Name: Estrazione del DNA da microbi intestinali della Termite (Zootermopsis Angusticollis) e visualizzare microbi intestinali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: Impara l'estrazione del DNA dai microbi intestinali di Zootermopsis angusticollis e la visualizzazione della comunità microbica. Questo metodo consente di studiare le interazioni microbiche e le vie metaboliche nel tratto intestinale posteriore delle termiti.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Sintesi procedurale per tutta la termite-gut estrazione del DNA: <ol><li> Termiti freddo sul ghiaccio, rimuovere intestino utilizzando una pinzetta sterile e stabilizzare i campioni di intestino nel buffer. </li><li> Omogeneizzare i campioni in PVPP / SDS / buffer fenolo. </li><li> Estrarre e purificare il DNA da lisato grezzo con colonne Qiagen DNeasy. </li></ol> Protocollo: <ol><li> Sul ghiaccio, rimuovere il fegato dalle termiti casta lavoratore con pinza sterile. </li><li> Trasferire immediatamente il coraggio e contenuto in una sterile, priva di nucleasi tubo contenente 50 microlitri gelida 1x biologia molecolare grado di buffer TE (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0). Congelare i campioni a -20 ° C, o procedere direttamente con omogeneizzazione. </li><li> Trasferire i campioni di intestino e ad un tampone sterile, priva di nucleasi 2 tubi ml con tappo a vite pre-caricato con 500 mg di sterili zirconia / perle di silice (0,1 mm) e 700 ml di tampone 1x TE contenente 1% w / v polivinilpolipirrolidone (PVPP ). </li><li> Aggiungere 50 ml di solfato di sodio al 20% dodecil (SDS) e 500 ml di fenolo ai campioni. </li><li> Omogeneizzare (battito tallone) sul più alto impostazione con tre cicli di 30 omogeneizzazione sec e 30 sec di raffreddamento sul ghiaccio. </li><li> Sedimento materiale insolubile per 1 min a 8.000 x g. </li><li> Purificare 300-microlitri aliquote del acquosa (superiore) strato con colonne Qiagen DNeasy con il metodo descritto per la purificazione lisato grezzo. </li><li> Quantificare contenuto degli acidi nucleici e congelare i campioni a -20 ° C per un uso successivo. </li></ol>

<ol><li>Berthelet, M., Whyte, L. G., Greer, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+Direct+Extraction+of+DNA+from+Soils+for+PCR+Analysis+using+Polyvinylpolypyrrolidone+Spin+Columns%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Rapid, Direct Extraction of DNA from Soils for PCR Analysis using Polyvinylpolypyrrolidone Spin Columns.</a> FEMS Microbiol. Lett. 138, 17-22 (1996).</li>
<li>Kudo, T., Ohkuma, M., Moriya, S., Noda, S., Ohtoko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Phylogenetic+Identification+of+the+Intestinal+Anaerobic+Microbial+Community+in+the+Hindgut+of+the+Termite%2C+Reticulitermes+Speratus%2C+without+Cultivation%5BTitle%5D)+AND+%22Extremophiles%22%5BJournal%5D)">Molecular Phylogenetic Identification of the Intestinal Anaerobic Microbial Community in the Hindgut of the Termite, Reticulitermes Speratus, without Cultivation.</a> Extremophiles. 2, 155-161 (1998).</li>
<li>Moré, M. I., Herrick, J. B., Silva, M. C., Ghiorse, W. C., Madsen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Cell+Lysis+of+Indigenous+Microorganisms+and+Rapid+Extraction+of+Microbial+DNA+from+Sediment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Cell Lysis of Indigenous Microorganisms and Rapid Extraction of Microbial DNA from Sediment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 60, 1572-1580 (1994).</li>
<li>Odelson, D. A., Breznak, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+Fatty+Acid+Production+by+the+Hindgut+Microbiota+of+Xylophagous+Termites%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Volatile Fatty Acid Production by the Hindgut Microbiota of Xylophagous Termites.</a> Appl. Environ. Microbiol. 45, 1602-1613 (1983).</li>
<li>Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Digital+PCR+Enables+Multigene+Analysis+of+individual+Environmental+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Digital PCR Enables Multigene Analysis of individual Environmental Bacteria.</a> Science. 314, 1464-1467 (2006).</li>
<li>Purdy, K. J., Embley, T. M., Takii, S., Newdell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Extraction+of+DNA+and+rRNA+from+Sediments+by+a+Novel+Hydroxyapatite+Spin-Column+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid Extraction of DNA and rRNA from Sediments by a Novel Hydroxyapatite Spin-Column Method.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62, 3905-3907 (1996).</li>
<li>Salmassi, T. M., Leadbetter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Genes+of+Tetrahydrofolate-Dependent+Metabolism+from+Cultivated+Spirochaetes+and+the+Gut+Community+of+the+Termite+Zootermopsis+Angusticollis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Genes of Tetrahydrofolate-Dependent Metabolism from Cultivated Spirochaetes and the Gut Community of the Termite Zootermopsis Angusticollis.</a> Microbiology. 149, 2529-2537 (2003).</li>
<li>Schmitt-Wagner, D., Friedrich, M. W., Wagner, B., Brune, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+Diversity%2C+Abundance%2C+and+Axial+Distribution+of+Bacteria+in+the+Intestinal+Tract+of+Two+Soil-Feeding+Termites+%28Cubitermes+spp%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic Diversity, Abundance, and Axial Distribution of Bacteria in the Intestinal Tract of Two Soil-Feeding Termites (Cubitermes spp).</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 6007-6017 (2003).</li>
<li>Tsai, Y. L., Olson, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Method+for+Separation+of+Bacterial+DNA+from+Humic+Substances+in+Sediments+for+Polymerase+Chain+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid Method for Separation of Bacterial DNA from Humic Substances in Sediments for Polymerase Chain Reaction.</a> Appl. Environ. Microbiol. 58, 2292-2295 (1992).</li>
</ol>

