Fotostimolazione modellato con i dispositivi digitali Micromirror per Indagare integrazione dendritiche Attraverso punti di ramificazione

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di controllare modelli complessi di luce nel tempo e nello spazio in modo che possa essere utilizzata per stimolare i neuroni. Ciò si ottiene posizionando prima un chip DMD su un piano di immagine coniugato appropriato nel percorso ottico del microscopio. Il secondo passo della procedura consiste nell'illuminare correttamente il DMD con una fonte di luce intensa come un laser.

Il terzo passo della procedura consiste nell'eliminare l'effetto macchiettamento dell'illuminazione coerente. Il passaggio finale della procedura consiste nell'integrare un'interfaccia utente grafica per manipolare il chip DMD. In definitiva, si possono ottenere risultati che dimostrano che esperimenti che in precedenza erano difficili da realizzare possono ora essere completati in modo relativamente semplice attraverso la lisi multi-sito del neurotrasmettitore a gabbia che impiega il sistema DMD.

Ciao, sono Michael Mohammed e sono il laboratorio del Dr.Chaman Tang presso il Dipartimento di Neurologia dell'Università del Maryland. Oggi vi mostreremo una procedura per generare modelli complessi di eliminazione in un microscopio ottico. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare l'integrazione dendritica.

Quindi iniziamo. Questo protocollo dimostrerà il funzionamento di un dispositivo digitale a micro specchio o di un sistema di illuminazione DMD per le neuroscienze sperimentali. Un DMD è un chip semiconduttore ottico con diverse centinaia di migliaia di microscopici specchi mobili disposti in una matrice rettangolare Sulla sua superficie, la posizione di ogni specchio corrisponde al pixel di un'immagine.

Ogni specchio può essere controllato individualmente per inclinarsi tra due orientamenti. Nell'orientamento off, la luce viene diretta lontano dall'asse ottico di illuminazione del campione. Nell'orientamento on, la luce viene diretta lungo l'asse ottico.

La DMD è adatta per la lisi perché tollera una luce UV molto intensa, genera elevati rapporti di contrasto tra i pixel accesi e spenti e può passare da uno stato all'altro in decine di microsecondi. L'applicazione dei DMD per la ricerca biomedica è aiutata dall'ampio uso di software e hardware per la manipolazione delle immagini e dall'interesse commerciale nel campo della visualizzazione delle immagini. I componenti modulari sono commercializzati da Texas Instruments come kit di scoperta DLP che forniscono i driver elettronici di supporto per adattare il DMD a un sistema microscopico.

I concetti di base riguardanti l'ottica della microscopia devono essere compresi. Il moderno microscopio a fluorescenza di base è costituito da un percorso di imaging e da un percorso di illuminazione. È composto da un obiettivo, un cubo filtrante e due lenti tubolari distinte per l'imaging e il percorso di illuminazione.

Il microscopio è progettato per avere posizioni coniugate al piano dell'immagine del campione, dove gli oggetti a fuoco sul piano del campione appariranno anche a fuoco su questi piani dell'immagine coniugata. Un corollario di questo concetto è che qualsiasi immagine luminosa creata sul piano dell'immagine coniugata verrebbe anche proiettata nitidamente sul piano dell'immagine del campione. Questa strategia viene utilizzata per proiettare un modello di illuminazione generato al computer sul campione.

Il raggio laser funge da sorgente luminosa molto luminosa che illuminerà il modello implementato dai micro specchi sui chip DMD posizionati su un piano di immagine coniugato. La progettazione di un sistema di illuminazione DMD dipende dalle luci di eccitazione utilizzate per gli esperimenti di optogenetica, che utilizzano la luce nella lunghezza d'onda visibile. Il motivo illuminato può essere portato attraverso il percorso della telecamera.

Pertanto, il chip DMD può essere semplicemente montato su una delle due porte della fotocamera di un modulo a doppia porta della fotocamera. Al contrario, per gli esperimenti che utilizzano la luce nell'intervallo UV, come la lisi di composti in gabbia, la luce deve essere portata attraverso il percorso di illuminazione epi e deve essere creato un piano di immagine coniugato più accessibile. Questo perché la lente del tubo di imaging non è progettata per la trasmissione UV.

Invece, la lente del tubo di illuminazione viene utilizzata per la trasmissione UV e svolge un lavoro adeguato nella formazione dell'immagine. Ogni micro specchio sul DMD può passare da un'inclinazione positiva a una negativa di 12 gradi rispetto al piano del chip. A seconda dell'input digitale che riceve dal computer, l'asse di rotazione si trova lungo gli angoli diagonali di ogni specchio, a 45 gradi rispetto ai lati rettangolari del chip.

