Fotostimolazione modellato con i dispositivi digitali Micromirror per Indagare integrazione dendritiche Attraverso punti di ramificazione

L'obiettivo generale di questa procedura è controllare modelli complessi di luce nel tempo e nello spazio in modo che possa essere utilizzata per stimolare i neuroni. Questo viene ottenuto posizionando innanzitutto un chip DMD in un piano immagine coniugato appropriato nel percorso ottico del microscopio. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'illuminare correttamente il DMD con una sorgente luminosa intensa, come un laser.

Il terzo passaggio della procedura consiste nell'eliminare l'effetto di granulazione dell'illuminazione coerente. L'ultimo passaggio della procedura è integrare un'interfaccia grafica utente per controllare il chip DMD. In definitiva, è possibile ottenere risultati che dimostrano come esperimenti precedentemente difficili da realizzare possano ora essere completati con relativa facilità mediante la lisi multi-sito del neurotrasmettitore in gabbia che impiega il sistema DMD.

Ciao, sono Michael Mohammed e lavoro nel laboratorio del Dottor Chaman Tang presso il Dipartimento di Neurologia dell'Università del Maryland. Oggi vi mostreremo un procedimento per generare schemi complessi di eliminazione in un microscopio ottico. Utilizziamo questo procedimento nel nostro laboratorio per studiare l'integrazione dendritica.

Iniziamo. Questo protocollo illustrerà il funzionamento di un dispositivo digitale a microspecchi, o sistema di illuminazione DMD, per la neuroscienza sperimentale. Un DMD è un chip semiconduttore ottico dotato di alcune centinaia di migliaia di microscopici specchi mobili disposti in un array rettangolare; sulla sua superficie, la posizione di ciascuno specchio corrisponde al pixel di un'immagine.

Ogni specchio può essere controllato singolarmente per inclinarsi tra due orientamenti. Nell'orientamento spento, la luce viene deviata lontano dall'asse ottico dell'illuminazione del campione. Nell'orientamento acceso, la luce viene indirizzata lungo l'asse ottico.

Il DMD è particolarmente adatto alla lisi poiché tollera luce UV molto intensa, genera elevati rapporti di contrasto tra i pixel accesi e spenti e può passare da uno stato all'altro in decine di microsecondi. L'utilizzo dei DMD nella ricerca biomedica è facilitato dall'ampio impiego di software e hardware per l'elaborazione delle immagini e dall'interesse commerciale nel settore della visualizzazione delle immagini. Componenti modulari sono commercializzati da Texas Instruments come kit di scoperta DLP, che forniscono i driver elettronici di supporto per adattare il DMD a un sistema microscopico.

È necessario comprendere i concetti fondamentali relativi all'ottica della microscopia. Il microscopio fluorescente moderno di base è costituito da un percorso di imaging e da un percorso di illuminazione. Comprende un obiettivo, un cubo filtro e due lenti tubolari distinte per i percorsi di imaging e di illuminazione.

Il microscopio è progettato in modo da avere posizioni coniugate al piano dell'immagine del campione, dove gli oggetti a fuoco nel piano del campione appariranno anche a fuoco in questi piani immagine coniugati. Una conseguenza di questo concetto è che qualsiasi immagine luminosa creata in un piano immagine coniugato verrà proiettata con precisione anche sul piano immagine del campione. Questa strategia viene utilizzata per proiettare un modello di illuminazione generato al computer sul campione.

Il fascio laser funge da sorgente luminosa molto intensa che illuminerà il modello implementato dai microspecchi sui chip DMD posizionati in un piano immagine coniugato. La progettazione di un sistema di illuminazione DMD dipende dalle luci di eccitazione utilizzate negli esperimenti di optogenetica, che impiegano luce in lunghezze d'onda visibili. Il modello illuminato può essere indirizzato attraverso il percorso della telecamera.

Pertanto, il chip DMD può essere semplicemente montato su una delle due porte della fotocamera di un modulo con doppia porta per fotocamera. Al contrario, per esperimenti che utilizzano luce nell'intervallo UV, come la lisi di composti caged, la luce deve essere indirizzata attraverso il percorso di illuminazione epifluorescente e deve essere creato un piano immagine coniugato più accessibile. Questo perché la lente tubo per imaging non è progettata per la trasmissione di luce UV.

Il tubo obiettivo di illuminazione viene invece utilizzato per la trasmissione UV e svolge un lavoro adeguato nella formazione dell'immagine. Ciascuno specchio microscopico sul DMD può commutare tra un'inclinazione positiva e una negativa di 12 gradi rispetto al piano del chip. A seconda dell'ingresso digitale ricevuto dal computer, l'asse di rotazione si trova lungo gli angoli diagonali di ciascuno specchio, a 45 gradi rispetto ai lati rettangolari del chip.

