Name: Stabilire intracranica xenotrapianti Brain Tumor Con successiva analisi della crescita tumorale e risposta alla terapia con Imaging bioluminescenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-13T17:55:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Impara a stabilire xenotrapianti intracranici di tumori cerebrali umani in topi atimici mediante iniezione stereotassica. Questo metodo consente il monitoraggio in tempo reale della crescita tumorale e della risposta terapeutica tramite imaging bioluminescente.

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1. Preparazione cellule del tumore. Cellule per xenotrapianti tumore al cervello umano può essere acquistato sia da tumori propagata come escrescenze sottocutaneo in topi atimici, o da colture cellulari. L'utilizzo di entrambe le fonti cella è discusso più avanti, insieme a dimostrazione di un metodo per l'impianto delle cellule. Per preparare le cellule dai tumori sottocutanei per il trasferimento al comparto intracranici, i tumori asportati fianco sono collocati in capsule di Petri, dove il tessuto è inizialmente tritato con un bisturi e poi meccanicamente interrotta da pipettaggio ripetitivo per creare una sospensione aggregato di cellule 1. La sospensione aggregato di cellule viene poi fatto passare attraverso una maglia di nylon 70 mM filtro per produrre un'unica sospensione cellulare adeguata per iniezioni intracraniche. La sospensione cellulare viene centrifugato a 1000 rpm per 10 minuti a 4 ° C e il supernatante aspirato prima di risospendere il pellet cellulare in un volume adeguato di siero senza mezzi per ottenere una concentrazione finale di lavoro (vedi sotto). Per la preparazione di linee cellulari stabilizzate per l'impianto intracranici, le cellule vengono raccolte a monostrati trypsinizing, o attraverso la raccolta di culture sospensione neurosfere, poi centrifugazione e risospendere le cellule come sopra indicato 2. Il numero di cellule iniettate è variabile dipendente sul posto neuroanatomiche di iniezione. Per preparazioni iniettabili sopratentoriali abbiamo regolarmente iniettare 3-5 x 10 5 cellule in 3 ml di siero-multimediale gratuito (DMEM), mentre per il tronco encefalico iniezioni 3, da un minimo di 5 x 10 4 cellule vengono iniettate in 0,5 microlitri. Iniettare volumi maggiori di quanto raccomandato può causare reflusso delle cellule tumorali attraverso il tratto dell'ago, con esofitica risultante (Figura 1), piuttosto che la crescita dei tumori intracranici. Dopo il ritiro del campione per l'iniezione intracranica, la sospensione cellulare residua deve essere posto in ghiaccio, con contenuti misti di frequente per mantenere la concentrazione adeguata, mentre il completamento stabilimento intracranica del tumore tra i membri di una serie di iniezione. 2. Cella impianto del tumore Si noti, tutte le procedure descritte di seguito sono stati esaminati e approvati dal Utilizzare animali Istituzionale e Comitato Cura presso l'Università di California San Francisco. <ol><li> L'area chirurgica deve essere preparato a spruzzo tutte le superfici con un disinfettante, come soluzione di clorexidina al 2%. Dopo aver usato il disinfettante, le seguenti forniture deve essere posto in zona chirurgica: <ul><li> Riscaldamento pad per mantenere la temperatura corporea del mouse </li><li> Due piccoli piatti Petri, uno contenente perossido di idrogeno al 3%, e uno contenente 2% di clorexidina </li><li> Garza sterile e cotone tamponi </li><li> Bisturi sterile monouso </li><li> Autoclave cucitrice chirurgica </li></ul></li><li> Per l'anestesia uno iniettato anestetico dovrebbe essere utilizzato, in genere uno ketamina-xylazina miscela. </li><li> Una volta che il mouse è anestetizzato, il cuoio capelluto è preparato da tampone più volte con un pezzo di garza sterile immerso nella soluzione di clorexidina. Unguento occhio deve essere applicato per mantenere l'umidità adeguata durante la procedura. Usando un bisturi sterile, completo di un'incisione sagittale il parieto-occipitale osso, circa 1 cm di lunghezza. La superficie del cranio esposto è poi puliti con un tampone di cotone imbevuto di una soluzione di perossido di idrogeno al 3%. Il bregma dovrebbe essere evidente a questo punto (vedi video). </li><li> Le coordinate per l'iniezione di cellule tumorali possono variare secondo il sito desiderato per lo stabilimento di tumore. Il seguente rappresenta la procedura che usiamo per tumore intracerebrale