Name: Live-cell imaging e analisi quantitativa della embrionali in cellule epiteliali Xenopus laevis /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Impara le tecniche di imaging in vivo e analisi quantitativa della morfologia cellulare in epiteli embrionali di Xenopus laevis. Questo metodo utilizza microscopia confocale per studiare la dinamica cellulare.

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Questo lavoro è stato supportato da una National Institutes of Health (R01-HD044750), una borsa di studio dalla National Science Foundation, e il supporto della American Heart Association (inizio Grant-in-Aid). Gli autori ringraziano i membri Davidson Lab: HY Kim, M. von Dassow e J. Zhou (per un aiuto con responsabilità di laboratorio tutti i giorni), e Lin Zhang per la sua assistenza nel campo della biologia molecolare e la sintesi di mRNA. Noi riconosciamo gli sforzi sperimentali da tutti i laboratori rana (soprattutto Ray Keller e Doug DeSimone) che hanno contribuito ad una parte di questo protocollo, attraverso lo sviluppo e metodi di prova diversi nel corso degli anni. Ringraziamo Richard Harland e John Wallingford per i loro doni tipo di mem-GFP e moesina-GFP plasmidi rispettivamente.

<ol><li>Ninomiya, H., Winklbauer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+coating+controls+mesenchymal+shape+change+through+tissue-positioning+effects+and+reduction+of+surface-minimizing+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Epithelial coating controls mesenchymal shape change through tissue-positioning effects and reduction of surface-minimizing tension.</a> Nat Cell Biol. 10 (1), 61-61 (2008).</li>
<li>Kay, B. K., Peng, H. B. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. , Academic Press. New York. (1991).</li>
<li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+eggs+from+Xenopus+laevis+females%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Obtaining eggs from Xenopus laevis females.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Cohen, S., Au, S., Pante, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Xenopus+laevis+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Xenopus laevis oocytes.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Tables of Xenopus laevis (Daudin). , Elsevier North-Holland Biomedical Press. Amsterdam. (1967).</li>
<li>Davidson, L. A., Ezin, A. M., Keller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+wound+healing+by+apical+contraction+and+ingression+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Embryonic wound healing by apical contraction and ingression in Xenopus laevis.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 53 (3), 163-163 (2002).</li>
<li>Joshi, S. D., Dassow, M. von, Davidson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+control+of+excitable+embryonic+tissues%3A+three+stimuli+induce+rapid+epithelial+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Experimental control of excitable embryonic tissues: three stimuli induce rapid epithelial contraction.</a> Exp Cell Res. 316 (1), 103-103 (2010).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo presentato protocolli sperimentali usati regolarmente nel nostro laboratorio di citoscheletro immagine che cambiano dinamicamente nella corteccia cellula apicale e oscillante membrane cellulari delle cellule epiteliali in embrioni di Xenopus. Si dovrebbe utilizzare questi protocolli come punto di partenza per il live-imaging delle forme delle cellule epiteliali, ottimizzazione di questo protocollo è essenziale e alcune delle impostazioni cambia a seconda del tipo di sistema microscopio si ha e il tipo d...

live-cell imaging e analisi quantitativa della embrionali in cellule epiteliali xenopus laevis</em

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embrionale cellule epiteliali servire come un modello ideale per studiare la morfogenesi in cui multicellulari tessuti subiscono cambiamenti nella loro geometria, quali i cambiamenti nella zona delle cellule di superficie e altezza della cella, e dove le cellule subiscono mitosi e migrano. Inoltre, le cellule epiteliali possono anche regolare i movimenti morfogenetici nei tessuti adiacenti<sup&gt; 1</sup&gt;. Un metodo tradizionale per lo studio delle cellule epiteliali e dei tessuti coinvolgere fissaggio chimico e metodi istologici per determinare la morfologia cellulare o la localizzazione di proteine ​​di particolare interesse. Questi approcci continuano ad essere utili e fornire &quot;istantanee&quot; di forme e l&#39;architettura delle cellule dei tessuti, tuttavia, resta ancora molto da capire su come le cellule acquisiscono forme specifiche, come le proteine ​​varie spostare o localizzare in posizioni specifiche, e ciò che le cellule seguono percorsi verso la loro definitiva destino differenziato. Ad alta risoluzione di immagini dal vivo integra i metodi tradizionali e consente anche un&#39;indagine più diretto nei processi dinamici cellulari coinvolti nella formazione, manutenzione, e morfogenesi dei pluricellulari fogli epiteliali. Qui mostriamo metodi sperimentali dall&#39;isolamento dei tessuti animali da tappo<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embrioni per l&#39;imaging confocale di cellule epiteliali e gli approcci di misurazione semplice, che insieme possono aumentare gli studi molecolari e cellulari della morfogenesi epiteliale.

Xenopus embrionale epiteli sono un sistema modello ideale per studiare i comportamenti delle cellule, come lo sviluppo di polarità e cambiare forma durante la morfogenesi epiteliale. Istologia tradizionale di campioni fisso è sempre più integrato da live-cell imaging confocale. Qui mostriamo metodi per isolare i tessuti rana e visualizzare dal vivo le cellule epiteliali e le loro citoscheletro con live-cell microscopia confocale.

Live-cell imaging e analisi quantitativa della embrionali in cellule epiteliali Xenopus laevis</em

Le cellule epiteliali embrionali rappresentano un modello ideale per studiare la morfogenesi, processo in cui i tessuti multicellulari subiscono cambiamenti della propria geometria, come variazioni...