Nella nostra esperienza, il DNA estratto dalle comunità microbiche del legno al seno specie di termiti come nevadensis Zootermopis è sufficientemente puro per il modello PCR dopo un giro di estrazione e purificazione. Tuttavia, alcuni termiti come lettiera al seno e il terreno al seno specie può avere una maggiore concentrazione di acidi umici nel loro contenuto intestinale e può richiedere ulteriore purificazione di DNA microbico intestinale. La resa del DNA totale dalle viscere di 5 lavoratori nevadensis Z. è nel range di 10-30 mg. Per le...

<table><tbody><tr><td>PVPP/SDS/fenolo</td><td>Tampone</td><td></td><td></td><td>tampone di omogeneizzazione</td></tr><tr><td>DNeasy Tissue Kit</td><td>Kit</td><td>Qiagen</td><td>77607</td><td>Utilizzato secondo il protocollo per l'isolamento del DNA genomico da lisati grezzi (Appendice H, versione del manuale del prodotto: luglio 2003)</td></tr><tr><td>TE</td><td>Tampone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>tampone 1x (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) ottenuto da concentrato 100x</td></tr><tr><td>perle di zirconia/silice</td><td>Materiali di consumo</td><td>Biospec Products</td><td>11079101z</td><td>0,1 mm</td></tr><tr><td>PVPP</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6755</td><td>polivinilpolipirrolidone al 1% p/v preparato dal reagente secco come sospensione 1x in tampone TE</td></tr><tr><td>Zootermopsis nevadensis</td><td>Animale</td><td></td><td></td><td>Termiti</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4390</td><td>solfato di sodio dodecile al 20% in soluzione acquosa, ottenuto dal reagente secco</td></tr><tr><td>Fenolo</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77607</td><td>saturato con TE, ~73%</td></tr><tr><td>MiniBeadbeater-8</td><td>Strumento</td><td>Biospec Products</td><td>963</td><td></td></tr><tr><td>BSS</td><td>Soluzione salina tamponata, pH 7,2</td><td></td><td></td><td>Formulazione per litro: 2,5 g K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1,0 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1,6 g KCl, 1,4 g NaCl, 0,075 g CaCl, 1 g MgCl e 10 mL di una soluzione 1 M di NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>AxioPlan-2</td><td>Microscopio</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>Dotato di obiettivo 40x, optivar 1,6x e lenti oculari 10x. I campioni sono stati osservati utilizzando l'illuminazione a contrasto di fase</td></tr></tbody></table>

estrazione del dna da microbi intestinali della termite (zootermopsis angusticollis) e visualizzare microbi intestinali

