Name: Estrazione del DNA da microbi intestinali della Termite (Zootermopsis Angusticollis) e visualizzare microbi intestinali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: Impara l'estrazione del DNA dai microbi intestinali di Zootermopsis angusticollis e la visualizzazione della comunità microbica. Questo metodo consente di studiare le interazioni microbiche e le vie metaboliche nel tratto intestinale posteriore delle termiti.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Sintesi procedurale per tutta la termite-gut estrazione del DNA: <ol><li> Termiti freddo sul ghiaccio, rimuovere intestino utilizzando una pinzetta sterile e stabilizzare i campioni di intestino nel buffer. </li><li> Omogeneizzare i campioni in PVPP / SDS / buffer fenolo. </li><li> Estrarre e purificare il DNA da lisato grezzo con colonne Qiagen DNeasy. </li></ol> Protocollo: <ol><li> Sul ghiaccio, rimuovere il fegato dalle termiti casta lavoratore con pinza sterile. </li><li> Trasferire immediatamente il coraggio e contenuto in una sterile, priva di nucleasi tubo contenente 50 microlitri gelida 1x biologia molecolare grado di buffer TE (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0). Congelare i campioni a -20 ° C, o procedere direttamente con omogeneizzazione. </li><li> Trasferire i campioni di intestino e ad un tampone sterile, priva di nucleasi 2 tubi ml con tappo a vite pre-caricato con 500 mg di sterili zirconia / perle di silice (0,1 mm) e 700 ml di tampone 1x TE contenente 1% w / v polivinilpolipirrolidone (PVPP ). </li><li> Aggiungere 50 ml di solfato di sodio al 20% dodecil (SDS) e 500 ml di fenolo ai campioni. </li><li> Omogeneizzare (battito tallone) sul più alto impostazione con tre cicli di 30 omogeneizzazione sec e 30 sec di raffreddamento sul ghiaccio. </li><li> Sedimento materiale insolubile per 1 min a 8.000 x g. </li><li> Purificare 300-microlitri aliquote del acquosa (superiore) strato con colonne Qiagen DNeasy con il metodo descritto per la purificazione lisato grezzo. </li><li> Quantificare contenuto degli acidi nucleici e congelare i campioni a -20 ° C per un uso successivo. </li></ol>

<ol><li>Berthelet, M., Whyte, L. G., Greer, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+Direct+Extraction+of+DNA+from+Soils+for+PCR+Analysis+using+Polyvinylpolypyrrolidone+Spin+Columns%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Rapid, Direct Extraction of DNA from Soils for PCR Analysis using Polyvinylpolypyrrolidone Spin Columns.</a> FEMS Microbiol. Lett. 138, 17-22 (1996).</li>
<li>Kudo, T., Ohkuma, M., Moriya, S., Noda, S., Ohtoko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Phylogenetic+Identification+of+the+Intestinal+Anaerobic+Microbial+Community+in+the+Hindgut+of+the+Termite%2C+Reticulitermes+Speratus%2C+without+Cultivation%5BTitle%5D)+AND+%22Extremophiles%22%5BJournal%5D)">Molecular Phylogenetic Identification of the Intestinal Anaerobic Microbial Community in the Hindgut of the Termite, Reticulitermes Speratus, without Cultivation.</a> Extremophiles. 2, 155-161 (1998).</li>
<li>Moré, M. I., Herrick, J. B., Silva, M. C., Ghiorse, W. C., Madsen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Cell+Lysis+of+Indigenous+Microorganisms+and+Rapid+Extraction+of+Microbial+DNA+from+Sediment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Cell Lysis of Indigenous Microorganisms and Rapid Extraction of Microbial DNA from Sediment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 60, 1572-1580 (1994).</li>
<li>Odelson, D. A., Breznak, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+Fatty+Acid+Production+by+the+Hindgut+Microbiota+of+Xylophagous+Termites%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Volatile Fatty Acid Production by the Hindgut Microbiota of Xylophagous Termites.</a> Appl. Environ. Microbiol. 45, 1602-1613 (1983).</li>
<li>Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Digital+PCR+Enables+Multigene+Analysis+of+individual+Environmental+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Digital PCR Enables Multigene Analysis of individual Environmental Bacteria.</a> Science. 314, 1464-1467 (2006).</li>
<li>Purdy, K. J., Embley, T. M., Takii, S., Newdell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Extraction+of+DNA+and+rRNA+from+Sediments+by+a+Novel+Hydroxyapatite+Spin-Column+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid Extraction of DNA and rRNA from Sediments by a Novel Hydroxyapatite Spin-Column Method.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62, 3905-3907 (1996).</li>
<li>Salmassi, T. M., Leadbetter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Genes+of+Tetrahydrofolate-Dependent+Metabolism+from+Cultivated+Spirochaetes+and+the+Gut+Community+of+the+Termite+Zootermopsis+Angusticollis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Genes of Tetrahydrofolate-Dependent Metabolism from Cultivated Spirochaetes and the Gut Community of the Termite Zootermopsis Angusticollis.</a> Microbiology. 149, 2529-2537 (2003).</li>
<li>Schmitt-Wagner, D., Friedrich, M. W., Wagner, B., Brune, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+Diversity%2C+Abundance%2C+and+Axial+Distribution+of+Bacteria+in+the+Intestinal+Tract+of+Two+Soil-Feeding+Termites+%28Cubitermes+spp%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic Diversity, Abundance, and Axial Distribution of Bacteria in the Intestinal Tract of Two Soil-Feeding Termites (Cubitermes spp).</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 6007-6017 (2003).</li>
<li>Tsai, Y. L., Olson, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Method+for+Separation+of+Bacterial+DNA+from+Humic+Substances+in+Sediments+for+Polymerase+Chain+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid Method for Separation of Bacterial DNA from Humic Substances in Sediments for Polymerase Chain Reaction.</a> Appl. Environ. Microbiol. 58, 2292-2295 (1992).</li>
</ol>

