Name: シロアリの腸内微生物（Zootermopsis Angusticollis）からDNAを抽出し、腸内微生物の可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: 学ぶ、シロアリの腸内微生物からDNAを抽出し、Zootermopsis angusticollisの複雑な微生物叢を可視化する手法。エーストゲネシスなどの生化学経路と微生物叢の多様性を解明する。

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シロアリ全腸のDNA抽出のための手続き型の要約： <ol><li>氷上で冷やしてシロアリは、滅菌ピンセットを用いて消化管削除し、バッファ内の腸のサンプルを安定化させる。 </li><li> PVPP / SDS /フェノールバッファーでサンプルをホモジナイズする。 </li><li>キアゲンDNeasyカラムを用いて粗ライセートからDNAを抽出し精製する。 </li></ol>プロトコル： <ol><li>氷の上に、滅菌ピンセットを使用してワーカーカーストのシロアリから内臓を取り除く。 </li><li>すぐに50μLの氷冷した1 ×分子生物学グレードのTE緩衝液（1 mMトリス- HCl、0.1mMのEDTA、pH8.0）を含有する滅菌、ヌクレアーゼフリーのチューブに内臓との内容を転送します。 -20℃でサンプルを凍結、または均質化と直接進みます。 </li><li>無菌ジルコニア/シリカビーズ500mgの（0.1 mm）を、1％w / vのポリビニルポリピロリドン（PVPPを含む1 × TEバッファー700μlのが事前にロードされた滅菌、ヌクレアーゼフリーの2 mlのスクリューキャップチューブに腸サンプルとバッファーを転送する）。 </li><li> 20％のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を50μlとサンプルへのフェノールの500μlを添加します。 </li><li> 30秒の均質化の3サイクルと氷で冷却の30秒を使用して、最高の設定で（ビーズ拍）ホモジナイズする。 </li><li> 8000 x gで1分間堆積物不溶性物質。 </li><li>粗溶解物の精製のために説明した方法を使用してQiagen社DNeasy列を含む水溶液（最）層の300μlをして浄化する。 </li><li>後で使用するまで-20℃で核酸含有量および凍結試料を定量化する。 </li></ol>

<ol><li>Berthelet, M., Whyte, L. G., Greer, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+Direct+Extraction+of+DNA+from+Soils+for+PCR+Analysis+using+Polyvinylpolypyrrolidone+Spin+Columns%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Rapid, Direct Extraction of DNA from Soils for PCR Analysis using Polyvinylpolypyrrolidone Spin Columns.</a> FEMS Microbiol. Lett. 138, 17-22 (1996).</li>
<li>Kudo, T., Ohkuma, M., Moriya, S., Noda, S., Ohtoko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Phylogenetic+Identification+of+the+Intestinal+Anaerobic+Microbial+Community+in+the+Hindgut+of+the+Termite%2C+Reticulitermes+Speratus%2C+without+Cultivation%5BTitle%5D)+AND+%22Extremophiles%22%5BJournal%5D)">Molecular Phylogenetic Identification of the Intestinal Anaerobic Microbial Community in the Hindgut of the Termite, Reticulitermes Speratus, without Cultivation.</a> Extremophiles. 2, 155-161 (1998).</li>
<li>Moré, M. I., Herrick, J. B., Silva, M. C., Ghiorse, W. C., Madsen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Cell+Lysis+of+Indigenous+Microorganisms+and+Rapid+Extraction+of+Microbial+DNA+from+Sediment%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Cell Lysis of Indigenous Microorganisms and Rapid Extraction of Microbial DNA from Sediment.</a> Appl. Environ. Microbiol. 60, 1572-1580 (1994).</li>
<li>Odelson, D. A., Breznak, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+Fatty+Acid+Production+by+the+Hindgut+Microbiota+of+Xylophagous+Termites%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Volatile Fatty Acid Production by the Hindgut Microbiota of Xylophagous Termites.</a> Appl. Environ. Microbiol. 45, 1602-1613 (1983).</li>
<li>Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Digital+PCR+Enables+Multigene+Analysis+of+individual+Environmental+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Digital PCR Enables Multigene Analysis of individual Environmental Bacteria.</a> Science. 314, 1464-1467 (2006).</li>
<li>Purdy, K. J., Embley, T. M., Takii, S., Newdell, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Extraction+of+DNA+and+rRNA+from+Sediments+by+a+Novel+Hydroxyapatite+Spin-Column+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid Extraction of DNA and rRNA from Sediments by a Novel Hydroxyapatite Spin-Column Method.</a> Appl. Environ. Microbiol. 62, 3905-3907 (1996).</li>
<li>Salmassi, T. M., Leadbetter, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Genes+of+Tetrahydrofolate-Dependent+Metabolism+from+Cultivated+Spirochaetes+and+the+Gut+Community+of+the+Termite+Zootermopsis+Angusticollis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Genes of Tetrahydrofolate-Dependent Metabolism from Cultivated Spirochaetes and the Gut Community of the Termite Zootermopsis Angusticollis.</a> Microbiology. 149, 2529-2537 (2003).</li>
<li>Schmitt-Wagner, D., Friedrich, M. W., Wagner, B., Brune, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetic+Diversity%2C+Abundance%2C+and+Axial+Distribution+of+Bacteria+in+the+Intestinal+Tract+of+Two+Soil-Feeding+Termites+%28Cubitermes+spp%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Phylogenetic Diversity, Abundance, and Axial Distribution of Bacteria in the Intestinal Tract of Two Soil-Feeding Termites (Cubitermes spp).</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 6007-6017 (2003).</li>
<li>Tsai, Y. L., Olson, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Method+for+Separation+of+Bacterial+DNA+from+Humic+Substances+in+Sediments+for+Polymerase+Chain+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid Method for Separation of Bacterial DNA from Humic Substances in Sediments for Polymerase Chain Reaction.</a> Appl. Environ. Microbiol. 58, 2292-2295 (1992).</li>
</ol>