stabilimento 2 in una posizione neuroanatomici in cui molti pazienti affetti da tumore al cervello esperienza di sviluppo del tumore. Altre località di interesse nella ricerca sul cervello tumore includono il ponte, per la modellazione anatomica dei tumori del tronco encefalico 3, e le iniezioni subdurale per la modellazione l'ubicazione dei tumori meningei 4. Prima dell'iniezione di cellule tumorali, utilizzare una sterile 25 ago appuntito manometro per forare il cranio a 2 mm a destra del bregma e 1 mm anteriore alla sutura coronale, creando un varco per l'iniezione di cellule tumorali (vedi video). Questa procedura funziona bene sia per i topi e ratti (22 gauge per i ratti). </li><li> Prima di disegnare le cellule nella siringa, mescolare il contenuto della sospensione cellulare toccando con un dito. Caricare la siringa con la quantità desiderata di sospensione cellulare, facendo attenzione a non creare bolle d'aria. L'esterno della siringa deve poi essere puliti con un tampone imbevuto di alcool per pulire la parte esterna priva di cellule aderenti, che aiuterà a prevenire creazione e la crescita tumorale extracranica (Figura 1A). Per garantire che la profondità di iniezione appropriato si ottiene, usare un bisturi per tagliare tre millimetri al largo della punta di una punta P20 pipetteman. Questa sezione della punta può essere montato sulla siringa e agirà per limitare la profondità di iniezione, e sarà inoltre assicurare che il tip l'ago della siringa di 3 mm dalla parte inferiore del cranio. Posizionare la siringa perpendicolare al cranio e nel foro creato in precedenza, e iniettare lentamente la sospensione cellulare (una sospensione 3μL deve essere iniettato in un periodo di 1 minuto). Un angolo inadeguato di inserimento siringa può provocare l'iniezione intraventricolare di cellule e la successiva diffusione spinale (Fig. 1B: Destra) Al termine dell'iniezione, lasciare l'ago in posizione per un altro minuto, poi lentamente ritirarsi (vedi video): questi passi aiuteranno a ridurre riflusso delle cellule tumorali. </li><li> In alternativa all'approccio autonomamente sia a mano libera per l'impianto delle cellule tumorali intracranici 5, si può usare un piccolo telaio stereotassico animale (F panel di visione schematica), che promuove in genere luogo di iniezione più consistente, ma a spese di notevoli quantità di termini della procedura. Nella nostra esperienza, due membri del personale chirurgico può iniettare fino a 60 topi / ora quando si usa l'approccio a mano libera, mentre la massima velocità di iniezione con una piccola cornice stereotassica animali è di circa 15 topi / ora. Espediente procedurale è una considerazione importante quando si iniettano grandi serie di topi, e aiuta a ridurre il tempo in cui sono lasciati cellule tumorali, da iniettare, sul ghiaccio. </li><li> Pulire il cranio con perossido di idrogeno al 3% e asciugare con un tampone sterile di cotone asciutto. Applicare la cera sterile osso al foro. Utilizzando una pinza, disegnare insieme il cuoio capelluto sopra il teschio e fiocco a chiudere. Ottimale per la guarigione, il cuoio capelluto devono essere pinzati con il derma di ogni lato del cuoio capelluto contro l'altra (contro la parte inferiore parte inferiore). Il cuoio capelluto pinzati devono essere puliti con soluzione di Clorexidina, buprenorfina e poi somministrato per via sottocutanea per post-operatorio del dolore. </li><li> Monitorare tutti i mouse dopo l'intervento fino a diventare ambulanti e mantenere la normale attività. Tipicamente, il tempo di recupero è di circa 30 minuti. </li></ol> 3. Monitoraggio bioluminescenza della crescita tumorale <ol><li> Sfondo. Di imaging bioluminescenza (BLI) si basa sulla ossidazione dei luciferina [d-(-) -2 - (60-idrossi-20-benzothiazolyl)-thiazone-4-carbossilico] in presenza di ossigeno e di adenosina trifosfato (ATP). Questa reazione è catalizzata dalla luciferasi enzima che converte l'energia chimica in fotoni con conseguente emissione di luce. Le cellule umane possono essere modificati per esprimere la luciferasi (vedi sotto), con solo luciferasi che esprimono cellule capaci di emettere luce in presenza del substrato luciferina. C'è luminescenza livello minimo da animali trattati con luciferina ospita, in modo tale che vi è un molto favorevole rapporto segnale-rumore per rilevare le emissioni di luminescenza da cellule tumorali luciferasi modificati, consentendo il monitoraggio altamente sensibile della