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

Le termiti sono tra i pochi animali noti per avere la capacità di sussistere esclusivamente da legno consumando. Il tratto intestinale termite contiene una popolazione microbica densi e ricchi di specie che assiste nella degradazione della lignocellulosa prevalentemente in acetato, la sostanza nutriente chiave alimentando il metabolismo delle termiti (Odelson &amp; Breznak, 1983). All&#39;interno di queste popolazioni microbiche sono batteri, archeobatteri metanogeni e, in alcuni (&quot;inferiore&quot;) termiti, eucarioti protozoi. Così, le termiti sono i soggetti di ricerca di eccellenza per lo studio delle interazioni tra le specie microbiche e le numerose funzioni biochimiche che svolgono a beneficio della loro ospite. La composizione delle specie delle popolazioni microbiche in budella delle termiti così come i geni chiave coinvolti in vari processi biochimici è stata esplorata mediante tecniche molecolari (Kudo et al, 1998;. Schmit-Wagner et al, 2003;. Salmassi &amp; Leadbetter, 2003). Queste tecniche dipendono dalla estrazione e purificazione degli acidi nucleici di elevata qualità dall&#39;ambiente intestinale termite. La tecnica di estrazione descritta in questo video è una raccolta modificata di protocolli sviluppati per l&#39;estrazione e la purificazione degli acidi nucleici da campioni ambientali (Mor et al, 1994;. Berthelet et al, 1996;. Purdy et al, 1996;. Salmassi &amp; Leadbetter, 2003;. Ottesen et al 2006) e produce DNA da materiale hindgut termite può essere utilizzato come modello per la reazione a catena della polimerasi (PCR).

Questo video illustra la tecnica per estrarre il DNA dalla specie di microbi residenti nel hindgut termite. La preparazione di un vetrino a fresco, che è utile per visualizzare la comunità microbica intestinale è anche illustrato, e un tour attraverso le specie di ambiente ricco di intestino è dato.

Estrazione del DNA da microbi intestinali della Termite (Zootermopsis Angusticollis) e visualizzare microbi intestinali

Le termiti sono tra i pochi animali noti per avere la capacità di sussistere esclusivamente consumando legno. Il tratto intestinale delle termiti contiene un denso e...

