Name: In vivo centrifugazione di embrioni di Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-23T16:55:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: Impara la separazione degli organelli per densità in embrioni viventi di Drosophila. Questa tecnica consente analisi biochimiche e esperimenti di colocalizzazione senza artefatti da rottura cellulare.

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Ringraziamo Susan Gerbi, Heidi Smith e David Lambert per la fornitura di materiale per testare in vivo sui centrifugazione Sciara coprophila e Ilyanassa obsoleta, rispettivamente. Ringraziamo i membri del laboratorio Welte per commenti sulla tecnica e manoscritto. Sviluppo e la raffinatezza del test in vivo centrifugazione è stato sostenuto da NIGMS concedere GM64687 a MAW. Le immagini mostrate in fig. 1 e fig. 5E, F sono stati precedentemente pubblicato 2 e sono ristampato qui con il permesso.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Passaggi critici Assicurarsi che la concentrazione di agar è abbastanza alta. Se è troppo basso, l&#39;agar-agar si disintegrerà durante la centrifugazione, e gli embrioni saranno scoppiare o essere orientati in modo casuale. Se la concentrazione di agar è solo un po &#39;troppo basso o se l&#39;agar è bagnato (rimozione sufficientemente secchi o insufficiente di TSS eccesso al punto 4.3), gli embrioni galleggerà dai loro buchi durante la centrifugazione e diventare impropriamente oriented. Se l&#39;agar è versato troppo sottilmente, sarà anche il collasso o crack durante la centrifugazione. Assicurarsi che gli embrioni non hanno superato le fasi cellularization. In caso contrario, la separazione di organelli non funziona (Fig. 5C) dal organelli sarà sequestrato all&#39;interno di migliaia di singole cellule. Nei giovani embrioni allo stadio di una cellula, organuli sono liberi di migrare grandi distanze e si accumulano in base alla loro densità caratteristica. Per evitare di analizzare gli embrioni che sono troppo vecchio, assicurarsi di (i) comportare un pre-raccolta per permettere alle femmine di deporre le uova vecchie (passo 2,4), (ii) raccogliere embrioni per 3 ore o meno (punto 2.5), (iii) visivamente selezionare gli embrioni prima di fasi cellularization per includerle in agar (punto 4.2), (iv) tenere incorporando poco tempo per prevenire lo sviluppo fino alla fine di cellularization (punto 4.6), e (v) scartare gli embrioni che non hanno strato correttamente (passo 5.6) . Non lesinare sul tempo di centrifugazione. Anche se alcuni degli embrioni mostrerà stratificazione piacevole anche dopo soli 10 minuti di centrifugazione, la separazione è incoerente dall&#39;embrione embrione. 30 giri min dare risultati altamente coerenti. Inoltre, più lungo è il tempo di centrifugazione, più a lungo i livelli sono stabili dopo la centrifugazione è terminata. Questo è importante per quelle applicazioni in cui ci vuole tempo per elaborare gli embrioni prima di essere utilizzati (per esempio, se hanno bisogno di essere trattati per esperimenti di trapianto o montato per l&#39;analisi confocale). Eventuali modifiche Raccolta degli ovuli e corion rimozione Molti protocolli differenti esistono per i punti 2 e 3 1, 3, 9, e funzionerà così come quelli descritti qui fino a quando gli embrioni utilizzati sono giovani, resa uovo è alto, e la frazione di mis- embrioni in scena è ridotta al minimo. Antero-posteriore allineamento Il protocollo orienta tutti gli embrioni tale che l&#39;estremità posteriore è sepolto nel agar e la fine anteriore è alto (Fig. 3). Questo orientamento è un bene per coerenza, in modo che sia possibile utilizzare il micropilo come punto di riferimento che finiscono rivolta verso l&#39;alto durante la centrifugazione (Fig. 1, 5). Tuttavia, con la pratica, è facile individuare l&#39;orientamento degli embrioni centrifugati dalla comparsa distinte del lipidi goccia e strati tuorlo da campo chiaro microscopia. Allora diventa possibile montare sia con gli embrioni finiscono, questa flessibilità accelera il processo di montaggio. Centrifugazione Unoriented L&#39;aspetto più-in termini di tempo e tecnicamente impegnativo del protocollo è di montaggio degli embrioni in agar (punto 4). Si richiede di toccare ogni embrione due volte (una volta per inserirlo nel foro e una volta per recuperarlo dopo la centrifugazione). In alternativa, si può trasferire gli embrioni a passo 4,1 in provette da microcentrifuga pieno di TSS. Quando questi tubi vengono centrifugati in una microcentrifuga (13.000 giri al minuto, 10-30 min), gli embrioni anche tipicamente strato di ben 10-13. Questa variante permette di processare centinaia di embrioni, allo stesso tempo molto rapidamente. Tuttavia, la stratificazione non è così consistente, una parte degli embrioni non si sviluppano strati distinti, nonostante le forze di centrifugazione molto più alta (~ 16.000 g) che applicato il protocollo di cui sopra. Più impegnativo è il fatto che l&#39;orientamento degli embrioni è variabile, e