crescita tumorale e risposta alla terapia in vivo. Inoltre, luciferasi e il suo substrato, luciferina, hanno dimostrato di essere non tossico per le cellule di mammifero, e abbiamo osservato differenze funzionali tra cellule che esprimono luciferasi rispetto ai corrispondenti cellule non modificate. Luciferina attraversa facilmente le membrane cellulari e la barriera emato-encefalica dopo intraperitoneale (ip) o endovenosa (ev) nei topi, consentendo in tal modo l'imaging di ogni scomparto che contiene luciferasi modificato cellule. Il livello di emissione di fotoni e lo spettro della luce emessa dalla luciferasi modificati cellule è sufficiente per penetrare nei tessuti degli animali ricerca piccoli, come topi e ratti, e può essere rilevata esternamente con scarsa illuminazione termocamere. La natura non invasiva di imaging bioluminescenza permette il monitoraggio ripetuto di crescita tumorale e risposta alla terapia nei soggetti singolo animale. </li><li> Fonti di cellule impiantate devono essere stabilmente modificata per l'espressione lucciola luciferasi. Tali fonti di cellule possono essere acquistati o ottenuti nei singoli laboratori con lentivirus che sono state costruite per l'espressione costitutiva della luciferasi. Si consiglia vivamente l'uso di cellule modificate con lentivirus codifica luciferasi, piuttosto che plasmide, per garantire la stabilità l'espressione cellulare della luciferasi in vivo, che è necessario per l'imaging luminescenza quantitative per fornire un'indicazione precisa delle variazioni del carico tumorale di soggetti singoli animali che vengono ripetutamente ripreso nel corso di un esperimento. </li><li> BLI monitoraggio. Si consiglia di effettuare l'imaging quantitativo bioluminescenza (qBLI) 1x-2x settimanale, con inizio una settimana dopo l'iniezione delle cellule tumorali. Il nostro qBLI sia effettuato utilizzando i IVIS Lumina Imaging Station (Caliper Life Sciences), ed i nostri risultati indicano dati simili si ottengono utilizzando il Lumina IVIS, IVIS il 150 o il 200 stazione di imaging IVIS. In preparazione per l'imaging, i topi sono simultaneamente anestetizzati con ketamina / xylazina e somministrato luciferina (D-Luciferin sale di potassio, 150 mg / kg, Caliper Life Sciences) tramite iniezione intraperitoneale, con i topi ripreso 12 minuti dopo l'iniezione. La farmacocinetica di luciferina indicano che il tempo tra amministrazione di luciferina e la determinazione della luminescenza cellulare dovrebbe essere compresa tra 10-15 minuti dopo l'iniezione di luciferina, al fine di ottenere la massima emissione di luminescenza e grande sensibilità di rilevazione. Il periodo di tempo selezionato entro l'intervallo di 10-15 minuti di tempo dovrebbe essere mantenuto il più costante tra gli animali che si sta creando l'immagine. E 'estremamente importante per mantenere la coerenza nel tempo tra iniezione di luciferina e ottenere letture BLI. Regioni di interesse che comprende l'area intracranica del segnale vengono definite mediante software di immagini di vita (Figura 2), e il photons/s/sr/cm2 totale (fotoni al secondo per steradiante per cm quadrato) sono registrati (vedi video). </li><li> Analisi dei dati. Mentre la crescita tumorale e risposta alla terapia sono monitorati nei singoli animali, consigliamo vivamente i gruppi di trattamento di almeno 8 per aumentare la certezza statistica di conclusioni concernenti la risposta del tumore, o la loro mancanza, alla terapia. Per quanto riguarda la presentazione dei risultati qBLI, letture luminescenza vengono convertiti in valori normalizzati dividendo luminescenza ogni mouse s, ottenuti durante e dopo il completamento del regime terapeutico, con la sua luminescenza corrispondente pretrattamento massima di lettura 6,7. Per l'analisi di sopravvivenza, di Kaplan-Meier stimatore 8 è usato, e da cui sono generate le curve di sopravvivenza, sopravvivenza mediana ei valori determinati. Le differenze tra le curve di sopravvivenza sono confrontati con un log-rank test 9. </li><li> Recupero del cervello per la successiva analisi di tumore trattati e non trattati. Al momento l'eutanasia degli animali, il cervello del mouse deve essere rapidamente asportata (vedi video), e sia messo in formalina per successive analisi della morfologia del tumore e di immunoistochimica, o dovrebbe essere montato in ottobre per il congelamento del campione. </li></ol> 4. Rappresentante Risultati Nell'esempio mostrato in figura 