Qui, la tua reazione a questo ambiente non è, non è unica. La maggior parte delle persone, anche i non scienziati, sono piuttosto colpiti. Sì. Dalla, dalla diversità e dalla complessità.Ciao, mi chiamo Eric Matson e sono un ricercatore postdottorato presso il Dipartimento di Ingegneria Ambientale e Scientifica del California Institute of Technology. Il mio lavoro, svolto sotto la direzione del Professor Jared Ledbetter, si concentra sulle interazioni microbiche e sulla diversità delle specie che abitano l'intestino posteriore delle termiti. In particolare, siamo interessati ad alcuni dei percorsi biochimici coinvolti, con particolare attenzione al processo di acetogenesi, attraverso il quale questi microrganismi consumano idrogeno e anidride carbonica trasformandoli in acetato, un nutriente chiave per il metabolismo energetico dell'ospite termite.Io e altri membri del laboratorio abbiamo sviluppato set di primer specifici per analizzare gli enzimi chiave di questo percorso metabolico. Tuttavia, per poterlo fare, dobbiamo generare campioni di DNA purificati della comunità microbica, il DNA, da utilizzare come bersagli in questo processo. Oggi, quindi, vorrei dimostrare come si procede alla dissezione della specie di termite in esame, all'estrazione del DNA dal proctodeo, alla sua purificazione e al successivo utilizzo nelle indagini.Oggi ci concentreremo su una specie di termite in particolare, chiamata Zootermopsis nevadensis. Si tratta di una termite del legno umido della California, raccolta localmente qui, ed è una specie piuttosto grande, il che rende abbastanza agevole eseguire dissezioni ed estrazioni. Bene, oggi ho già preparato alcune delle attrezzature necessarie per la procedura.Una delle prime cose di cui abbiamo bisogno è una certa quantità di ghiaccio per raffreddare gli insetti che andremo a dissezionare. Ho anche pre-raffreddato del buffer TE, che contiene un composto utile a stabilizzare il DNA una volta rilasciato dalle cellule. Ho provette sterili già caricate con perline di silicato di zirconio.Questi sono microsfere di 0,1 millimetri e qui ce ne sono circa mezzo grammo. È questo il procedimento che eseguiremo effettivamente: frammentazione meccanica. Inoltre, ho alcuni reagenti coinvolti nella procedura di lisi e purificazione.Qui ho una bottiglia contenente il 1% di polivinilpolipirrolidone o PVPP nel tampone. Il PVPP è importante per rimuovere gli acidi umici dalle preparazioni di DNA, che potrebbero inibire la nostra analisi PCR dei risultati. Inoltre, ho del solfato di sodio ECO, un tensioattivo che utilizzeremo per favorire l'estrazione e la rottura delle cellule.E poi, per effettuare la dissezione delle termiti, abbiamo bisogno soltanto di pinzette sterili. Queste hanno una punta abbastanza fine e saranno utilizzate per rimuovere i tratti intestinali. Infine, per effettuare la rottura meccanica, disponiamo di un dispositivo di omogeneizzazione che ruota a giri molto elevati e, insieme alle perle di silicato di zirconia, provocherà la rottura meccanica delle cellule.Dopo aver raccolto le termiti sul campo, le portiamo qui in laboratorio. La maggior parte delle termiti legnose umide della California con cui lavoriamo sono molto soggette a disidratazione. Uno dei progressi che abbiamo realizzato in questo laboratorio consiste nell'incorporare l'uso di camere controllate per l'umidità, come questi acquari da 10 galloni.All'interno, raccogliamo le colonie singole e le manteniamo separate in questi, in questi contenitori. Alla base del serbatoio si trovano essenzialmente dei recipienti che contengono diverse soluzioni saline. Questo in particolare contiene una soluzione di fosfato di potassio, che mantiene l'umidità relativa intorno al 95-96%, il che è perfetto.E, con queste condizioni, siamo riusciti a far riprodurre effettivamente i termiti in cattività; tuttavia, quando desideriamo eseguire un esperimento, raccogliamo esemplari freschi dal campo. Ma in questo contenitore potete vedere parte del legno di cui si nutrono. Si tratta semplicemente di pino giallo (Ponderosa) o di pino di Jeffrey che raccogliamo sul sito del nido di termiti.E esistono diversi tipi di caste tra le termiti, tra cui i riproduttori maschili e femminili. La maggior parte della colonia è composta da termiti operaie, oltre a un certo numero di caste di soldato. Curiosamente, i soldati possiedono strutture boccali, le mandibole, che sono specializzate nella difesa della colonia piuttosto che nel consumo del legno.Pertanto, dipendono dai termiti operaio per essere nutriti. Come si può vedere in questo contenitore, ci sono sia termiti operaio che soldato, oltre a dei giovani appena schiusi dalle uova, almeno in cattività.Ho quindi selezionato cinque termiti operaie dal gruppo che vi ho appena mostrato. Le ho raffreddate ponendole sul ghiaccio. Per prepararmi alla dissezione, userò queste pinzette e lavorerò con l'aiuto di un microscopio stereoscopico; spero che riusciate a vedere il grande volume dell'intestino che potremo rimuovere da ciascuno di questi individui.Basta capovolgere la termite sulla schiena e, con una pinzetta, tenere la parte della testa e con l'altra, semplicemente pizzicare. Proprio alla punta dell'addome qui. Con una pinzetta, si dovrebbe vedere il tratto intestinale rimosso dall'organismo. Ok.E si può osservare che un volume elevato, circa il 30%40% del peso dell'insetto, è effettivamente contenuto all'interno di quell'ambiente. E si può notare che è suddiviso in diverse sezioni. Abbiamo il quarto intestino e poi il mesenterio, e quindi questo intestino posteriore dilatato, che è una camera molto grande contenente la maggior parte della comunità microbica responsabile delle fermentazioni.Qui ho rimosso le interiora di cinque termiti operaie. Ora il passo successivo consiste nel stabilizzare gli acidi nucleici contenuti all'interno della comunità presente, utilizzando una soluzione di buffer TE freddo di ghiaccio. A questo punto, i campioni possono essere congelati a meno 20 gradi Celsius se si lavora in campo.O possiamo proseguire direttamente con la procedura di estrazione. Ma tutte le cellule e il materiale di DNA sono ancora contenuti nell'intestino. E ora li metterò in 100 microlitri di buffer TE.Ok, prima di iniziare effettivamente l'estrazione dei campioni di intestino, devo preparare il buffer che utilizzerò per rompere le cellule e i tessuti. In questo tubo, in cui ho già aggiunto circa mezzo grammo di perle di zirconio, aggiungerò 700 microlitri di PVPP. Questo è il buffer TE all'1% e 50 microlitri di una soluzione al 20% di SDS.