi tagli. Questi tagli aggiuntivi permettono una maggiore retrazione della parete mediale, rivelando così l'antere della ventricolo.

Regolare l'illuminazione in modo che le ombre evidenzino il giunto tra le pareti mediale e laterale, come un solco tra le due pareti. Utilizzare il coltello per tagliare esattamente lungo il solco, rimuovendo il talamo e qualsiasi corteccia sovrastante.

Il montaggio forato deve essere utilizzato immediatamente per un'analisi del flusso di penalizzazione. Se si esegue la dissezione dei montaggi forati per la colorazione immunoistochimica, è possibile dissezionare più montaggi in una sola seduta, a condizione che vengano immersi nel fissativo non appena completati. La sezione successiva del video illustrerà come eseguire saggi sul flusso di fluido generato dalle ciglia delle cellule ependimali.

Utilizzo di microsfere fluorescenti. Il foro della parete laterale appena dissezionato viene inizialmente fissato alla piastra di dissezione con due spilli per insetti. La punta di una micropipetta di vetro riempita con microsfere fluorescenti viene quindi abbassata sulla superficie del preparato intero, e le microsfere fluorescenti vengono delicatamente depositate sulla superficie durante l'acquisizione di immagini in time-lapse.

Il video registra il movimento delle perle per il saggio di flusso appendicolare. Una pipetta microscopica di vetro deve essere preparata prima della dissezione in preparato intero, come descritto nella parte scritta di questo protocollo. La pipetta finita deve presentare un restringimento liscio e graduale e una smussatura di 45 gradi con un diametro interno di circa 100 micrometri.

Riempire per capillarità la pipetta con olio minerale fino a circa metà. Inserire un pistone ricoperto di grasso da vuoto nella parte posteriore della pipetta. Quindi spingerlo in avanti per far avanzare il menisco dell'olio fino alla punta della pipetta.

Fissare la pipetta con il pistone a un micromanipolatore montato su un braccio regolabile. Caricare anteriormente la pipetta con una soluzione contenente il 50% di microsfere fluorescenti, il 5% di glicerolo e il 45% di acqua. Dissezionare frescamente un preparato con foro come mostrato in precedenza e trasferirlo, con il lato del ventricolo rivolto verso l'alto, in una capsula di Petri pulita riempita con acqua a 37 gradi Celsius.

Con mezzo Leitz, fissare il supporto forato alla piastra per dissezione utilizzando due puntine da insetto nel talamo e nella corteccia dorsale anteriore. Posizionare la base del braccio fisso che sostiene il micromanipolatore vicino al microscopio stereoscopico, mantenendo il braccio sollevato per evitare di rompere l'ago della micropipetta. Immergere la punta della micropipetta in un tubo contenente del mezzo per rimuovere le microperle presenti sulla superficie esterna della punta.

Avendo cura di non rompere la punta. Posizionare la punta delle pipette sulla superficie dorsale della parete laterale e abbassare il braccio per portare la punta della pipetta appena sopra la superficie del tessuto. Concentrarsi su un campo visivo che comprenda la metà anteriore del preparato, e iniziare a registrare le immagini desiderate.

Utilizzare lo stantuffo per espellere circa cinque litri di microperline sulla superficie del supporto forato. Una volta che il flusso di rifiuto ha rimosso la prima somministrazione di perline dalla superficie, utilizzare lo stantuffo per espellere ulteriori quantitativi di cinque nanolitri di microperline. Il flusso, la direzione e la velocità possono essere analizzati mediante il video registrato.

L'ultima sezione di questo video illustra come gli innesti circolari vengano immunoistocolorati e montati su vetrini per l'analisi confocale. Gli innesti circolari appena dissecati vengono inizialmente trasferiti in una piastra a 24 pozzetti e fissati per immersione in paraformaldeide. Segue una serie di incubazioni con anticorpi primari e successivamente con anticorpi secondari coniugati a fluorocromi, intervallate da lavaggi.