Nella nostra esperienza, il DNA estratto dalle comunità microbiche del legno al seno specie di termiti come nevadensis Zootermopis è sufficientemente puro per il modello PCR dopo un giro di estrazione e purificazione. Tuttavia, alcuni termiti come lettiera al seno e il terreno al seno specie può avere una maggiore concentrazione di acidi umici nel loro contenuto intestinale e può richiedere ulteriore purificazione di DNA microbico intestinale. La resa del DNA totale dalle viscere di 5 lavoratori nevadensis Z. è nel range di 10-30 mg. Per le...

<table><tbody><tr><td>PVPP/SDS/fenolo</td><td>Tampone</td><td></td><td></td><td>tampone di omogeneizzazione</td></tr><tr><td>DNeasy Tissue Kit</td><td>Kit</td><td>Qiagen</td><td>77607</td><td>Utilizzato secondo il protocollo per l'isolamento del DNA genomico da lisati grezzi (Appendice H, versione del manuale del prodotto: luglio 2003)</td></tr><tr><td>TE</td><td>Tampone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>tampone 1x (1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) ottenuto da concentrato 100x</td></tr><tr><td>perle di zirconia/silice</td><td>Materiali di consumo</td><td>Biospec Products</td><td>11079101z</td><td>0,1 mm</td></tr><tr><td>PVPP</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6755</td><td>polivinilpolipirrolidone al 1% p/v preparato dal reagente secco come sospensione 1x in tampone TE</td></tr><tr><td>Zootermopsis nevadensis</td><td>Animale</td><td></td><td></td><td>Termiti</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4390</td><td>solfato di sodio dodecile al 20% in soluzione acquosa, ottenuto dal reagente secco</td></tr><tr><td>Fenolo</td><td>Reagente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77607</td><td>saturato con TE, ~73%</td></tr><tr><td>MiniBeadbeater-8</td><td>Strumento</td><td>Biospec Products</td><td>963</td><td></td></tr><tr><td>BSS</td><td>Soluzione salina tamponata, pH 7,2</td><td></td><td></td><td>Formulazione per litro: 2,5 g K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1,0 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1,6 g KCl, 1,4 g NaCl, 0,075 g CaCl, 1 g MgCl e 10 mL di una soluzione 1 M di NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>AxioPlan-2</td><td>Microscopio</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>Dotato di obiettivo 40x, optivar 1,6x e lenti oculari 10x. I campioni sono stati osservati utilizzando l'illuminazione a contrasto di fase</td></tr></tbody></table>

estrazione del dna da microbi intestinali della termite (zootermopsis angusticollis) e visualizzare microbi intestinali