È importante risospendere il PVPP prima di aggiungerlo poiché è insolubile nei tamponi acquosi. A questo punto, siamo pronti per aggiungere il fenolo al campione, quindi userò una pipetta per aggiungere circa 500 microlitri o poco più. Bene. E con questo, siamo pronti per iniziare l'estrazione. Sì.Con l'aggiunta del fenolo, siamo pronti ad aggiungere il campione intestinale che abbiamo dissezionato dalla termite in precedenza, il che aiuta a macerare leggermente i tessuti. Questo rende il trasferimento un po' più facile. Ora, con l'aggiunta del fenolo, siamo pronti a iniziare la rottura meccanica mediante il dispositivo con perline. La tecnica che utilizzeremo prevede tre cicli a velocità massima per 30 secondi, seguiti da 30 secondi sul ghiaccio. È importante includere il passaggio sul ghiaccio per raffreddare il campione, poiché tende a riscaldarsi a causa dell'attrito. Inserirò quindi il campione nel dispositivo di bead beating e procederò per 30 secondi. Okay.Alla fine della procedura, si dovrebbe osservare che la maggior parte del tessuto è stata omogeneizzata. Dovrebbero rimanere pochissimi grumi, e si noterà un aspetto probabilmente schiumoso, forse a causa del SDS presente. A questo punto, siamo pronti per effettuare la centrifugazione e quindi iniziare l'estrazione e la purificazione effettiva del DNA da questo campione.Ora che abbiamo disgregato meccanicamente le cellule, procederemo a centrifugare per rimuovere il materiale insolubile. Per farlo, inseriremo il campione nella centrifuga utilizzando una forza di 8.000 ×g per un minuto. A questo punto, ci aspettiamo di vedere la maggior parte del materiale solubile raccolto in prossimità del fondo del tubo.E ciò che ci interessa è la soluzione acquosa nella parte superiore. Questa verrà aggiunta al kit di estrazione del DNA KaiGen seguendo la procedura per il lisato grezzo. Ora che abbiamo centrifugato il nostro campione, preleveremo 200 microlitri per preparazione del sopranatante ed estrarreremo il DNA utilizzando semplicemente il kit KaiGen A-D-N-E-Z seguendo il protocollo indicato per il lisato grezzo.Ora abbiamo i 200 microlitri di campione intestinale e procederò utilizzando il kit kyogen d easy seguendo il protocollo indicato per il lisato grezzo. Ogni volta che eseguiamo un'estrazione intestinale, è sempre consigliabile verificare lo stato del contenuto intestinale. Per farlo, dissechiamo una termite e ci assicuriamo che sia rappresentativa degli aspetti già osservati in precedenza.Lo faremo effettivamente in modo visivo osservando le cellule in questa comunità microbica. Proprio alla punta dell'addome qui. E con un polo, dovreste vedere il tratto intestinale.Questa è quindi semplicemente una soluzione salina tamponata che corrisponde molto da vicino alla composizione del fluido intestinale effettivo della termite. Ora procederò semplicemente a macerare un po' questo campione e quindi lo aggiungerò al vetrino da microscopio e osserveremo il risultato. Bene, ora siamo pronti per osservare al microscopio.Sì, sembra davvero buono. L'intestino del termite contiene rappresentanti di tutti e tre i domini riconosciuti della vita.Esistono protozoi eucarioti, ci sono organismi metanogeni e poi ci sono anche batteri. Il nostro laboratorio si occupa principalmente della popolazione batterica in questo ambiente. In particolare, gli SPI kes in questo particolare tipo di termite spire keets sono tra i membri batterici più dominanti della comunità.E la nostra ricerca attuale dimostra che in effetti esse partecipano in larga misura alla riduzione della CO2 e alla chetogenesi. Questi sono semplicemente diversi tipi di protozoi, ritenuti partecipi, appunto, nella degradazione primaria del legno. Si ritiene pertanto che contengano xilanasi e cellulasi che permettono ai loro enzimi di accedere a questi polimeri legnosi.E poi fermentano questi composti in monomeri di zuccheri semplici e in polimeri che vengono ulteriormente degradati da altri membri della comunità. Questi protozoi producono anche acetato, ma uno dei loro sottoprodotti è l'idrogeno e la CO2; tale idrogeno e CO2 vengono nuovamente utilizzati o consumati dalle popolazioni di acetogeni in questo ambiente. Qui si può vedere un ammasso di organismi protozoi probabilmente vicino a una specie molto grande di termite e alla sua fauna associata.È uno degli organismi più grandi presenti nell'intestino del termite. Procedendo verso il basso e osservando le aree che non contengono queste grandi cellule di protozoi, si noterà che lo sfondo, costituito da un tipo di fluido interstiziale, è anch'esso ricco di spicole e di altre cellule batteriche. Pertanto, come si può vedere, la complessità non diminuisce nemmeno in questi spazi.Una delle cose che dovrei sottolineare è che il volume tipico del prelievo dell'intestino posteriore, come quello che abbiamo esaminato qui, varia da due a cinque microlitri a seconda delle dimensioni della termite. Pertanto, il preparato in fresco che ho realizzato qui rappresenta effettivamente una diluizione di almeno uno a 20 di quell'ambiente. Di conseguenza, queste specie sono impacchettate in modo molto, molto più denso nell'intestino effettivo e integro rispetto a quanto rappresentato qui.Questo vi dà un'idea della densità e della diversità della vita in questo ambiente. Oggi vi ho mostrato come isoliamo il DNA dall'intestino del termite utilizzando questi campioni purificati. Ora saremo in grado di applicare set specifici di primer mirati.Cio&egrave;, analizzeremo geni che codificano per una deidrogenasi, la deidrogenasi del monossido di carbonio e la sintesi della tetraidrofolato formale, che sono tre dei set di primer sviluppati dal nostro laboratorio. Siamo interessati allo studio della diversit&agrave; e delle caratteristiche specifiche di sequenza di numerosi geni diversi in questo ambiente. Ci&ograve; comporter&agrave; l'amplificazione mediante PCR dei diversi geni, il loro clonaggio, il sequenziamento e la costruzione di inventari genici.In base ai risultati, possiamo apprendere qualcosa sulla natura di alcune di queste interazioni e in particolare su come questi percorsi siano costruiti in questi diversi microrganismi attraverso questo processo.