我々の経験では、Zootermopisのnevadensisのような木製の餌のシロアリの種の微生物群集から抽出したDNAは、抽出と精製1ラウンド後のPCRテンプレート用に十分に純粋である。しかし、このようなゴミ給と土壌栄養の種など、一部のシロアリはその腸の内容フミン酸の高い濃度を有することができるし、腸内微生物のDNAの追加の精製が必要な場合があります。 5 Z.のnevadensis労働者の内臓からの全DNAの収量は10〜30μgの範囲にある。この種よりも有意に小さくしたり大きくシロアリの種の場合は、より多くのまたはより少ない標本はDNAの同じような量を得るために必要になる場合があります。 このメソッドは、簡単にRNAの抽出を可能にするために適応させることができます。 RNAの抽出には、プロトコールのステップ2で説明した氷冷TEバッファにキアゲン（catlogない。76506）から1 × RNAprotectの細菌の試薬を代用。キアゲンをRNeasy試薬とカラムが（ない。74104をcatlogない）上記のDNeasy精製手順の代わりに使用する必要があります。 DNAとしてRNAprotect安定化サンプルと約わずか300μLから精製することができる。手順7で取...

<table><tbody><tr><td>PVPP/SDS/phenol</td><td>緩衝液</td><td></td><td></td><td>ホモジナイズ緩衝液</td></tr><tr><td>DNeasy Tissue Kit</td><td>キット</td><td>Qiagen</td><td>77607</td><td>粗抽出液からのゲノムDNA単離プロトコル（製品マニュアル2003年7月版、付録H）に従って使用</td></tr><tr><td>TE</td><td>緩衝液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9285</td><td>100x濃縮液から調製した1x緩衝液（1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0）</td></tr><tr><td>ジルコニア/シリカビーズ</td><td>消耗品</td><td>Biospec Products</td><td>11079101z</td><td>0.1 mm</td></tr><tr><td>PVPP</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6755</td><td>乾燥試薬からTE緩衝液中で1x懸濁液として調製した1% w/v ポリビニルポリピロリドン</td></tr><tr><td>Zootermopsis nevadensis</td><td>動物</td><td></td><td></td><td>シロアリ</td></tr><tr><td>SDS</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4390</td><td>乾燥試薬から調製した水溶液20% ドデシル硫酸ナトリウム</td></tr><tr><td>フェノール</td><td>試薬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77607</td><td>TE飽和、~73%</td></tr><tr><td>MiniBeadbeater-8</td><td>器具</td><td>Biospec Products</td><td>963</td><td></td></tr><tr><td>BSS</td><td>緩衝塩溶液, pH 7.2</td><td></td><td></td><td>1リットルあたりの組成：2.5 g K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1.0 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1.6 g KCl, 1.4 g NaCl, 0.075 g CaCl, 1 g MgCl, および 1 M NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;溶液 10 mL</td></tr><tr><td>AxioPlan-2</td><td>顕微鏡</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>40x対物レンズ、1.6x optivar、および10x接眼レンズを装備。サンプルは位相差照明を用いて観察した</td></tr></tbody></table>