si può osservare la separazione a vari angoli rispetto all&#39;asse principale embrione. Questa variabilità richiede lo sperimentatore di risolvere dopo la centrifugazione come un embrione particolare è stato organizzato nella provetta da centrifuga. Con l&#39;uso del tuorlo autofluorescenza come marker per la maggior parte alta densità dell&#39;embrione, questo è spesso possibile, anche se richiede molta pratica e giudizio di farlo in modo affidabile. Se ci sono embrioni sufficiente nel campione, si può essere in grado di risolvere quei casi in cui gli embrioni capitato di essere disposti come in fig. 1. Centrifugazione degli embrioni nel loro guscio dell&#39;uovo E &#39;possibile incorporare gli embrioni in agar per il passaggio 4 senza rimuovere il corion primi 2. In questo approccio, gli embrioni sulla piastra di raccolta sono coperti con olio alocarburi invece del 50% di candeggina al punto 3.2 (alocarburi trasforma il traslucido corion). Embrioni di stadi appropriati vengono selezionati e trasferito in una nuova piastra di agar con pinzette; afferrando solo i filamenti d&#39;uovo con le pinze, danniil corretto embrione è evitato. Gli embrioni sono incorporati come nel passo 4,4 per 4,8, con i filamenti d&#39;uovo anteriore attaccare fuori dal buco nel agar. Il guscio d&#39;uovo viene rimosso da un trattamento di candeggina al 50% dopo che gli embrioni sono stati centrifugati e scavato nella agar come al punto 5.4. Centrifugazione, alla presenza del guscio dell&#39;uovo può migliorare il tasso di devitellinization dopo fissazione (passo 6.2), ma la selezione degli stadi corretti per centrifugazione (passo 4.2) è più impegnativo. Applicazioni Centrifugazione embrione è particolarmente utile per gli esperimenti di colocalizzazione, cioè, per verificare se una particolare proteina localizza a un certo organello importante. Per esempio, la proteina Klar è presente sui primi gocce lipidiche embrionale, ma questa localizzazione è difficile da dimostrare in embrioni intatto. In parte, ciò è dovuto sia puncta Klar e gocce lipidiche sono abbondanti nella periferia embrione 10, rendendo colocalizzazione spurie difficili da escludere. Tuttavia, centrifugazione concentra gocce lipidiche in uno strato distinto, e, quindi, colocalizzazione con segnale Klar diventa evidente 10. Un&#39;analisi simile è dimostrato in modo inequivocabile la localizzazione di altre proteine ​​di gocce lipidiche 8, 13-15, con esempi sorprendente come alcuni istoni 2 e nei casi in cui una proteina è presente ubiquitariamente, ma arricchito di gocce lipidiche 8. Come gli embrioni possono essere selezionate visivamente da stadio di sviluppo (punto 4.2), è anche possibile rilevare l&#39;assunzione di proteine ​​evolutivamente regolata a gocce lipidiche 8, 15. Test per colocalizzazione con gocce lipidiche è particolarmente semplice, visto che si accumulano gocce lipidiche in una visivamente distinte &quot;cap&quot;, in modo che nessun ulteriore marker o macchia è necessario per identificare questo strato. Infatti, a causa della sua facilità e risultati visivi potenzialmente sorprendenti (Fig. 1, Fig. 5. D, E), il nostro laboratorio utilizza questa tecnica ormai di routine come un primo test se una proteina è localizzata per il candidato gocce lipidiche. In linea di principio, gli studi di colocalizzazione simile dovrebbe lavorare per il organelli altri mostrato in fig. 1, e probabilmente per gli altri (compresi i parassiti intracellulari), la cui distribuzione negli embrioni centrifugati deve ancora essere documentati. Dal centrifugazione concentra organelli in bande strette, facilita l&#39;isolamento di una frazione arricchita in questi organelli. Questo approccio è già stato utilizzato per il recupero gocce lipidiche per il trapianto in embrioni di donatori 2. Può anche essere possibile analizzare biochimicamente la frazione arricchito (ad esempio, tagliando strati off embrioni dopo la fissazione 15). Il metodo descritto qui ha applicazioni che vanno oltre gli embrioni di Drosophila, la centrifugazione può essere utilizzata per stratificare le uova di diverse specie (tra cui le rane, nematodi, tunicati, anellidi, ricci di mare, molluschi e Cnidari) 16. Nel nostro laboratorio, abbiamo usato il protocollo di cui sopra per gli embrioni di Musca domestica mosca 2 e hanno impiegato centrifugazione unoriented per l&#39;analisi di embrioni dal moscerino fungo Sciara coprophila 17 e la lumaca Ilyanassa obsoleta 17. Infine, questo metodo non è limitato agli embrioni: centrifugazione può anche essere utile per stratificare altre cellule di grandi dimensioni, come gli ovociti (ad esempio, in Drosophila 2, 18 e l&#39;euforbia bug Oncopeltus fasciatus 17). Per diversi esemplari, le condizioni di centrifugazione esatti devono essere ottimizzati: per esempio, 10 minuti a 3000 g è sufficiente per stratificare efficacemente embrioni di Musca domestica 2, e se centrifugati molto più lungo, gli embrioni tendono a rompersi durante la fissazione e immunocolorazione.