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

Le termiti sono tra i pochi animali noti per avere la capacità di sussistere esclusivamente da legno consumando. Il tratto intestinale termite contiene una popolazione microbica densi e ricchi di specie che assiste nella degradazione della lignocellulosa prevalentemente in acetato, la sostanza nutriente chiave alimentando il metabolismo delle termiti (Odelson &amp; Breznak, 1983). All&#39;interno di queste popolazioni microbiche sono batteri, archeobatteri metanogeni e, in alcuni (&quot;inferiore&quot;) termiti, eucarioti protozoi. Così, le termiti sono i soggetti di ricerca di eccellenza per lo studio delle interazioni tra le specie microbiche e le numerose funzioni biochimiche che svolgono a beneficio della loro ospite. La composizione delle specie delle popolazioni microbiche in budella delle termiti così come i geni chiave coinvolti in vari processi biochimici è stata esplorata mediante tecniche molecolari (Kudo et al, 1998;. Schmit-Wagner et al, 2003;. Salmassi &amp; Leadbetter, 2003). Queste tecniche dipendono dalla estrazione e purificazione degli acidi nucleici di elevata qualità dall&#39;ambiente intestinale termite. La tecnica di estrazione descritta in questo video è una raccolta modificata di protocolli sviluppati per l&#39;estrazione e la purificazione degli acidi nucleici da campioni ambientali (Mor et al, 1994;. Berthelet et al, 1996;. Purdy et al, 1996;. Salmassi &amp; Leadbetter, 2003;. Ottesen et al 2006) e produce DNA da materiale hindgut termite può essere utilizzato come modello per la reazione a catena della polimerasi (PCR).

Questo video illustra la tecnica per estrarre il DNA dalla specie di microbi residenti nel hindgut termite. La preparazione di un vetrino a fresco, che è utile per visualizzare la comunità microbica intestinale è anche illustrato, e un tour attraverso le specie di ambiente ricco di intestino è dato.

Estrazione del DNA da microbi intestinali della Termite (Zootermopsis Angusticollis) e visualizzare microbi intestinali

Le termiti sono tra i pochi animali noti per avere la capacità di sussistere esclusivamente consumando legno. Il tratto intestinale delle termiti contiene un denso e...

Qui, la tua reazione a questo ambiente non è, non è unica. La maggior parte delle persone, anche i non scienziati, sono piuttosto colpiti. Sì. Dalla, dalla diversità e dalla complessità.Ciao, mi chiamo Eric Matson e sono un ricercatore postdottorato presso il Dipartimento di Ingegneria Ambientale e Scientifica del California Institute of Technology. Il mio lavoro, svolto sotto la direzione del Professor Jared Ledbetter, si concentra sulle interazioni microbiche e sulla diversità delle specie che abitano l'intestino posteriore delle termiti. In particolare, siamo interessati ad alcuni dei percorsi biochimici coinvolti, con particolare attenzione al processo di acetogenesi, attraverso il quale questi microrganismi consumano idrogeno e anidride carbonica trasformandoli in acetato, un nutriente chiave per il metabolismo energetico dell'ospite termite.Io e altri membri del laboratorio abbiamo sviluppato set di primer specifici per analizzare gli enzimi chiave di questo percorso metabolico. Tuttavia, per poterlo fare, dobbiamo generare campioni di DNA purificati della comunità microbica, il DNA, da utilizzare come bersagli in questo processo. Oggi, quindi, vorrei dimostrare come si proce

extracting-dna-from-gut-microbes-termite-zootermopsis-angusticollis

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Jared Leadbetter spiega perché la termite-gut comunità microbica è un sistema eccellente per studiare le complesse interazioni tra microbi. Il rapporto simbiotico esistente tra l'insetto ospite e lignocellulosa-degradanti microbi intestinali si spiega, così come gli usi industriali di questi microbi per la biomassa vegetale degradante e biocarburanti di generazione.

Indagare la comunità microbica nel hindgut Termite - Intervista

Jared Leadbetter ci porta per una passeggiata naturalistica attraverso la diversità dei residenti vita nel hindgut termiti - un microambiente contenente 250 specie diverse trovato in nessun altro luogo sulla Terra. Jared rivela che la simbiosi esibito da questo sistema è a più livelli e coinvolge non solo una relazione tra la termite e dei suoi abitanti dell'intestino, ma comporta anche una complessa rete di simbiosi tra i microbi intestinali stessi.

