Differenziazione delle cellule staminali embrionali in precursori degli oligodendrociti
19 maggio 2010
Descriviamo una piccola molecola a base di protocollo per la differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo in cellule precursori degli oligodendrociti (OPC). Questo protocollo genera Olig2 + NG2 + OPC ad alta efficienza da 30 giorni di differenziazione. Abbiamo anche descrivere un metodo per generare "chiodare" OPC che può sparare potenziali d'azione.
L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di generare precursori di oligodendrociti da cellule staminali embrionali attraverso una serie di fasi di coltura nell'arco di 30 giorni. Ciò si ottiene generando prima corpi embrionali da cellule ES di topo per avviare la differenziazione cellulare. In una seconda fase, i corpi embrionali vengono trattati con le piccole molecole, acido retinoico e morfina pura, che inducono la differenziazione diretta delle cellule in una lega.
Precursori dei citi. Come terza fase, i corpi embrionali vengono disaggregati in singole cellule dopo altri 22 giorni. In coltura, circa l'80% delle cellule sono OPC.
Successivamente, le OPC derivate da MESC vengono trasdotte con virus bao portatori della subunità NAV 1.2 al fine di generare OPC spiking: si ottengono risultati che mostrano l'espressione del marcatore OPC e le proprietà di spiking di queste OBC derivate da MESC sulla base della microscopia a immunofluorescenza e delle registrazioni elettrofisiologiche. Ciao, sono Pong Chiang del laboratorio del Dr.Ing presso il Dipartimento di Biologia Cellulare e Anatomia Umana dell'Università della California Davis. Siamo anche affiliati allo Shriners Hospital for Children of Northern California.
Ciao, sono fiala Raj, anche lui del laboratorio Deng. Oggi vi mostreremo una procedura per la differenziazione delle cellule staminali di emron di topo in cellule precursori del genocidio. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare le proprietà dei precursori degli oligodendrociti delle cellule staminali embrionali al fine di generare cellule con un migliore potenziale terapeutico.
Quindi iniziamo. Oggi, le cellule precursori degli oligodendrociti o OPC saranno generate dalla linea di cellule staminali embrionali embrionali di topo OG due GFP. Queste cellule staminali embrionali devono essere espulse ogni tre giorni per mantenerle sane a una densità ottimale e per prevenire la differenziazione spontanea. Passaggio.
Le celle ESS quando sono al 70% di confluenza sotto una cappa a flusso laminare. Rimuovere il terreno sopra la coltura. Risciacquare con PBS e tripsina occhi con due millilitri di precaldo.
Un viaggio LE express per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Fermare la reazione e risospendere le cellule in quattro millilitri di terreno cellulare MES. Trasferire le celle in un tubo conico da 15 millilitri e pellettare a 1000 RP per cinque minuti.
Risospendere in piastra media MESL, un decimo delle cellule su uno strato confluente di alimentatori di metanfetamina irradiati in terreno cellulare MES. Dopo tre giorni, le cellule ES sono circa il 70% confluenti e sono pronte per essere passate o sospese per formare corpi embrionali per indurre corpi embrionali e iniziare la differenziazione Tripsina topo ES cellule colonie come prima e quindi risospendere le cellule in sostituzione del siero knockout o terreno KSR. Contare le cellule su un emo TER, diluire la sospensione in KSR.
Da medio a 15.000 cellule per piastra da millilitri tre millilitri in ciascun pozzetto di una coltura su piastra a sei pozzetti con attacco ultrabasso. Le celle sospese a 37 gradi Celsius per quattro giorni. Cambiare completamente il mezzo ogni due giorni.
A partire dal quarto giorno, sostituire il terreno ogni giorno il quarto giorno Integrare il KSR con acido retinoico 0,2 micromolare il quinto giorno, integrare sia con acido retinoico che con un primor micromolare carestia il sesto e il settimo giorno. Nutrire i corpi embrionali con due terreni, integrati con acido retinoico 0,2 micromolare e un micromolare primor famine. Dopo otto giorni di coltura, la maggior parte dei corpi embrionali esprime GFP ed è pronta per essere disaggregata tripsina oculare e contare le cellule come prima.