シロアリの腸内微生物（zootermopsis angusticollis）からdnaを抽出し、腸内微生物の可視化

Extracting DNA from the Gut Microbes of the Termite (Zootermopsis Angusticollis) and Visualizing Gut Microbes

シロアリは、単独で消費する木材によって内在する能力を持つことが知られているいくつかの動物の一つです。シロアリ腸管は主に酢酸にリグノセルロースの分解を補助する高密度と種が豊富な微生物群集が含まれている、シロアリの代謝を加速させる重要な栄養素（Odelson＆Breznak、1983）。これらの微生物集団内細菌、メタン生成古細菌と、いくつか（&quot;低&quot;）シロアリで、原生動物真核生物です。このように、シロアリは微生物種と彼らはホストの利益のために行う数々の生化学的機能間の相互作用を研究するための優秀な研究テーマです。シロアリの腸だけでなく、様々な生化学的プロセスに関与する重要な遺伝子の微生物集団の種組成は、分子技術を（。シュミット - Wagnerら、2003;。Salmassi＆レッドベター、2003工藤ら、1998）を使用して検討されている。これらの技術は、シロアリ腸内の環境から高品質の核酸の抽出と精製に依存する。 。Bertheletら、1996;。パーディら、1996;。Salmassi＆レッドベター、このビデオで説明されている抽出技術は、環境試料（モルら、1994からの核酸の抽出と精製のために開発されたプロトコルの変更をまとめたものです2003;。オッテセンら、2006）、それはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のテンプレートとして使用するのに適してシロアリの後腸の材料からDNAを生成します。

このビデオでは、シロアリの後腸内に常駐微生物の種からDNAを抽出する手法を示しています。腸内の微生物群集を視覚化するのに便利ですウェットマウントスライドの準備も図示され、そして種が豊富な腸内環境を経由してツアーが与えられます。

シロアリの腸内微生物（Zootermopsis Angusticollis）からDNAを抽出し、腸内微生物の可視化

シロアリは、木材の摂取のみで生存できる能力を持つ数少ない動物の一つである。シロアリの消化管には、高密度な…

ここでのこの環境に対するあなたの反応は、決して特別なものではありません。科学者でない方も含め、ほとんどの人がかなり圧倒されます。ええ、その多様性と複雑さにね。こんにちは。私はエリック・マットソンです。カリフォルニア工科大学の環境科学工学科で博士研究員を務めています。私はジャレッド・レッドベター教授の指導の下、シロアリの後腸に生息する微生物の相互作用と種の多様性に関する研究を行っています。特に、そこで行われている生化学的経路に関心を持っており、中でも、微生物が水素とCO2ガスを消費して、シロアリ宿主のエネルギー代謝の重要な栄養素である酢酸に変換するアセトジェネシス（酢酸生成）のプロセスに注目しています。私と研究室のメンバーは、この経路における主要な酵素を評価するために、標的プライマーセットを開発しました。しかし、そのためには、このプロセスの標的に使用するための、コミュニティからのクリーンなDNAサンプルを調製する必要があります。そこで本日は、対象となるシロアリ種の解剖方法、後腸からのDNA抽出、およびその後の解析に使用するための精製方法について実演します。今日は、特にZo Opsis Nevadensisと呼ばれる一種のシロアリに焦点を当てます。これは地元で採集したカリフォルニア湿木シロアリで、かなり大型の種であるため、解剖や抽出が非常に容易です。さて、本日の手順に必要な備品をいくつか準備してあります。まず最初に準備すべきものの一つは、解剖する昆虫を冷却するための適量の氷です。また、あらかじめ冷却しておいたTEバッファーも用意しています。これには、細胞から放出されたDNAを安定化させる化合物が含まれています。さらに、ジルコニアシリケートビーズをあらかじめ充填した滅菌バイアルを用意しました。これらは0.1 millimeterのビーズで、約0.5 gramほど入っています。これから実際に行うのが、メカニカル shearingです。また、溶解および精製手順に使用する試薬をいくつか用意しています。ここにあるボトルには、TEバッファーに溶解した1%polyvinyl PolyOne（PVPP）が入っています。PVPPは、結果のPCR解析を阻害する可能性のあるフミン酸をDNA調製物から除去するために重要です。また、細胞の抽出および破壊を助けるために使用する界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム（SDS）も用意しています。次にシロアリの解剖を行うために必要なのは、滅菌済みのピンセットのみです。これらは先端が非常に細くなっており、実際に腸管を摘出するために使用します。そして最後に、機械的せん断を行うため、非常に高いRPMで回転するビーズビーターを使用します。これとジルコニアシリケートビーズを用いることで、細胞の機械的破壊を行います。フィールドでシロアリを採集した後、こちらの

