Live-cell imaging e analisi quantitativa della embrionali in cellule epiteliali Xenopus laevis
May 23rd, 2010
Xenopus embrionale epiteli sono un sistema modello ideale per studiare i comportamenti delle cellule, come lo sviluppo di polarità e cambiare forma durante la morfogenesi epiteliale. Istologia tradizionale di campioni fisso è sempre più integrato da live-cell imaging confocale. Qui mostriamo metodi per isolare i tessuti rana e visualizzare dal vivo le cellule epiteliali e le loro citoscheletro con live-cell microscopia confocale.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di dimostrare l'imaging dal vivo e semplici metodi di quantificazione per analizzare la morfologia delle cellule epiteliali embrionali. Ciò si ottiene preparando prima tutti gli strumenti e gli apparecchi. La seconda fase della procedura consiste nell'asportare X explan dagli embrioni di rana e ospitarli in camere per la coltura a lungo termine.
La terza fase della procedura consiste nel raccogliere immagini ad alta risoluzione delle cellule epiteliali in tempo reale. La fase finale della procedura consiste nel quantificare i dettagli morfologici delle cellule epiteliali utilizzando l'immagine J. Infine, è possibile ottenere risultati che mostrano le aree cellulari tracciate e le intensità della membrana attraverso la microscopia confocale ad alta risoluzione. Ciao, sono Sagar Joshi del Davidson Laboratory del Dipartimento di Bioingegneria dell'Università di Pittsburgh.
Oggi vi mostreremo una procedura per l'imaging di cellule vive e l'analisi quantitativa delle cellule epiteliali embrionali di Xenos lavia. Utilizziamo questa procedura per studiare in tempo reale i cambiamenti del citoscheletro cellulare. Quindi iniziamo.
Per preparare le camere per la coltura dei cappucci degli animali, utilizzare grasso al silicone per sigillare una camera acrilica personalizzata o una piccola rondella di nylon su un grande vetro di copertura da 45 x 50 millimetri. Aggiungere un millilitro di 1% BSA in un terzo di XMBS alla camera. Rivestire piccoli frammenti di vetrino coprioggetto con la stessa soluzione in incubazione per due o quattro ore a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius.
Per ridurre l'adesione dell'X explan al vetro, sciacquare e riempire la camera con il mezzo DFA fino a poco prima del trasferimento in The xs, sciacquare i frammenti del vetrino coprioggetto allo stesso modo. Quindi immergerli in una capsula di embrioni di coltura DFA che sono stati microiniettati allo stadio da una a quattro cellule con il NA MR desiderato allo stadio desiderato in un terzo XMBS. Utilizzare una pipetta di trasferimento con un'apertura inclinata per trasferire gli embrioni in una piastra di DFA sotto uno stereomicroscopio da dissezione.
Usa una pinza per iscrivere gli embrioni per asportare una pianta CapEx animale. Usa un anello per capelli per sostenere un embrione in una posizione. Usa un coltello per capelli per fare una piccola incisione nel palo dell'animale.
Eseguire ripetuti tagli lisci per estendere l'incisione e rimuovere l'ectoderma del cappuccio. Accise tre o quattro volte allo stesso modo. Utilizzare una pipetta di trasferimento per spostarli nella camera di coltura preparata.
Usando l'anello per capelli, posizionare ogni X in modo che l'epitelio sia rivolto verso il fondo della camera. Usando il forcipe. Tenere un frammento di vetrino coprioggetto al centro.
Immergere le estremità nel grasso siliconico. Posiziona un frammento su ogni spiegazione X. Fissare leggermente ogni frammento in posizione con piccoli tocchi di grasso siliconico.
Facendo attenzione a non distruggere completamente l'X explan con forza eccessiva. Riempire la camera con DFA, rivestire i bordi superiori della camera con grasso siliconico. Quindi sigillare la parte superiore con un vetrino coprioggetti da 24 x 40 millimetri.
Regolare il livello del DFA all'interno della camera per ridurre le bolle d'aria e utilizzare il fazzoletto per asciugare qualsiasi trabocco. Le piante X possono ora essere coltivate a lungo termine nella camera sigillata per un giorno a temperatura ambiente, spostando l'obiettivo 20 x di un microscopio confocale in posizione. Posizionare la camera contenente l'esplano X sul tavolino del microscopio e posizionare piccoli pesi di bilanciamento sulla camera per mantenerla in posizione in campo chiaro.
Regola la messa a fuoco e usa la posizione del corso per visualizzare le estremità apicali delle cellule superficiali. Passa alla fluorescenza e a un obiettivo di potenza più elevata. Per raccogliere singole immagini o filmati time-lapse dell'epitelio esplicativo, regolare l'acquisizione per ottenere la migliore immagine possibile.
Fare riferimento alla parte scritta di questo protocollo per suggerimenti sulla messa a punto e l'imaging. Mantenere la potenza del laser il più bassa possibile. Cattura immagini o filmati time-lapse dell'epitelio x explan.
Fare riferimento alla parte scritta del protocollo per suggerimenti sulla raccolta dei dati. I file di immagine confocali possono essere estratti per i dati in vari modi. Ecco due esempi di come analizzare i file di dati utilizzando il software di analisi Image J con il plug-in dei formati bio
.Per misurare l'area cellulare di una cellula epiteliale, aprire il menu di analisi e fare clic su imposta misurazioni. Seleziona lo strumento di selezione dalla barra degli strumenti e delinea la cella nel menu Analizza, seleziona gli strumenti e quindi Gestione ROI. Per aprire le regioni del gestore di interessi, premere il tasto Ctrl t.