Quindi sospenderli a 3,5 volte 10 al quinto cellulare per millilitro. In OPC medium gonfiare tre millilitri della sospensione in OPC medium. Utilizzando piastre da 60 millimetri rivestite di poliornitina circa ogni settimana, le cellule diventeranno confluenti e appariranno come questo passaggio alle cellule come prima con una tripsinizzazione di tre minuti.
30 giorni dopo la sospensione originale del resus. Nel terreno KSR, le cellule mostrano le caratteristiche delle cellule precursori degli oligodendrociti per generare OPC spiking. Utilizzare OPC derivati da ESL di topo che sono tra il 50 e il 70% confluenti.
Sostituire il terreno con un XPBS per risciacquare le celle. Per introdurre la tensione di sodio gated. Subunità alfa del canale 1.2.
Utilizziamo il kit per il canale del sodio MAM posteriore. Miscelare un millilitro di componente A del MAM posteriore con quattro millilitri di un XPBS. Rimuovere il risciacquo PBS e aggiungere il componente diluito.
Incubare a 37 gradi Celsius per due ore. Sostituire l'agente di memoria posteriore con un supporto OPC potenziato con i componenti B e C come descritto nel kit. Istruzioni Incubare per altre due ore a 37 gradi Celsius.
Dopo l'incubazione, sostituire il terreno potenziato con un terreno OPC fresco. Dopo altre 24 ore di coltura, gli OPC derivati da ESL possono essere analizzati per lo spiking in questo momento. Gli EBS non mostrano alcuna fluorescenza GFP.
Gli EBS mostrano una forte espressione di GFP e sono pronti per la coltura di disaggregazione per circa 30 giorni dopo la sospensione originale del resus. Nel terreno KSR, la maggior parte delle cellule è immunopositiva per la colorazione NG due, che è coerente con l'espressione di GFP. Tuttavia, a differenza delle OPC cerebrali, queste OPC derivate dalle cellule MES non riescono a sparare potenziali d'azione anche quando le cellule sono state depolarizzate a zero millivolt.
Dopo aver introdotto la subunità NAV 1.2 per trasduzione virale, queste OPC derivate da cellule MES si eccitano e attivano potenziali d'azione. Vi abbiamo appena mostrato come differenziare le cellule staminali embrionali di topo in OPC e generare OPC spiking mediante trasduzione virale. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di conservare correttamente l'acido retinoide per morfina e FGF due e utilizzare sempre aliquote fresche, scartare l'acido retinoide in eccesso dopo l'uso.
Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per la differenziazione di cellule staminali embrionali di topo in cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) mediante l'uso di molecole di piccole dimensioni. Il metodo consente di ottenere con elevata efficienza OPC Olig2+NG2+ entro 30 giorni e include una tecnica per produrre OPC attivi elettricamente, in grado di generare potenziali d'azione.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Ricerca sulle cellule staminali
Sfondo
- Le cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) sono fondamentali per la mielinizzazione nel sistema nervoso centrale.
- Le cellule staminali embrionali del topo (cellule ES) possono essere differenziate in OPC per scopi di ricerca e terapeutici.
- I piccoli molecole possono indirizzare efficacemente il processo di differenziazione.
- Comprendere le proprietà degli OPC può potenziare il potenziale terapeutico nelle malattie neurologiche.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo affidabile per la generazione di OPC a partire da cellule staminali embrionali di topo.
- Indagare le proprietà elettrofisiologiche degli OPC differenziati.
- Esplorare il potenziale terapeutico degli OPC attivabili elettricamente.
Metodi Utilizzati
- Si formano corpi embrionali da cellule staminali embrionali di topo per avviare la differenziazione.
- Si utilizzano molecole di piccole dimensioni, tra cui acido retinoico e morfina pura, per indurre la differenziazione.
- Le cellule vengono disgregate e coltivate per arricchire la popolazione di OPC.
- La trasduzione virale viene impiegata per introdurre canali del sodio sensibili al voltaggio negli OPC.