extracting-dna-from-gut-microbes-termite-zootermopsis-angusticollis

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Jared Leadbetter spiega perché la termite-gut comunità microbica è un sistema eccellente per studiare le complesse interazioni tra microbi. Il rapporto simbiotico esistente tra l'insetto ospite e lignocellulosa-degradanti microbi intestinali si spiega, così come gli usi industriali di questi microbi per la biomassa vegetale degradante e biocarburanti di generazione.

Indagare la comunità microbica nel hindgut Termite - Intervista

Jared Leadbetter ci porta per una passeggiata naturalistica attraverso la diversità dei residenti vita nel hindgut termiti - un microambiente contenente 250 specie diverse trovato in nessun altro luogo sulla Terra. Jared rivela che la simbiosi esibito da questo sistema è a più livelli e coinvolge non solo una relazione tra la termite e dei suoi abitanti dell'intestino, ma comporta anche una complessa rete di simbiosi tra i microbi intestinali stessi.

Livelli di simbiosi - Visualizzazione della Comunità hindgut Termite microbica

Vi presentiamo le procedure per dimostrare che ligandi si legano alla membrana superficiale della cellulosa digestione protozoi nell'intestino delle termiti di Formosa sotterraneo usando la microscopia a fluorescenza e che ligandi accoppiato con peptidi litici uccidere questi...