Per aggiungere la struttura al gestore ROI, seleziona e aggiungi tutti i contorni desiderati dall'immagine. Quindi fare clic su Salva per salvare il ROI impostato nel ROI manager. Fai clic su misura.
La finestra dei risultati mostrerà ora le aree misurate di ciascun ROI. Per misurare l'intensità di una membrana cellulare, selezionare lo strumento linea retta dalla barra degli strumenti dell'immagine J. Disegna una linea perpendicolare attraverso la membrana.
Premere CTRL T come nell'esempio precedente. Per aggiungere la selezione al gestore ROI, apri il menu di analisi e fai clic sul profilo del grafico per generare un grafico delle intensità relative lungo la linea. Per salvare il grafico come immagine, fare clic su Salva nella finestra del nuovo tracciato visualizzata.
Apri il menu dell'elenco per archiviare, quindi salva come Ti abbiamo appena mostrato come analizzare e quantificare le cellule epiteliali embrionali da CapEx di animali asportati. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di aggiungere antibiotico e antibiotico al DFA. Per scoraggiare la crescita di batteri e funghi, prestare particolare attenzione durante la pressatura degli espianti sotto i vetrini coprioggetti perché una pressione superiore a quella richiesta può distruggere l'ex explan.
È anche importante ricordare di avere impostazioni ottimali sul microscopio confocale per ottenere dati di immagine di massima qualità. Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.
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Panoramica
Questo articolo dimostra tecniche di imaging in vivo per studiare la morfologia delle cellule epiteliali embrionali in Xenopus. Evidenzia metodi per isolare i tessuti di rana e visualizzare cellule epiteliali vive utilizzando la microscopia confocale.
Componenti Principali dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia Cellulare
- Biologia dello Sviluppo
Background
- L'epitelio embrionale di Xenopus serve come modello per studiare i comportamenti cellulari.
- L'imaging di cellule vive completa l'istologia tradizionale.
- Comprendere la morfogenesi epiteliale è cruciale per gli studi sullo sviluppo.
- La microscopia confocale permette la visualizzazione in tempo reale delle dinamiche cellulari.
Obiettivo dello Studio
- Dimostrare tecniche di imaging in vivo per le cellule epiteliali.
- Quantificare i dettagli morfologici delle cellule epiteliali.
- Fornire un protocollo per l'isolamento e la coltura dei tessuti di rana.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di strumenti e apparati per l'imaging.
- Escissione di tessuti da embrioni di rana per la coltura.
- Raccolta di immagini ad alta risoluzione di cellule epiteliali.
- Quantificazione della morfologia cellulare utilizzando il software Image J.
Risultati Principali
- Sono state ottenute immagini ad alta risoluzione di cellule epiteliali vive.
- L'analisi quantitativa ha rivelato aree cellulari e intensità di membrana tracciate.
- L'imaging in vivo ha fornito intuizioni sul comportamento cellulare durante la morfogenesi.
- I metodi sono stati validati per la coltura a lungo termine dei tessuti di rana.
Conclusioni
- La microscopia confocale di cellule vive è efficace per studiare le cellule epiteliali.
- I metodi possono essere applicati a vari studi di biologia dello sviluppo.
- I risultati migliorano la comprensione della morfogenesi epiteliale.
Domande Frequenti
Executive Industry Relevance
Live-cell imaging and quantitative analysis of embryonic epithelial cells in Xenopus laevis provide a dynamic platform for interrogating morphogenetic processes relevant to early discovery and target validation. High-resolution confocal microscopy enables real-time measurement of cellular morphology and protein localization, supporting predictive confidence in developmental biology models. This workflow enhances the translational value of epithelial systems for mechanistic de-risking and portfolio triage in preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct observation of cytoskeletal changes and cell shape dynamics in real time.
- Supports functional validation of molecular targets involved in epithelial morphogenesis.
- Facilitates mechanistic de-risking by quantifying cell area and membrane intensity changes.
- Provides a platform for hypothesis-driven interrogation of developmental pathways.
Screening & Assay Development
- Prepares validated live-cell systems for downstream quantitative imaging workflows.
- Standardizes measurement of morphological parameters using reproducible Image J analysis.
- Enables high-content screening of compounds affecting epithelial cell behavior.
- Supports assay scalability and platform reuse for comparative studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by capturing dynamic epithelial processes.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation via quantitative outputs.
- Reduces biological risk by providing predictive, real-time cellular readouts.
- Supports biomarker identification through live imaging of protein localization.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing to preclinical model validation, leveraging live-cell imaging for robust data generation.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification through real-time morphological analysis.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Delivers precise measurements of cell area and membrane intensity for comparative analytics.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical research by supporting disease-relevant system modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis platform for diverse epithelial studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in epithelial biology.
- Operational Value: Promotes standardization, reproducibility, and scalability in live-cell imaging workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by providing robust quantitative data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery-stage assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and quantitative image analysis.
- Demands access to specialized imaging instrumentation and analysis software (e.g., Image J).
- Necessitates cross-team standardization of imaging and measurement protocols.
- May require adaptation for different model systems or tissue types.
- Dependent on optimal culture conditions and careful sample handling to ensure data quality.