3a, topi che ricevevano intracranica iniezione di cellule tumorali sono stati monitorati per luminescenza intracranica fino successivi valori di luminescenza significa indicato progressiva crescita del tumore, e al quale la terapia di tempo è stato avviato (a partire grigio freccia al giorno 34: erlotinib somministrato ogni giorno a 150 mg / kg fino a quando l'eutanasia richiesto). Valori di luminescenza per ogni mouse sono impostati su un valore normalizzato di 1 al momento di iniziare la terapia, con letture luminescenza successive per ogni mouse normalizzato al suo valore finale di imaging pre-trattamento. A titolo di esempio, un mouse con un finale di pre-trattamento lettura luminescenza di 2,0 x 10 7 fotoni / sec al giorno 34, la cui luminescenza era aumentato a 6,0 x 10 7 fotoni / sec al giorno 38, avrebbe un valore di 38 luminescenza normalizzato giorni di 3,0. Significa bioluminescenza normalizzato e corrispondente errore standard per il controllo e gruppi di trattamento sono riportati per ogni punto di tempo di imaging. In questo esempio, una differenza significativa della luminescenza normalizzato è evidente al primo punto imaging in tempo successivo l'inizio della terapia (giorno 38), con la differenza di luminescenza gruppo significa che mostrano un ulteriore aumento in momenti successivi. Nella maggior parte dei casi, antitumorale della terapia, come indicato dalla qBLI, è accompagnata da una corrispondente differenza significativa nella sopravvivenza (cioè, p &lt;0,05), come nel caso di specie (Figura 3B). Pannelli 3C e 3D mostrare adiacente ematossilina e eosina e sezioni colorate anti-EGFR di cervello di topo ottenute al momento della eutanasia, dopo il posizionamento del cervello asportato in formalina e successive paraffina-embedding di sezionamento. <img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Indicazioni di errori iniezione intracranica. A) esofitica (extracraniche) la crescita del tumore (cerchio rosso) può essere causato da troppo grande un volume di iniezione, sospensione cellulare residua attaccato alla siringa, oppure di revocare la siringa troppo rapidamente dopo l'iniezione di cellule tumorali. B) Iniettare cellule tumorali nei ventricoli spinale può causare la divulgazione di tumore (il mouse a destra), in contrasto correttamente iniettato cellule tumorali, il segnale per i quali rimane localizzata nel sito di iniezione (mouse a sinistra). <img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Calore mappa rappresentazioni dell'immagine di intensità bioluminescenza per topi rappresentante di controllo (a sinistra) e il trattamento (a destra) i gruppi di un esperimento di risposta alla terapia. Il software immagine vivente può essere impostato per definire le aree di interesse (cerchi rossi), o operatori strumento può definire regioni di interesse manualmente. Per l'utilizzo di immagini come queste per la costruzione di figura, si consiglia che l'operatore strumento mostra le immagini mappa di calore utilizzando lo stesso calore gamma bioluminescenza mappa (parte superiore della figura), a fornire una rappresentazione visiva della portata della bioluminescenza differenza tra soggetti animali. <img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Bioluminescenza, la sopravvivenza e l'analisi del tessuto tumorale da un esperimento in cui la risposta terapeutica è evidente. A) Terreno di letture di bioluminescenza significa per il controllo e topi gruppo di trattamento, con errore standard indicato per ogni punto di imaging. B) appezzamento di sopravvivenza per i topi stessi; p-value determinato attraverso l'uso di log-rank test 7. C) H &amp; E macchiato sezione di cervello di topo con tumore. D) EGFR sezione macchiato. E ed F) Ingrandimenti delle aree indicate dai pannelli C e D, rispettivamente, con E riquadro con colorazione negativa per proteina soppressore del tumore di PTEN.