Testing Protozoacidal di Ligand-litica Peptidi Contro Gut Termite protozoi In vitro (Cultura protozoi) e In vivo (Microiniezione in Termite hindgut)

La comunità batterica attivo associato con l'intestino di Spodoptera littoralis, è stato determinato mediante stabile-isotopo probing (SIP) accoppiato a pyrosequencing. Utilizzando questa metodologia, l'identificazione delle specie di batteri metabolicamente attivi all'interno della comunità è stato fatto con alta risoluzione e precisione.

Identificazione dei batteri metabolicamente attivo nell&#39;intestino del generalista<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; Via DNA isotopi stabili Probing Utilizzo<sup&gt; 13</sup&gt; C-glucosio

Qui, descriviamo un protocollo per ottenere i dati di sequenza di amplicon del suolo, rizosfera e radice endosphere microbiomi. Questa informazione può essere utilizzata per studiare la composizione e la diversità delle comunità microbiche pianta-collegato ed è adatta per l'uso con una vasta gamma di specie di piante.

Esplorare il microbioma radice: estrazione dei dati di comunità batteriche dal suolo e la rizosfera radice Endosphere

Qui, presentiamo un protocollo per spazialmente e temporalmente valutare la presenza del microbiota praticabile nelle viscere di segno di spunta utilizzando un approccio modificato intero-monta l'ibridazione in situ.

Visualizzazione del Microbiota in Tick budella di intero-monta In Situ di ibridazione

Questo protocollo semplificato descrive in dettaglio un flusso di lavoro per rilevare e visualizzare batteri in campioni di tessuto complessi, dal fissaggio del tessuto alla colorazione dei microbi con ibridazione fluorescente in situ .

Visualizzazione delle interazioni microbiota-ospite intestinale tramite ibridazione fluorescente in situ , colorazione della lectina e imaging

I nematodi caenorhabditis selvatici sono associati a molti microbi, spesso nel lume intestinale o infettando l'intestino. Questo protocollo descrive un metodo per arricchire i microbi incolturabili che colonizzano l'intestino, sfruttando la resistenza della cuticola dauer.

Pulizia selettiva dei nematodi caenorhabiditi selvatici per arricchire i batteri del microbioma intestinale

Per ottenere un insetto ascianico, la sua superficie dell'uovo viene sterilizzata e la larva tratteggiata viene successivamente allevata usando foglie astronche. Questo metodo fornisce un modo efficiente per la preparazione degli insetti axenici senza somministrare antibiotici o sviluppare una dieta artificiale, che può essere applicata anche ad altri insetti mangiatori di foglie.

Preparazione e allevamento di insetti axenici con piantine coltivate su tessuto per studi di interazione microbiota ospite-intestino dello scarabeo fogliare

I microcosmi di compost portano la diversità microbica presente in natura in laboratorio per facilitare la ricerca sul microbioma in Caenorhabditis elegans. Qui sono forniti protocolli per la creazione di esperimenti di microcosmo, con gli esperimenti che dimostrano la capacità di modulare la diversità microbica ambientale per esplorare le relazioni tra diversità microbica ambientale e composizione del microbioma intestinale del verme.

Microcosmi di compost come ambienti microbicamente diversi e simili a quelli naturali per la ricerca sul microbioma in Caenorhabditis elegans

Proponiamo un protocollo ottimizzato di microscopia elettronica a scansione per la visualizzazione di campioni altamente eterogenei e delicati contenenti biomassa vegetale e fungina, insieme a microbiota e biofilm. Questo protocollo consente di descrivere le dimensioni spaziali dell'organizzazione del microbiota.

Microbiota dei giardini delle formiche di Attine: visualizzazione di un paesaggio microbico mediante microscopia elettronica a scansione

Impara l'estrazione del DNA dai microbi intestinali di Zootermopsis angusticollis e la visualizzazione della comunità microbica. Questo metodo consente di studiare le interazioni microbiche e le vie metaboliche nel tratto intestinale posteriore delle termiti.

Estrazione del DNA da microbi intestinali della Termite (Zootermopsis Angusticollis) e visualizzare microbi intestinali

Esplora altri video