<table><tbody><tr><td>Piastre di Petri 60x15 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>#35-1007</td><td>Da Falcon</td></tr><tr><td>Rete metallica</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CX-0150</td><td>in acciaio inossidabile tipo 304; dimensione della maglia #150 x150, diametro del filo: 0,0026 pollici</td></tr><tr><td>Aghi al tungsteno</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-10</td><td>0,25 mm</td></tr><tr><td>Porta-ago/spillo nichelato Moria</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Gabbiette per moscerini</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-100 o 59-101</td><td>Per piastre di Petri di diametro rispettivamente di 65 mm o 100 mm</td></tr><tr><td>Olio Halocarbon 27</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8773</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo centrifugazione di embrioni di drosophila

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

Una strategia importante per purificare e isolare i diversi tipi di organelli intracellulari è quello di separare gli uni dagli altri sulla base di differenze di densità di galleggiamento. Tuttavia, quando le cellule sono interrotte prima della centrifugazione, proteine ​​e organelli in questo non-native ambiente spesso impropriamente unirsi tra di loro. Qui si descrive un metodo per separare gli organelli dalla densità in intatto, embrioni vivi Drosophila. Embrioni precoci prima cellularization vengono raccolte dalle gabbie della popolazione, e la loro gusci d&#39;uovo esterni vengono rimossi dal trattamento con il 50% di candeggina. Gli embrioni vengono poi trasferiti ad una piastra di agar piccole e inserito, estremità posteriore prima in piccoli fori verticali in agar. Le piastre contenenti embrioni incorporati vengono centrifugati per 30 minuti a 3000g. L&#39;agar supporta gli embrioni e li mantiene in un orientamento definito. In seguito, gli embrioni sono scavate nella agar con un ago smussato. Centrifugazione separa organuli principali in strati distinti, una stratificazione facilmente visibile da campo chiaro microscopia. Un certo numero di marcatori fluorescenti sono disponibili per confermare stratificazione successo in embrioni vivi. Proteine ​​associate con alcuni organelli sarà arricchita da uno strato particolare, dimostrando colocalizzazione. Singoli strati possono essere recuperati per l&#39;analisi biochimiche o il trapianto in uova donatore. Questa tecnica è applicabile per la separazione degli organelli in altre cellule di grandi dimensioni, comprese le uova e ovociti di specie diverse.

Descriviamo un metodo per separare gli organelli dalla densità del vivere<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni. Gli embrioni sono inseriti in agar e centrifugato. Questa tecnica produce separazione riproducibile organuli principali lungo l&#39;asse antero-posteriore dell&#39;embrione. Questo metodo facilita esperimenti colocalizzazione e rendimenti frazioni organello per analisi biochimiche e di esperimenti di trapianto.

In vivo centrifugazione di embrioni di Drosophila

Una strategia principale per la purificazione e l'isolamento di diversi tipi di organelli intracellulari consiste nel separarli tra loro in base alle differenze di...