L'orientamento dell'inclinazione dello specchio è indicato da un triangolo color oro situato in un angolo della superficie anteriore del chip. L'inclinazione dello specchio microscopico determina l'allineamento del pitch e dell'azimut del fascio di illuminazione in ingresso. Per illuminare il DMD, configurare innanzitutto il pitch del fascio di illuminazione a 24 gradi rispetto all'asse perpendicolare del chip DMD e impostare l'azimut perpendicolare all'asse di rotazione dello specchio.

L'allineamento preciso del fascio è fondamentale per un funzionamento efficiente. Per esperimenti di lisi, utilizzare una sorgente laser per generare il fascio altamente intenso e focalizzabile necessario per l'uncaging rapido.

Qui viene utilizzato un laser a stato solido a diodo pompato quasi continuo, triplicato in frequenza, ND ate, impiegando un laser a potenza relativamente elevata poiché solo una piccola frazione dell'uscita laser viene effettivamente consegnata al campione. Quando si utilizza un sistema DMD, indirizzare l'uscita del laser in una fibra multimodale in modo che possa essere facilmente posizionata e orientata lungo l'asse corretto per illuminare il DMD, fornendo così una soluzione al problema delle granulazioni generate dall'illuminazione coerente, trasmettendo la luce attraverso la fibra ottica.

La fibra è avvolta attorno a un allungatore per fibre elettrico pazo che viene azionato per farla oscillare a circa 40 chilohertz. L'allungamento microscopico della fibra è sufficiente a spostare il pattern di speckle molte volte durante la durata di un millisecondo di ciascun impulso di stimolazione luminosa, eliminando così efficacemente lo speckle. Infine, l'uscita della fibra ottica viene collimata mediante un obiettivo microscopico UV per illuminare i DMD; un software di immagine che associa i pixel della CCD ai DMD è stato sviluppato per coregistrare ogni specchio del DMD con specifici pixel della telecamera CCD di acquisizione.

L'interfaccia grafica utente all'interno del software consente all'utente di assegnare l'orientamento dello specchio DMD corrispondente alla regione dell'immagine CCD utilizzando il mouse del computer attraverso l'interfaccia grafica utente. Contrassegnare la posizione per la stimolazione luminosa spostando il cursore sull'immagine visualizzata sullo schermo del computer e fare clic sulla regione di interesse contrassegnata per programmare l'archivio dei modelli di somministrazione della luce. Il modello evidenziato sullo schermo del computer come una serie di immagini separate programma nei software i tempi degli impulsi laser per ciascun modello spaziale.

Questo si integrerà con il programma di acquisizione dati P clamp. Infine, utilizzare il programma di acquisizione dati per coordinare i tempi dell'elettronica DMD, la temporizzazione del laser e l'acquisizione del segnale elettrico in patch clamp dal neurone bersaglio. Qui viene mostrata una calibrazione della risoluzione del sistema ottico.

La dimensione minima del punto è mostrata come misurata da una sorgente fluorescente. La risoluzione fisiologica effettiva è misurata dall'ampiezza del flusso di corrente in funzione della stimolazione luminosa. La posizione del punto qui, il glutammato incapsulato è stato illuminato adiacente a un ramo dendritico di due micrometri di diametro.

Mentre il punto veniva spostato ortogonalmente attraverso la fessura, vengono illustrate le risposte elettriche alla stimolazione luminosa di diverse intensità. Sono mostrate le risposte in voltmetro bloccato in funzione dell'intensità della luce.

La stimolazione dendritica distribuita può essere facilmente implementata utilizzando un sistema basato su DMD. Qui, l'intensità dell'input è stata variata aumentando il numero di punti di stimolazione luminosa, indicati come cerchi, sui due rami dendritici. La sommazione spaziale può essere non lineare attraverso i punti di biforcazione.

Diventa sempre più superlineare con l'aumento delle ampiezze in ingresso che arrivano sui due rami del doppio ingresso. Questi risultati illustrano chiaramente la modalità non lineare di sommazione attraverso i punti di biforcazione dendritici. La superlinearità è mediata principalmente dai recettori NMDA e non dai canali sensibili al voltaggio.

Questo può essere dimostrato applicando due antagonisti del recettore NMDA, PV e MK-801, che eliminano in larga misura il comportamento non lineare. Vi abbiamo appena mostrato la progettazione e il funzionamento di base di un sistema basato su DMD per la stimolazione fotoptica di tessuto neurale. Il sistema può essere adattato per la stimolazione con luce visibile, come quella utilizzata negli esperimenti di optogenetica.

Può inoltre essere adattato per luci nel vicino ultravioletto, come quelle utilizzate per la lisi a singolo fotone. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che se si utilizza una luce con lunghezza d'onda inferiore a 400 nanometri, soprattutto attraverso il percorso di illuminazione epifluorescente, un allineamento preciso del fascio illuminante entro pochi gradi è fondamentale e che, qualora si utilizzi una luce coerente, è essenziale eliminare efficacemente l'effetto di speckle. Questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.