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ortotopico (intracranica) tumore al cervello stabilimento xenotrapianto fornisce un microambiente adeguato 10 per il cancro modellazione sistema nervoso centrale da testare per la risposta terapeutica. Questo tipo di modellazione fornisce inoltre informazioni relative all&#39;accesso terapeutico al cervello e tumore al cervello, che è di fondamentale importanza per determinare se un agente sperimentale dovrebbe essere avanzata per la valutazione di studi clinici nei pazienti. Poiché la quantità di tumore xenograft intracranica non può essere misurata direttamente, ad esempio per calibri, il monitoraggio longitudinale della crescita tumorale intracranica e la risposta alla terapia richiede imaging non invasiva, con la nostra imaging bioluminescenza dell&#39;esperienza che indica come l&#39;approccio più pratico per gli esperimenti il ​​cui obiettivo primario sta valutando l&#39;estensione della risposta del tumore alla terapia. Quando i risultati di imaging bioluminescenza sono combinati con l&#39;analisi di sopravvivenza soggetto animale, i due insiemi di dati forniscono un approccio potente e affidabile per la valutazione sperimentale dell&#39;efficacia terapeutica. Infine, è estremamente importante che intracranica xenotrapianti di tumori al cervello sono raccolti da soggetti animali sacrificati al fine di valutare gli effetti morfologici e molecolari della terapia, e per questo preferiamo resezione intero cervello al momento di eutanasia, con la conservazione del cervello asportato per successive analisi. Considerando che la presentazione precedente è stato fatto specifico per la ricerca del tumore al cervello, i concetti sono certamente generalizeable ad altri tumori umani che sono suscettibili di modellazione ortotopico nei roditori.

<table><tbody><tr><td>Lame da bisturi monouso</td><td>Feather Safety Razor Co, Ltd.</td><td>2975</td><td>No.21</td></tr><tr><td>Pad riscaldante</td><td>Dunlap</td><td>HP950</td><td></td></tr><tr><td>Garza</td><td>Fisher Scientific</td><td>22028563</td><td></td></tr><tr><td>Cotone idrofilo</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-100</td><td></td></tr><tr><td>Clorhexidina al 2%</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9756995</td><td></td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno al 3%</td><td>Fisher Scientific</td><td>H312P-4</td><td></td></tr><tr><td>Ago da 25 g</td><td>BD Biosciences</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Siringa microaffilata da 10 µl di Hamilton</td><td>Hamilton Co</td><td>20734</td><td></td></tr><tr><td>Stapler per pelle e punti metallici</td><td>Stoelting Co.</td><td>59020</td><td></td></tr><tr><td>Forza stereotassica</td><td>Stoelting Co.</td><td>51725</td><td></td></tr><tr><td>Software Living Image</td><td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Category/ID/Living%20Image%20Software" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Caliper Life Sciences</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-luciferina</td><td>Gold Biotechnology</td><td>LUCK-1G</td><td>Sale di potassio</td></tr><tr><td>Xenogen Lumina</td><td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Category/ID/IVIS%20Series" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Caliper Life Sciences</a></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

stabilire intracranica xenotrapianti brain tumor con successiva analisi della crescita tumorale e risposta alla terapia con imaging bioluminescenza

Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging

Modelli di trapianto utilizzando cellule umane di tumore al cervello hanno servito una funzione essenziale in neuro-oncologia di ricerca per molti anni. In passato, la procedura più comunemente utilizzata per il consumo umano stabilimento xenograft tumore consisteva nella raccolta di cellule da fiaschi cultura, seguita dalla iniezione sottocutanea delle cellule raccolte in topi immunocompromessi. Che tale approccio vede ancora frequente uso in molti laboratori, c&#39;è stato un significativo spostamento di enfasi negli ultimi dieci anni verso la creazione xenotrapianto ortotopica, che, nel caso di tumori cerebrali, richiede l&#39;iniezione di cellule tumorali in adeguate strutture neuroanatomiche. Perché stabilimento xenotrapianto intracranica elimina la possibilità di monitorare la crescita del tumore attraverso la misurazione diretta, come ad esempio mediante l&#39;uso di pinze, spostamento di interesse verso modelli ortotopico tumore cerebrale xenotrapianto ha reso necessario l&#39;utilizzo di imaging non invasiva per la valutazione della massa tumorale in animali ospitante. Dei metodi di imaging attualmente disponibili, il monitoraggio bioluminescenza è generalmente considerato di offrire la migliore combinazione di sensibilità, opportunità e costi. Qui dimostreremo procedure per l&#39;istituzione ortotopica tumore al cervello, e per monitorare la crescita tumorale e la risposta al trattamento durante il test terapie sperimentali.