Risultati principali
- Circa l'80% delle cellule coltivate viene identificato come OPC dopo 30 giorni.
- La microscopia a immunofluorescenza conferma l'espressione dei marcatori degli OPC.
- Le registrazioni elettrofisiologiche dimostrano le proprietà di generazione di potenziali d'azione negli OPC transdotti.
- Gli OPC non transdotti non mostrano potenziali d'azione, evidenziando l'efficacia del metodo di transduzione virale.
Conclusioni
- Il protocollo genera efficacemente OPC a partire da cellule staminali embrionali di topo.
- La trasduzione virale converte con successo gli OPC in cellule spiking.
- Questo metodo fornisce una base per lo studio degli OPC nel contesto della ricerca e della terapia neurologica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
La differenziazione efficiente delle cellule staminali embrionali in cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) risponde a un'esigenza fondamentale di fonti cellulari scalabili e compromesse verso una specifica linea cellulare nella ricerca rigenerativa del sistema nervoso centrale. Questo protocollo consente la generazione ad alto rendimento di OPC fenotipicamente definiti, sostenendo una valutazione predittiva affidabile nella validazione precoce dei bersagli e negli studi funzionali. L'approccio facilita la riduzione del rischio meccanicistica e la selezione di portafogli per strategie terapeutiche cellulari mirate a malattie demielinizzanti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi dell'impegno della linea oligodendrogliale e della specificità dei percorsi utilizzando marcatori molecolari definiti.
- Supporta la riduzione del rischio biologico generando OPC con profili di espressione costanti di Olig2 e NG2.
- Facilita la previsione affidabile della validazione funzionale dei bersagli attraverso la caratterizzazione elettrofisiologica delle sottopopolazioni di OPC.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce una fonte riproducibile di OPC validati per lo screening di composti e saggi fenotipici successivi.
- Standardizza i risultati della differenziazione, garantendo lo sviluppo di saggi quantitativi e scalabili.
- Consente una valutazione affidabile di molecole candidate in sistemi della linea oligodendrocitaria rilevanti per la malattia.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i modelli di OPC in vitro ai fenotipi derivati da tessuti primari per garantire continuità traslazionale.
- Permette decisioni di avanzamento proporzionate al rischio, abilitando studi funzionali su OPC con e senza potenziali d'azione.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistica per i candidati nella pipeline di terapia cellulare mirati alla demielinizzazione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo di differenziazione si inserisce nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica, consentendo una validazione precoce del bersaglio, lo sviluppo di saggi e ricerche traslazionali sulla biologia delle OPC.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sull'impegno di linea e sulle proprietà funzionali delle OPC.
- Screening: Fornisce popolazioni standardizzate e riproducibili di OPC per piattaforme quantitative di saggio.
- Analisi: Offre letture di immunofluorescenza ed elettrofisiologiche per l'analisi comparativa di sottotipi di OPC.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati ottenuti in vitro con modelli di tessuto primario per allinearli a scopi preclinici.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro riutilizzabile per la generazione di OPC in più programmi di ricerca.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella ricerca focalizzata sugli OPC.
- Valore operativo: Fornisce una generazione standardizzata, scalabile e riproducibile di OPC per flussi di lavoro condivisi tra team diversi.
- Valore strategico: Migliora il processo decisionale di avanzamento o interruzione dei progetti e l'efficienza nell'uso del capitale nei portafogli di terapie cellulari e neuro rigenerazione.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio dei candidati terapeutici basati sugli OPC.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura di cellule staminali, nella differenziazione e nelle tecniche di trasduzione virale.
- Richiede l'accesso a infrastrutture per la microscopia a immunofluorescenza e la registrazione elettrofisiologica.
- Necessita di una rigorosa standardizzazione intergruppo dei protocolli di differenziazione e dei saggi.
- Potrebbe richiedere adattamenti per diverse linee di cellule staminali embrionali o modelli specifici per specie.
- Dipende dalla costante qualità dei reagenti e dai tempi precisi dei passaggi di differenziazione.