Livelli di simbiosi - Visualizzazione della Comunità hindgut Termite microbica

Vi presentiamo le procedure per dimostrare che ligandi si legano alla membrana superficiale della cellulosa digestione protozoi nell'intestino delle termiti di Formosa sotterraneo usando la microscopia a fluorescenza e che ligandi accoppiato con peptidi litici uccidere questi...

Testing Protozoacidal di Ligand-litica Peptidi Contro Gut Termite protozoi In vitro (Cultura protozoi) e In vivo (Microiniezione in Termite hindgut)

La comunità batterica attivo associato con l'intestino di Spodoptera littoralis, è stato determinato mediante stabile-isotopo probing (SIP) accoppiato a pyrosequencing. Utilizzando questa metodologia, l'identificazione delle specie di batteri metabolicamente attivi all'interno della comunità è stato fatto con alta risoluzione e precisione.

Identificazione dei batteri metabolicamente attivo nell&#39;intestino del generalista<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; Via DNA isotopi stabili Probing Utilizzo<sup&gt; 13</sup&gt; C-glucosio

Qui, descriviamo un protocollo per ottenere i dati di sequenza di amplicon del suolo, rizosfera e radice endosphere microbiomi. Questa informazione può essere utilizzata per studiare la composizione e la diversità delle comunità microbiche pianta-collegato ed è adatta per l'uso con una vasta gamma di specie di piante.

Esplorare il microbioma radice: estrazione dei dati di comunità batteriche dal suolo e la rizosfera radice Endosphere

Qui, presentiamo un protocollo per spazialmente e temporalmente valutare la presenza del microbiota praticabile nelle viscere di segno di spunta utilizzando un approccio modificato intero-monta l'ibridazione in situ.

Visualizzazione del Microbiota in Tick budella di intero-monta In Situ di ibridazione

Questo protocollo semplificato descrive in dettaglio un flusso di lavoro per rilevare e visualizzare batteri in campioni di tessuto complessi, dal fissaggio del tessuto alla colorazione dei microbi con ibridazione fluorescente in situ .

Visualizzazione delle interazioni microbiota-ospite intestinale tramite ibridazione fluorescente in situ , colorazione della lectina e imaging

I nematodi caenorhabditis selvatici sono associati a molti microbi, spesso nel lume intestinale o infettando l'intestino. Questo protocollo descrive un metodo per arricchire i microbi incolturabili che colonizzano l'intestino, sfruttando la resistenza della cuticola dauer.

Pulizia selettiva dei nematodi caenorhabiditi selvatici per arricchire i batteri del microbioma intestinale

Per ottenere un insetto ascianico, la sua superficie dell'uovo viene sterilizzata e la larva tratteggiata viene successivamente allevata usando foglie astronche. Questo metodo fornisce un modo efficiente per la preparazione degli insetti axenici senza somministrare antibiotici o sviluppare una dieta artificiale, che può essere applicata anche ad altri insetti mangiatori di foglie.

Preparazione e allevamento di insetti axenici con piantine coltivate su tessuto per studi di interazione microbiota ospite-intestino dello scarabeo fogliare

I microcosmi di compost portano la diversità microbica presente in natura in laboratorio per facilitare la ricerca sul microbioma in Caenorhabditis elegans. Qui sono forniti protocolli per la creazione di esperimenti di microcosmo, con gli esperimenti che dimostrano la capacità di modulare la diversità microbica ambientale per esplorare le relazioni tra diversità microbica ambientale e composizione del microbioma intestinale del verme.

Microcosmi di compost come ambienti microbicamente diversi e simili a quelli naturali per la ricerca sul microbioma in Caenorhabditis elegans

Proponiamo un protocollo ottimizzato di microscopia elettronica a scansione per la visualizzazione di campioni altamente eterogenei e delicati contenenti biomassa vegetale e fungina, insieme a microbiota e biofilm. Questo protocollo consente di descrivere le dimensioni spaziali dell'organizzazione del microbiota.

Microbiota dei giardini delle formiche di Attine: visualizzazione di un paesaggio microbico mediante microscopia elettronica a scansione

Impara l'estrazione del DNA dai microbi intestinali di Zootermopsis angusticollis e la visualizzazione della comunità microbica. Questo metodo consente di studiare le interazioni microbiche e le vie metaboliche nel tratto intestinale posteriore delle termiti.

Estrazione del DNA da microbi intestinali della Termite (Zootermopsis Angusticollis) e visualizzare microbi intestinali

Esplora altri video