Dopo la colorazione, i preparati interi vengono sottoposti a dissezione per separare unicamente lo strato sottile della parete laterale contenente la zona subventricolare dal resto del preparato che comprende lo strato st e la corteccia sottostanti. Questo sottile frammento piatto di tessuto viene quindi trasferito su un vetrino e coperto con un coverslip per fissare i preparati destinati all'immunocolorazione. Una piastra a 24 pozzetti contenente paraformaldeide al 4% e Triton X-100 allo 0,1% su ghiaccio.

In una cappa chimica, immergere delicatamente un preparato con il ventricolo rivolto verso l'alto in una pozzetta della piastra. Fissare il campione tutta la notte a quattro gradi Celsius, aspirare il fissativo ed utilizzare una pipetta di trasferimento per lavare con attenzione il preparato in una XPBS con 0,1% di Triton X-100 per 3 volte, per cinque minuti ciascuna. In tutti i passaggi di manipolazione dei liquidi, pipettare delicatamente lungo il bordo della pozzetta per evitare di rovesciare il preparato e danneggiare il tessuto.

Aggiungere una soluzione di blocco contenente Triton X e siero di capra normale al 10% in 1x PBS, utilizzando fino al 2% di Triton X a seconda della profondità di penetrazione dell'anticorpo richiesta. Incubare il preparato intero nella soluzione di blocco per un'ora. A temperatura ambiente, rimuovere la soluzione di blocco.

Aggiungere gli anticorpi primari diluiti nella soluzione di blocco e incubare a quattro gradi Celsius per 24 o 48 ore, a seconda dell'antigene bersaglio. Lavare con due risciacqui rapidi di 1x PBS con Triton X, seguiti da tre lavaggi di 20 minuti ciascuno a temperatura ambiente. Aggiungere gli anticorpi secondari diluiti nella soluzione di blocco e incubare a quattro gradi Celsius per lo stesso periodo di tempo previsto per l'anticorpo primario, quindi lavare nello stesso modo utilizzato per gli anticorpi primari. La serie successiva di passaggi illustra come dissezionare soltanto la parete laterale dal resto del preparato in toto, ottenendo un singolo campione piatto, che potrà poi essere montato per l'analisi con imaging ad alta risoluzione.

Riportare il preparato con il foro per l'immunomarcatura, con la superficie ventricolare rivolta verso l'alto, in una piastra per dissezione pulita contenente un volume di XPBS sotto il microscopio stereoscopico, spostandosi da posteriori ad anteriori. Utilizzare un coltello da dissezione per rimuovere la corteccia dorsale e il corpo calloso bianco sottostante, al fine di visualizzare l'interfaccia tra la zona subventricolare e lo striato. Successivamente, effettuare un lungo taglio orizzontale lungo l'aspetto ventrale dell'intero preparato.

Utilizzare pinzette fini per orientare il tessuto su questo nuovo margine piano in modo che la superficie dorsale sia rivolta verso l'alto. La zona subventricolare è una sottile banda di tessuto omogeneamente rosa, mentre lo striato è infiltrato da cordoni di sostanza bianca. Utilizzare le pinzette come due perni nello stri AUM per ancorare il tessuto senza danneggiare la parete ventricolare.

Iniziare anteriormente. Utilizzare il coltello da dissezione per iniziare con attenzione a tagliare tra il corpo striato e la zona subventricolare. È importante mantenere i tagli paralleli alla superficie ventricolare e conservare lo spessore del tessuto dissezionato.

Man mano che la zona subventricolare si assottiglia in direzione posteriore, rimuovere con attenzione tutti i tessuti circostanti dai preparati a membrana che non fanno parte della parete ventricolare. Il preparato a membrana deve avere uno spessore uniforme compreso tra 200 e 300 micrometri.

Usare una pinzetta per sollevare la sottile striscia di tessuto dal basso e trasferirla su un vetrino da microscopio. Applicare un mezzo di montaggio, quindi un coprioggetto. Evitare di introdurre bolle d'aria.