Luciferasi modificati xenotrapianti di tumori al cervello umano può essere stabilita intracranially in topi atimici, con successivo monitoraggio della crescita tumorale e la risposta alla terapia con l&#39;imaging bioluminescenza. In combinazione con l&#39;analisi di sopravvivenza, il monitoraggio bioluminescenza è uno strumento di ricerca indispensabile per test pre-clinici di terapie che sono considerati per il trattamento dei tumori cerebrali.

Stabilire intracranica xenotrapianti Brain Tumor Con successiva analisi della crescita tumorale e risposta alla terapia con Imaging bioluminescenza

I modelli di trapianto che utilizzano cellule di tumore cerebrale umano hanno svolto una funzione essenziale nella ricerca neuro-oncologica per molti anni. In passato, i più...

Per molti anni, i modelli di trapianto che utilizzano cellule tumorali cerebrali umane hanno coinvolto principalmente l'iniezione sottocutanea in topi immunocompromessi. Recentemente, si è assistito a un passaggio verso l'iniezione nella struttura anatomica appropriata: il cervello.In questo articolo video, i tumori intracranici vengono indotti nei topi mediante un metodo di iniezione in cui viene creato un foro nel cranio e un ago viene utilizzato per iniettare cellule tumorali modificate per l'imaging bioluminescente. Dopo l'intervento chirurgico, viene monitorata la velocità di crescita del tumore e la risposta al trattamento. Mediante una stazione per imaging bioluminescente, analisi della sopravvivenza e analisi istopatologiche ed espressive delle proteine, i dati ottenuti possono quindi essere utilizzati per valutare l'efficacia di terapie sperimentali per i tumori cerebrali.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della neuro-oncologia, ad esempio se l'agente antitumorale possa raggiungere il cervello. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia dei tumori cerebrali nei pazienti, poiché stiamo trattando tumori cerebrali umani sviluppati in un ospite animale. Lavorando sotto una cappa a flusso laminare. Preparare le cellule tumorali sottocutanee per il trasferimento nel compartimento intracranico.Iniziare ponendo i tumori escissi dai fianchi in piatti per colture cellulari. Utilizzando un bisturi, tritare il tessuto. Successivamente, con una pipetta, disgregare meccanicamente il tessuto per creare una sospensione di aggregati cellulari.Successivamente, far passare la sospensione di aggregati cellulari attraverso un setaccio con filtro in nylon da 70 micrometri raccogliendola in un tubo con fondo rotondo. Ripetere questo processo per un totale di tre volte al fine di ottenere una sospensione monocellulare adatta per iniezione intracranica. Centrifugare la sospensione a 1000 giri al minuto per 10 minuti a quattro gradi Celsius; al termine della centrifugazione, aspirare il sopranatante quindi risospendere i pellet cellulari in un volume appropriato di mezzo privo di siero per ottenere una concentrazione finale di lavoro, come alternativa alla disaggregazione di tumori sottocutanei.Le cellule tumorali possono essere raccolte da colture cellulari contenenti linee cellulari di tumore cerebrale stabilite. Raccogliere le cellule mediante tripsina in centrifugazione.Dopo la centrifugazione Resus, sospendere le cellule nel volume appropriato di DMEM privo di siero per iniezioni sovratentoriali effettuate manualmente. Preparare da tre a cinque volte 10 alla cinque cellule in tre microlitri. Disinfettare l'area chirurgica spruzzando tutte le superfici con clorhexidina al 2%.Successivamente, posizionare i seguenti materiali nell'area chirurgica: una piastra riscaldante per mantenere la temperatura corporea del topo, due piccole capsule di Petri, una contenente perossido di idrogeno al 3% e l'altra clorhexidina al 2%, garze sterili e bastoncini di cotone, bisturi monouso sterili e un cucitrice chirurgica sterilizzata in autoclave.Dopo