Differenziazione delle cellule staminali embrionali in precursori degli oligodendrociti
19 maggio 2010
Descriviamo una piccola molecola a base di protocollo per la differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo in cellule precursori degli oligodendrociti (OPC). Questo protocollo genera Olig2 + NG2 + OPC ad alta efficienza da 30 giorni di differenziazione. Abbiamo anche descrivere un metodo per generare "chiodare" OPC che può sparare potenziali d'azione.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di generare precursori di oligodendrociti da cellule staminali embrionali attraverso una serie di fasi di coltura nell'arco di 30 giorni. Ciò si ottiene generando prima corpi embrionali da cellule ES di topo per avviare la differenziazione cellulare. In una seconda fase, i corpi embrionali vengono trattati con le piccole molecole, acido retinoico e morfina pura, che inducono la differenziazione diretta delle cellule in una lega.
Precursori dei citi. Come terza fase, i corpi embrionali vengono disaggregati in singole cellule dopo altri 22 giorni. In coltura, circa l'80% delle cellule sono OPC.
Successivamente, le OPC derivate da MESC vengono trasdotte con virus bao portatori della subunità NAV 1.2 al fine di generare OPC spiking: si ottengono risultati che mostrano l'espressione del marcatore OPC e le proprietà di spiking di queste OBC derivate da MESC sulla base della microscopia a immunofluorescenza e delle registrazioni elettrofisiologiche. Ciao, sono Pong Chiang del laboratorio del Dr.Ing presso il Dipartimento di Biologia Cellulare e Anatomia Umana dell'Università della California Davis. Siamo anche affiliati allo Shriners Hospital for Children of Northern California.
Ciao, sono fiala Raj, anche lui del laboratorio Deng. Oggi vi mostreremo una procedura per la differenziazione delle cellule staminali di emron di topo in cellule precursori del genocidio. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare le proprietà dei precursori degli oligodendrociti delle cellule staminali embrionali al fine di generare cellule con un migliore potenziale terapeutico.
Quindi iniziamo. Oggi, le cellule precursori degli oligodendrociti o OPC saranno generate dalla linea di cellule staminali embrionali embrionali di topo OG due GFP. Queste cellule staminali embrionali devono essere espulse ogni tre giorni per mantenerle sane a una densità ottimale e per prevenire la differenziazione spontanea. Passaggio.
Le celle ESS quando sono al 70% di confluenza sotto una cappa a flusso laminare. Rimuovere il terreno sopra la coltura. Risciacquare con PBS e tripsina occhi con due millilitri di precaldo.
Un viaggio LE express per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Fermare la reazione e risospendere le cellule in quattro millilitri di terreno cellulare MES. Trasferire le celle in un tubo conico da 15 millilitri e pellettare a 1000 RP per cinque minuti.
Risospendere in piastra media MESL, un decimo delle cellule su uno strato confluente di alimentatori di metanfetamina irradiati in terreno cellulare MES. Dopo tre giorni, le cellule ES sono circa il 70% confluenti e sono pronte per essere passate o sospese per formare corpi embrionali per indurre corpi embrionali e iniziare la differenziazione Tripsina topo ES cellule colonie come prima e quindi risospendere le cellule in sostituzione del siero knockout o terreno KSR. Contare le cellule su un emo TER, diluire la sospensione in KSR.
Da medio a 15.000 cellule per piastra da millilitri tre millilitri in ciascun pozzetto di una coltura su piastra a sei pozzetti con attacco ultrabasso. Le celle sospese a 37 gradi Celsius per quattro giorni. Cambiare completamente il mezzo ogni due giorni.
A partire dal quarto giorno, sostituire il terreno ogni giorno il quarto giorno Integrare il KSR con acido retinoico 0,2 micromolare il quinto giorno, integrare sia con acido retinoico che con un primor micromolare carestia il sesto e il settimo giorno. Nutrire i corpi embrionali con due terreni, integrati con acido retinoico 0,2 micromolare e un micromolare primor famine. Dopo otto giorni di coltura, la maggior parte dei corpi embrionali esprime GFP ed è pronta per essere disaggregata tripsina oculare e contare le cellule come prima.
Quindi sospenderli a 3,5 volte 10 al quinto cellulare per millilitro. In OPC medium gonfiare tre millilitri della sospensione in OPC medium. Utilizzando piastre da 60 millimetri rivestite di poliornitina circa ogni settimana, le cellule diventeranno confluenti e appariranno come questo passaggio alle cellule come prima con una tripsinizzazione di tre minuti.
30 giorni dopo la sospensione originale del resus. Nel terreno KSR, le cellule mostrano le caratteristiche delle cellule precursori degli oligodendrociti per generare OPC spiking. Utilizzare OPC derivati da ESL di topo che sono tra il 50 e il 70% confluenti.
Sostituire il terreno con un XPBS per risciacquare le celle. Per introdurre la tensione di sodio gated. Subunità alfa del canale 1.2.
Utilizziamo il kit per il canale del sodio MAM posteriore. Miscelare un millilitro di componente A del MAM posteriore con quattro millilitri di un XPBS. Rimuovere il risciacquo PBS e aggiungere il componente diluito.
Incubare a 37 gradi Celsius per due ore. Sostituire l'agente di memoria posteriore con un supporto OPC potenziato con i componenti B e C come descritto nel kit. Istruzioni Incubare per altre due ore a 37 gradi Celsius.