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare tecniche di imaging in tempo reale e metodi semplici di quantificazione per analizzare la morfologia delle cellule epiteliali embrionali. Questo viene raggiunto innanzitutto predisponendo tutti gli strumenti e l'apparecchiatura necessari. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'asportare l'esplan X da embrioni di rana e coltivarli in camere per una coltura a lungo termine.Il terzo passaggio della procedura consiste nel raccogliere immagini ad alta risoluzione di cellule epiteliali in tempo reale. L'ultimo passaggio della procedura è quantificare i dettagli morfologici delle cellule epiteliali utilizzando ImageJ. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano le aree cellulari tracciate e le intensità della membrana mediante microscopia confocale ad alta risoluzione. Ciao, sono Sagar Joshi del Davidson Laboratory del Dipartimento di Bioingegneria dell'Università di Pittsburgh.Oggi vi mostreremo un procedimento per l'immagineggiatura di cellule vive e l'analisi quantitativa delle cellule epiteliali embrionali di Xenos lavia. Utilizziamo questo procedimento per studiare in tempo reale i cambiamenti del citosch

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Utilizzando punta fine micropipette iniettiamo DNA plasmidico in sottodomini di somiti pollo o tubi neurali. La concentrazione del plasmide è regolata per generare solo cellule transfettate. Abbiamo poi permettere alle cellule di trasformarsi in popolazioni clonale.

Cella Transfection singola in embrioni di pollo

Imaging del tessuto embrionale in real-time è una sfida per lunghi periodi di tempo. Qui vi presentiamo un test per monitorare i cambiamenti cellulari e sub-cellulare del midollo spinale pulcino per lunghi periodi con elevata risoluzione spaziale e temporale. Questa tecnica può essere adattato ad altre regioni del sistema nervoso e sviluppo embrionale.

Imaging ad alta risoluzione dal vivo del comportamento delle cellule in via di sviluppo neuroepitelio

Xenopus laevis fornisce un sistema modello ideale per studiare il destino specificazione delle cellule e la funzione fisiologica delle singole cellule retiniche in colture cellulari primarie. Presentiamo qui una tecnica per la dissezione e la generazione di tessuti retinici colture cellulari primarie che vengono esposte ad attività calcio e analizzati mediante ibridazione in situ.

Dissezione, Cultura, e analisi di<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tessuto embrionale della retina

Qui sviluppiamo gli strumenti necessari...

Ex vivo Imaging in diretta di divisioni cellulari singoli in mouse neuroepitelio

Il manoscritto qui fornisce un semplice insieme di metodi per analizzare la secrezione e la diffusione di fluorescenza ligandi marcati nel Xenopus. Ciò fornisce un contesto per valutare la capacità di altre proteine ​​di modificare la distribuzione ligando e permettendo esperimenti che possono dare comprensione dei meccanismi che regolano gradienti morphogen.

Utilizzando Analisi confocale di<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Per Indagare modulatori di Wnt e Shh morphogen gradienti

Questo protocollo dimostra un metodo basato su fluorescenza per visualizzare la vascolarizzazione e per quantificare la sua complessità in Xenopus tropicalis . I vasi sanguigni possono essere immagazzinati minuti dopo l'iniezione di un colorante fluorescente nel cuore battente di un embrione dopo manipolazioni genetiche e / o farmacologiche per studiare lo sviluppo cardiovascolare in vivo .

Visualizzazione e analisi quantitativa di angiogenesi embrionale in<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Descriviamo i passaggi che permettono il campionamento veloce in situ di una piccola parte di una singola cella con alta precisione e l'invasione minima utilizzando micro-campionamento basato sul capillare, per facilitare la caratterizzazione chimica di uno snapshot di attività metabolica in vivere gli embrioni utilizzando una piattaforma di spettrometria di massa e di elettroforesi capillare su misura singola cella.

Spettrometria di massa di elettroforesi capillare di microsonda per cella singola metabolomica in embrioni di rana Live (Xenopus laevis)

Vi presentiamo un protocollo in due parti che combina l'imaging fluorescente del calcio con l'ibridazione in situ, permettendo allo sperimentatore di correlare i modelli di attività del calcio con i profili di espressione genica a livello unicellulare.

Imaging fluorescente del calcio e successiva ibridazione in situ per la caratterizzazione neuronale del precursore in Xenopus laevis

Descriviamo un semplice protocollo per sviluppare organoidi epiteliali mucociliari da cellule ectodermi profonde isolate dagli embrioni xenopus laevis. I progenitori multipotenti rigenerano i precursori delle cellule del calice epiteliale e permettono il tracciamento vivo dell'iniziazione e della progressione delle transizioni cellulari sulla superficie degli organoidi.

Organoidi epiteliali mucociliari di cellule embrionali xenopus: generazione, coltura e imaging dal vivo ad alta risoluzione

Descriviamo un metodo per la preparazione e l'imaging dal vivo di estratti citoplasmatici non diluiti da uova di Xenopus laevis .

Xenopus laevis Preparazione dell'estratto di uova e metodi di imaging dal vivo per la visualizzazione dell'organizzazione citoplasmatica dinamica

Qui descriviamo una caratterizzazione proteomica basata sulla spettrometria di massa di linee cellulari con destini tissutali noti nell'embrione vertebrato di Xenopus laevis .

Proteomica della spettrometria di massa guidata da livrea cellulare nell'embrione in via di sviluppo (rana)

Impara le tecniche di imaging in vivo e analisi quantitativa della morfologia cellulare in epiteli embrionali di Xenopus laevis. Questo metodo utilizza microscopia confocale per studiare la dinamica cellulare.

Live-cell imaging e analisi quantitativa della embrionali in cellule epiteliali Xenopus laevis

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