Conservare i vetrini in posizione orizzontale in un portavetrini a quattro gradi Celsius per uno o due giorni, in modo da permettere alle lamelle di assestarsi prima dell'acquisizione delle immagini dei campioni. Di seguito sono riportati alcuni risultati rappresentativi di immunomarcature su preparati interi e saggi di appendice in flusso. La prima immagine è una vista a basso ingrandimento di una marcatura su preparato intero per la doppia cottina, un marcatore dei neuroblasti che evidenzia la rete di catene di giovani neuroni in migrazione nella zona subventricolare adulta.

Di seguito è riportata un'altra vista a basso ingrandimento di un preparato con montaggio su foro, colorato per KI67 in verde e per i vasi sanguigni in rosso, che illustra a ingrandimento maggiore l'interazione ravvicinata, recentemente descritta, tra cellule in divisione e il sistema vascolare nella zona subventricolare. L'immagine successiva mostra un'immagine confocale della superficie ventricolare, con la superficie apicale delle cellule che rivestono il ventricolo delineata dalla colorazione in verde per la beta-catenina e i corpi basali di queste cellule marcati in rosso per la gamma-tubulina. L'ultima immagine ad alto ingrandimento è una proiezione massima di uno stack confocale ottenuto da un preparato intero colorato per GFAP, che mostra la lunga fibra basale positiva per GFAP delle cellule di tipo B1 della SVZ, utilizzata per analizzare flusso, direzione e velocità del liquido cerebrospinale sulla superficie ventricolare.

Frame consecutivi provenienti da filmati del flusso degli apicoplasti possono essere uniti in un'unica immagine composita. Queste immagini composite mostrano la posizione di singole perle in diversi momenti temporali mentre attraversano l'apicoplasto o la superficie. Ecco un esempio dell'aspetto dei risultati quando completi.

È stato appena illustrato come preparare preparati in toto dalla zona subventricolare della parete laterale del ventricolo laterale. Questo metodo fornisce una visione d'insieme dell'intera parete ed ha permesso numerose scoperte nel corso degli anni, tra cui l'osservazione che questa zona ventricolare è organizzata come una rete di percorsi per la migrazione a catena. Ha inoltre consentito di studiare come il flusso del liquido cerebrospinale scorra su questa parete, suggerendo indirettamente anche i meccanismi con cui queste cellule guidano la propria migrazione attraverso questa vastissima rete di percorsi.

Più recentemente, questa tecnica ci ha permesso di scoprire che la zona ventricolare subordinata è organizzata a forma di mulinelli, con le cellule staminali al centro di questi mulinelli, rivelando la fine ottica delle cellule staminali all'interno di questa struttura. Poiché il preparato intero consente una visione d'insieme di questa zona ventricolare, fornisce una prospettiva che le sezioni non possono offrire, e per questo motivo lo rendiamo disponibile a tutti, in quanto dovrebbe risultare utile per molti altri studi. Esistono alcuni punti chiave da ricordare durante la preparazione dei preparati interi che miglioreranno le vostre dissezioni.

Il primo consiste nell'usare un'illuminazione adeguata, regolando la luce in modo da proiettare ombre sul supporto del foro. Questo fornirà contrasto e indicherà dove effettuare i tagli. Il secondo consiste nell'utilizzare la pinzetta come due perni mobili.

Non si desidera utilizzare la pinzetta per comprimere o sollevare il tessuto. Piuttosto, usatela come due perni mobili che fissino il tessuto mentre si effettua il taglio. Il terzo metodo consiste nell'utilizzare una combinazione di retrazione generale e taglio.

Come si può notare nelle dissezioni, viene effettuato effettivamente molto poco taglio del tessuto. La maggior parte della dissezione avviene mediante una semplice retrazione durante il secondo passaggio della dissezione, quando si rimuove la parete laterale dal resto del preparato intero.

La cosa più importante è orientare i tagli in un piano parallelo al piano della superficie ventricolare. Questo garantisce uno spessore uniforme da anteriore a posteriore lungo la parete laterale. Inoltre, assicura che, durante l'acquisizione confocale ad alta risoluzione, tutte le immagini risultino a fuoco in un singolo piano.

Speriamo che questo video sia utile per i vostri studi. In bocca al lupo per i vostri esperimenti.