Dopo l'incubazione, sostituire il terreno potenziato con un terreno OPC fresco. Dopo altre 24 ore di coltura, gli OPC derivati da ESL possono essere analizzati per lo spiking in questo momento. Gli EBS non mostrano alcuna fluorescenza GFP.
Gli EBS mostrano una forte espressione di GFP e sono pronti per la coltura di disaggregazione per circa 30 giorni dopo la sospensione originale del resus. Nel terreno KSR, la maggior parte delle cellule è immunopositiva per la colorazione NG due, che è coerente con l'espressione di GFP. Tuttavia, a differenza delle OPC cerebrali, queste OPC derivate dalle cellule MES non riescono a sparare potenziali d'azione anche quando le cellule sono state depolarizzate a zero millivolt.
Dopo aver introdotto la subunità NAV 1.2 per trasduzione virale, queste OPC derivate da cellule MES si eccitano e attivano potenziali d'azione. Vi abbiamo appena mostrato come differenziare le cellule staminali embrionali di topo in OPC e generare OPC spiking mediante trasduzione virale. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di conservare correttamente l'acido retinoide per morfina e FGF due e utilizzare sempre aliquote fresche, scartare l'acido retinoide in eccesso dopo l'uso.
Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per differenziare le cellule staminali embrionali di topo in cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) utilizzando piccole molecole. Il metodo raggiunge un'alta efficienza nella generazione di OPC Olig2+NG2+ entro 30 giorni e include una tecnica per produrre OPC a scatto capaci di generare potenziali d'azione.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Ricerca sulle cellule staminali
Sfondo
- Le cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) sono cruciali per la mielinizzazione nel sistema nervoso centrale.
- Le cellule staminali embrionali di topo (ES cells) possono essere differenziate in OPC per scopi di ricerca e terapeutici.
- Le piccole molecole possono dirigere efficacemente il processo di differenziazione.
- Comprendere le proprietà delle OPC può migliorare il potenziale terapeutico nei disturbi neurologici.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un protocollo affidabile per generare OPC da cellule staminali embrionali di topo.
- Investigare le proprietà elettrofisiologiche delle OPC differenziate.
- Esplorare il potenziale delle OPC a scatto nelle applicazioni terapeutiche.
Metodi utilizzati
- I corpi embrionali sono formati da cellule staminali embrionali di topo per avviare la differenziazione.
- Si utilizzano piccole molecole, inclusi l'acido retinoico e la morfina pura, per indurre la differenziazione.
- Le cellule vengono disaggregate e coltivate per arricchire le OPC.
- La trasduzione virale viene impiegata per introdurre canali del sodio voltage-gate nelle OPC.
Principali risultati
- Circa l'80% delle cellule coltivate viene identificato come OPC dopo 30 giorni.
- La microscopia immunofluorescente conferma l'espressione dei marcatori OPC.
- Le registrazioni elettrofisiologiche dimostrano le proprietà a scatto delle OPC trasdotte.
- Le OPC non trasdotte non mostrano potenziali d'azione, evidenziando l'efficacia del metodo di trasduzione virale.
Conclusioni
- Il protocollo genera efficacemente OPC dalle cellule staminali embrionali di topo.
- La trasduzione virale converte con successo le OPC in cellule a scatto.
- Questo metodo fornisce una base per studiare le OPC nel contesto della ricerca e della terapia neurologica.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Efficient differentiation of embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs) addresses a critical need for scalable, lineage-committed cell sources in CNS regenerative research. This protocol enables high-yield generation of phenotypically defined OPCs, supporting predictive confidence in early-stage target validation and functional studies. The approach facilitates mechanistic de-risking and portfolio triage for cell-based therapeutic strategies targeting demyelinating diseases.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of oligodendroglial lineage commitment and pathway specificity using defined molecular markers.
- Supports biological de-risking by generating OPCs with consistent Olig2 and NG2 expression profiles.
- Facilitates predictive confidence in functional target validation through electrophysiological characterization of OPC subpopulations.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible source of validated OPCs for downstream compound screening and phenotypic assays.
- Standardizes differentiation outputs, ensuring quantitative and scalable assay development.
- Enables reliable evaluation of candidate molecules in disease-relevant oligodendrocyte lineage systems.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro OPC models with primary tissue-derived phenotypes for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by enabling functional studies on spiking and nonspiking OPCs.
- Facilitates mechanistic de-risking for cell therapy pipeline candidates targeting demyelination.
Pipeline & Workflow Integration
This differentiation protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling early target validation, assay development, and translational research on OPC biology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on lineage commitment and functional OPC properties.
- Screening: Delivers standardized, reproducible OPC populations for quantitative assay platforms.
- Analytics: Provides immunofluorescence and electrophysiological readouts for comparative analysis of OPC subtypes.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with primary tissue models for preclinical alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for generating OPCs across multiple research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in OPC-focused research.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible OPC generation for cross-team workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency in cell therapy and neuroregeneration portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of OPC-based therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture, differentiation, and viral transduction techniques.
- Demands access to immunofluorescence microscopy and electrophysiological recording infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of differentiation and assay protocols.
- May require adaptation for different embryonic stem cell lines or species-specific models.
- Dependent on consistent reagent quality and precise timing of differentiation steps.