aver anestetizzato il topo con una miscela di chetamina e xilazina, detergere più volte l'area chirurgica utilizzando garze sterili imbevute di clorexidina. Applicare un unguento per mantenere un'adeguata umidità durante l'intervento. Utilizzando un bisturi sterile, effettuare un'incisione sagittale sulla regione paroccipitale, lunga circa un centimetro.Utilizzando un bastoncino di cotone imbevuto di soluzione di perossido di idrogeno al 3%, pulire la superficie esposta del cranio. A questo punto, il bgma dovrebbe essere visibile per creare un'apertura per l'iniezione delle cellule tumorali. Usare un ago sterile da 25 gauge per forare il cranio.Due millimetri a destra del bgma e un millimetro in avanti rispetto alla sutura coronale. Mescolare il contenuto della sospensione cellulare agitando leggermente. Caricare la siringa con la quantità desiderata di sospensione cellulare.Evitare la formazione di bolle d'aria. Pulire l'esterno della siringa con un batuffolo di alcol per rimuovere eventuali cellule aderenti. Questo aiuterà a prevenire l'insediamento e la crescita di tumori extracranici, come mostrato qui, per garantire il raggiungimento della corretta profondità di iniezione.Quando non si utilizza un apparato stereotassico per piccoli animali, usare un bisturi per tagliare tre millimetri dall'estremità appuntita di una punta per pipetta P20. Posizionare il tratto tagliato sull'estremità della siringa per limitare la profondità di iniezione, in modo che la punta dell'ago della siringa si trovi a tre millimetri dalla superficie inferiore del cranio. Pertanto, il passaggio successivo della procedura è probabilmente l'aspetto più difficile dell'intero metodo durante l'esecuzione dell'iniezione seguente; ottenere la morte appropriata e una somministrazione accurata è di fondamentale importanza per garantire che il tumore si sviluppi e cresca nella corretta localizzazione cerebrale.Successivamente, posizionare una siringa perpendicolarmente al cranio nel foro e iniettare lentamente la sospensione cellulare. L'iniezione di volumi maggiori di quelli raccomandati può causare un reflusso delle cellule tumorali attraverso il tratto dell'ago, con conseguente crescita tumorale subcutanea anziché intracranica. Come mostrato qui, un angolo inadeguato di inserimento della siringa può portare a un'iniezione intraventricolare delle cellule e a una successiva disseminazione spinale, come illustrato al termine dell'iniezione.Lasciare l'ago in posizione per un altro minuto, quindi ritirarlo lentamente. Questi passaggi aiuteranno a prevenire il reflusso tumorale. Pulire il cranio con perossido di idrogeno al 3% e asciugare.Utilizzando un tampone sterile in cotone. Applicare cera ossea sterile nel foro utilizzando pinze. Riavvicinare il cuoio capelluto sulla scatola cranica con il derma di ciascun lato premuto insieme, lato inferiore contro lato inferiore, e applicare punti metallici.Quindi pulire il cuoio capelluto utilizzando clorhexidina. Somministrare buprenorfina per via sottocutanea per il sollievo dal dolore postoperatorio. Anche se non mostrato qui, la buprenorfina viene rapidamente assorbita.Procedere con l'iniezione di ulteriori topi. Assicurarsi di mescolare le cellule tra un'iniezione e l'altra per mantenere una concentrazione adeguata tra i membri di una serie di iniezioni. Si raccomandano gruppi di trattamento di almeno otto animali per garantire risultati statisticamente significativi.Monitorare tutti i topi nel periodo postoperatorio fino a quando non diventano deambulanti e riprendono un'attività normale. Tipicamente, il tempo di recupero è di circa 30 minuti, a partire da una settimana dopo l'iniezione delle cellule tumorali. L'imaging quantitativo mediante bioluminescenza o QBLI deve essere eseguito una o due volte alla settimana. Qui.La QBLI viene eseguita utilizzando la stazione di imaging IVIS Lumina e il software