extracting-dna-from-gut-microbes-termite-zootermopsis-angusticollis

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ジャレッドベターは、シロアリ腸内の微生物群集は、微生物間の複雑な相互作用を研究するための優れたシステムである理由を説明しています。宿主昆虫とリグノセルロース分解腸内微生物との間に存在する共生関係も同様に劣化させる植物バイオマスおよび生成するバイオ燃料のためのこれらの微生物の工業的な用途として、説明されています。...

インタビュー - シロアリ後腸内微生物群集の調査

ジャレッドベターは、シロアリの後腸での生活の居住者の多様性を通じて、自然の散歩に私達を取る -...

共生の層 - シロアリ後腸の微生物コミュニティの可視化

我々はリガンドが原虫溶解ペプチドと結合した蛍光顕微鏡とそのリガンドを用いたイエシロアリシロアリの腸内原生動物殺すセルロース消化これらの表面の膜に結合実証するための手順を提示...

原虫シロアリ腸に対するリガンド - 溶解性ペプチドのProtozoacidal活性を試験する in vitroで（原生動物文化）と in vivoで（シロアリ後腸へのマイクロインジェクション）

ハスモンヨトウのサキシマスオウノキの腸に関連するアクティブ細菌群集は、ピロシーケンスに結合された安定同位体プロービング（SIP）により決定した。この方法論を使用して、コミュニティ内の代謝的に活性な細菌種の同定は、高分解能かつ高精度に行った。...

ジェネラリストの腸内で代謝的に活性な細菌の同定<em&gt;ハスモンヨトウリットラリス</em&gt; DNAを安定同位体を経由して使用するプロービング<sup&gt; 13</sup&gt; C-グルコース

ここでは、土壌、根圏、ルート endosphere 内細菌叢解析・増幅シーケンス...

探索ルート マイクロバイ: 土、根、およびルート Endosphere から細菌群集のデータを抽出

ここでは、空間的そして一時的変更されたホール マウント in situ...

ホール マウントIn Situハイブリダイゼーションによる目盛りの腸内微生物叢の可視化

この合理化されたプロトコルは、組織の固定から、その場で蛍光を伴う微生物の染色まで、複雑な組織サンプル 中の 細菌を検出し、画像化するワークフローを詳述しています。...

蛍光を介した蛍光による腸内微生物叢-宿主相互作用の可視化( Situ ハイブリダイゼーション、レクチン染色、イメージング)

野生 のカエノルハブディティス...

腸内微生物叢細菌を濃縮する野生の カエノアハブディティス 線虫の選択的洗浄

軸状昆虫を得るために、その卵表面を滅菌し、孵化した幼虫を引き続き軸葉を用いて飼育する。この方法は、抗生物質を投与したり、人工飼料を開発したりすることなく、他の葉を食べる昆虫にも適用することができる軸索昆虫調製のための効率的な方法を提供する。...

葉甲虫の宿主 - 腸内微生物叢相互作用研究のための組織培養苗木を用いた軸状昆虫の調製および飼育

堆肥の小宇宙は、自然界に見られる微生物の多様性を実験室にもたらし、...

カエノラブディティス・エレガンスのマイクロバイオーム研究のための微生物的に多様な自然のような環境としての堆肥小宇宙

私たちは、植物や真菌のバイオマスを含む非常に不均一で繊細なサンプルを、微生物叢やバイオフィルムとともに視覚化するための最適化された走査型電子顕微鏡プロトコルを提案します。このプロトコルにより、微生物叢組織の空間的次元を記述できます。...

Attine Ants' Gardensの微生物叢:走査型電子顕微鏡による微生物の風景の可視化

学ぶ、シロアリの腸内微生物からDNAを抽出し、Zootermopsis angusticollisの複雑な微生物叢を可視化する手法。エーストゲネシスなどの生化学経路と微生物叢の多様性を解明する。

シロアリの腸内微生物（Zootermopsis Angusticollis）からDNAを抽出し、腸内微生物の可視化

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