L'orientamento dell'inclinazione dello specchio è indicato da un triangolo color oro in un angolo della superficie anteriore del chip. L'inclinazione del microspecchio determina l'allineamento del passo e dell'azimut del fascio di illuminazione in entrata. Per illuminare il DMD, configurare prima il passo del fascio di illuminazione in modo che sia di 24 gradi rispetto all'asse perpendicolare del chip DMD e configurare l'azimut in modo che sia perpendicolare all'asse di rotazione dello specchio.

L'allineamento preciso del fascio è fondamentale per un funzionamento efficiente. Per esperimenti di lisi. Utilizzare una sorgente laser per generare il raggio focalizzabile ad alta intensità necessario per un rapido disingabbiamento.

Qui viene impiegato un laser ND a frequenza triplicata a stato solido pompato a diodi quasi continui, utilizzare un laser di potenza relativamente elevata perché solo una piccola frazione dell'uscita laser viene effettivamente erogata al campione. Quando si utilizza un sistema DMD, lanciare l'uscita del laser in una fibra multimodale in modo che possa essere facilmente posizionata e orientata lungo l'asse corretto per illuminare il DMD per fornire una soluzione allo speckle. Problema generato dall'illuminazione coerente che trasmette la luce attraverso la fibra ottica.

La fibra è avvolta attorno a un tendifibra elettrico pazo che viene azionato per farla oscillare intorno ai 40 kilohertz. L'allungamento microscopico della fibra è sufficiente per spostare il modello di macchioline molte volte durante la durata di millisecondi di ogni impulso di fotostimolazione, eliminando così efficacemente la macchiettatura. Infine, l'output della fibra ottica viene raccolto con un obiettivo per microscopio UV per illuminare i DMD per coregistrare il pixel CCD con il software di immagine DMD che correla i singoli specchi DMD a pixel specifici della fotocamera CCD di imaging è stata scritta.

L'interfaccia utente grafica all'interno del software consente all'utente di assegnare l'orientamento dello specchio DMD che corrisponde alla regione sull'immagine CCD con il mouse del computer utilizzando l'interfaccia utente grafica. Contrassegnare la posizione per la stimolazione fotografica spostando il cursore sull'immagine visualizzata sullo schermo del computer e fare clic sulla regione di interesse contrassegnata per programmare l'archivio dei modelli di erogazione della luce. Il modello contrassegnato sullo schermo del computer come una serie di immagini separate programma la temporizzazione degli impulsi laser per ciascun modello spaziale nel software.

Questo si integrerà con il programma di acquisizione dati P clamp. Infine, utilizzare il programma di acquisizione dati per coordinare la temporizzazione dell'elettronica DMD, il gating del laser e l'acquisizione del segnale elettrico patched clamped dal neurone bersaglio. Qui viene mostrata una calibrazione della risoluzione del sistema ottico.

La dimensione minima dello spot viene mostrata come misurata da un bersaglio fluorescente. L'effettiva risoluzione fisiologica è misurata dall'ampiezza del flusso di corrente in funzione della fotostimolazione. Posizione spot qui, il glutammato in gabbia è stato fotografato adiacente a un ramo dendritico di due micrometri di diametro.

Mentre il punto veniva spostato. Ortogonalmente attraverso il dite vengono illustrate le risposte elettriche alla fotostimolazione di diverse intensità. Vengono mostrate le risposte con blocco di tensione in funzione dell'intensità di lisi.

La stimolazione dendritica distribuita può essere facilmente implementata utilizzando un sistema basato su DMD. Qui, l'intensità dell'input è stata variata aumentando il numero di punti di stimolazione fotografica contrassegnati come cerchi sui due rami dendritici. La sommatoria spaziale può essere non lineare tra i punti di diramazione.

Diventa sempre più super lineare con l'aumentare delle ampiezze di ingresso che arrivano sulle due porte delle diramazioni. Questi risultati illustrano chiaramente il modo non lineare di sommatoria tra i punti di diramazione dendritica. La super linearità è in gran parte mediata dai recettori NMDA e non dai canali voltaggio-dipendenti.

Ciò può essere dimostrato come l'applicazione di due antagonisti NMDA A, PV e MK 8 0 1 elimina in gran parte il comportamento non lineare. Vi abbiamo appena mostrato la progettazione e il funzionamento di base di un sistema basato su DMD per la fotostimolazione del tessuto neurale. Il sistema può essere adattato per la stimolazione con luce visibile, ad esempio per esperimenti optogenetici.

Può anche essere adattivo per le luci vicine ai raggi UV, come quello utilizzato per la lisi di un singolo fotone. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che se si deve utilizzare una luce a lunghezza d'onda inferiore a 400 nanometri e la maggior parte delle persone si trova attraverso il percorso di illuminazione epi, l'allineamento preciso del fascio di illuminazione entro pochi gradi è fondamentale e che se si utilizza una luce coerente, lo speckling deve essere eliminato in modo efficace. Quindi questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.