Living Image versione 3.2. Dal menu Start di Windows, selezionare il programma software Living Image. Una volta aperto il programma, fare clic sul pulsante del sistema IVIS inizializzato nel pannello di controllo della fotocamera.Dopo l'inizializzazione, la casella dello stato della temperatura dovrebbe essere verde, a indicare che la fotocamera CCD è adeguatamente raffreddata. Posizionare il topo anestetizzato, iniettato con luciferina, sullo stadio della camera di imaging. Aprire uno dei file salvati della sessione di imaging e modificare la visualizzazione dei dati da conteggi a fotoni. Per determinare i fotoni al secondo del segnale target, selezionare l'icona del cerchio dal menu a tendina delle ROI.Una regione di interesse etichettata come ROI dovrebbe apparire intorno al segnale bersaglio. Il segnale deve essere inserito in un file Excel in cui sono indicati il numero dell'animale e il giorno dell'acquisizione delle immagini. Ripetere questa sequenza per tutti gli animali analizzati durante la sessione di acquisizione.Dopo aver determinato i conteggi di fotoni per ogni topo sottoposto a imaging e aver trasferito i valori dei fotoni in un file Excel, convertire le letture di luminescenza in valori normalizzati dividendo la luminescenza di ciascun topo ottenuta durante e successivamente al completamento del regime terapeutico per il corrispondente valore massimo di luminescenza pretreatment. Per eseguire l'analisi della sopravvivenza utilizzando il software Prism, utilizzare il metodo di stima di Kaplan-Meier per generare i grafici di sopravvivenza e stimare i valori medi della sopravvivenza.Le differenze tra le curve di sopravvivenza vengono confrontate utilizzando un test log-rank. L'eutanasia dell'animale deve essere eseguita se l'animale mostra un marcato peggioramento delle condizioni di salute, in particolare se si verifica una perdita di peso superiore al 20% del peso massimo. Rapidamente, rimuovere il cervello dal topo sottoposto a eutanasia, quindi posizionare il cervello in formalina per l'analisi successiva della morfologia tumorale e dell'immunohistochimica.In questo esempio sono mostrati i valori medi di luminescenza normalizzata per topi sottoposti a terapia mediante iniezione intracranica di cellule tumorali con inizio di erlotinib al giorno 34. Le barre di errore indicano l'errore standard. Una differenza significativa nella luminescenza normalizzata media è evidente al primo punto temporale di imaging successivo all'inizio della terapia. La differenza nella luminescenza media tra i gruppi mostra un ulteriore aumento nei punti temporali successivi nella maggior parte dei casi.L'attività antitumorale indotta dalla terapia, indicata dal QBLI, è accompagnata da una corrispondente differenza significativa nella sopravvivenza. Come in questo caso, le sezioni di cervello di topo in paraffina colorate con ematossilina ed eosina mostrano il pattern di distribuzione delle cellule tumorali. P 10 è un marcatore frequentemente associato alla risposta tumorale all'inibizione del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR). Qui.Si osserva che gli otin delle cellule tumorali trattate sono privi dell'espressione di P 10, come indicato dall'assenza di colorazione marrone. Qui viene mostrata una sezione del cervello di topo inclusa in paraffina. Le cellule tumorali cerebrali sensibili all'inibitore di EGFR possono essere identificate dalla colorazione marrone di EGFR.Come hai visto, l'aspetto più complesso di questa procedura è l'iniezione corretta delle cellule tumorali. Qual è il prossimo esperimento che può essere eseguito utilizzando questo approccio, ad esempio lo studio degli effetti sulla crescita di modifiche genetiche alle cellule tumorali? Questo è tutto.Spero che questa presentazione ti sia stata utile. Buona fortuna con i tuoi esperimenti.

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