La separazione dei principali organelli all'interno delle uova della mosca della frutta in base alla densità inizia con il raccolto di embrioni, che hanno meno di tre ore di vita. I gusci delle uova vengono quindi rimossi incubando in una soluzione di candeggina al 50% dopo la dechorionizzazione. Gli embrioni, che presentano stadi ben definiti, vengono montati in agar. Come passaggio finale, gli embrioni vengono centrifugati e recuperati, esaminando gli embrioni ottenuti mediante luce brillante e fluorescenza. La microscopia mostra la localizzazione di proteine specifiche in determinati organelli. Una strategia fondamentale per purificare e isolare organelli intracellulari consiste nel separarli da tutti gli altri componenti cellulari in base alla densità, ma sussiste una difficoltà: le cellule vengono infatti disgregate prima della centrifugazione, con conseguente mescolamento di proteine e organelli che normalmente sono separati.Le proteine possono aderire l'una all'altra in queste condizioni non native in vitro. Al contrario, alcune proteine potrebbero staccarsi da strutture alle quali normalmente si legano. Il vantaggio principale della tecnica che andremo a descrivere è che consente la separazione per densità in vivo.Pertanto, evita la rottura delle cellule e gli artefatti ad essa associati. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali di biologia cellulare. Rende gli esperimenti di codistribuzione molto semplici e consente l'isolamento di frazioni organellari specifiche per esperimenti di trapianto e per analisi biochimiche.In questo procedimento, si prepara un mezzo solido ad alta percentuale di agar contenente succo di mela, che viene versato nelle piastre come descritto dettagliatamente nel protocollo scritto allegato. Le piastre vengono utilizzate sia nel passaggio di deposizione delle uova sia per l'incapsulamento e la centrifugazione successivi degli embrioni. Questo procedimento inizia con l'avvio della raccolta delle uova.Preparare innanzitutto una pasta di lievito mescolando lievito secco con acqua fino a ottenere una consistenza simile a quella della crema di arachidi; quindi ricoprire una porzione di una piastra in agar con succo di mela fresco utilizzando la pasta di lievito. I drosophila adulti vengono mantenuti in gabbie alle quali vengono fissate piastre in agar sul fondo.Per rimuovere la piastra attuale, capovolgere la gabbia delle mosche e batterla sul piano del bancone. Alcune volte le mosche cadono sul fondo e rimangono brevemente disorientate in questo breve periodo. Sostituire rapidamente la piastra di agar vecchia con quella nuova ricoperta di pasta di lievito.Il lievito fornisce nutrimento per la produzione delle uova e, insieme al succo di mela nell'agar, induce la deposizione delle uova. Scartare la raccolta delle uova nei primi 30-60 minuti. Questo produce una grande frazione di embrioni mal stadiati poiché sono stati trattenuti dalle femmine dopo la fecondazione.Le raccolte successive di uova tendono a essere dominate da uova deposte poco dopo la fecondazione. Raccogliere le uova per un massimo di tre ore, poiché la stratificazione più uniforme si ottiene negli embrioni giovani. Sono preferibili tempi di raccolta più brevi, di un'ora o meno.Per esperimenti di routine, utilizzare pinzette per rimuovere eventuali moscerini rimasti attaccati al lievito o alla superficie della piastra in agar. Dopo aver raccolto le uova, procedere rimuovendo l'uovo, la cuticola, posizionare la piastra in agar sotto un microscopio stereoscopico e osservare gli embrioni mediante transilluminazione. Assicurarsi di identificare i filamenti dell'uovo per rimuovere la cuticola dagli embrioni.Spruzzare sotto la piastra di agarosa una soluzione di candeggina al 50%, coprendo gli embrioni, e incubare per alcuni minuti. Agitare occasionalmente la piastra di agarosa per far muovere gli embrioni nella candeggina. Esaminare nuovamente le uova al microscopio.Una volta che i filamenti dell'uovo non sono più visibili, il Corian è stato rimosso con successo. Ciò richiede tipicamente da tre a cinque minuti di incubazione con la soluzione di candeggina. Successivamente, utilizzare un cestello in rete metallica come setaccio per separare gli embrioni dalla candeggina.Il cestello viene preparato a partire da un quadrato di due centimetri per due centimetri di una lamina piana in rete metallica, ammaccata al centro. Afferrare il cestello metallico con una pinzetta e tenerlo sopra il coperchio rovesciato della piastra di agar. Versare la sospensione di embrioni e candeggina dalla piastra di agar attraverso la rete metallica, facendola defluire nel coperchio della piastra di agar.Se gli embrioni rimangono sulla piastra di agar, versare acqua distillata sulla piastra per staccarli e far scorrere la sospensione di acqua distillata e embrioni attraverso la maglia metallica. Appoggiare il fondo della maglia metallica su un tovagliolo di carta per asportare il liquido in eccesso. Quindi versare acqua distillata lungo il perimetro del cestello metallico per risciacquare il residuo di candeggina, minimizzando la perdita di embrioni.Eliminare frequentemente il liquido in eccesso. Ripetere il lavaggio da cinque a dieci volte fino a quando tutto l'ipoclorito è stato rimosso. Se il cestello metallico odora ancora di ipoclorito, continuare a lavare gli embrioni.Una volta che gli embrioni sono stati sufficientemente lavati, possono essere montati in agar. Lavare gli embrioni fuori dal cestello metallico. Con TSS in una piastra di Petri vuota, l'embrione dovrebbe affondare sul fondo.Sotto una lente stereoscopica, osservare gli embrioni mediante illuminazione trasmessa. Specifici stadi possono essere riconosciuti facilmente a occhio nudo. Utilizzando una pipetta P200, selezionare gli embrioni degli stadi desiderati e trasferirli su una piccola piastra di agar. Lavorare rapidamente poiché gli embrioni invecchiano e un'immersione prolungata per più di 30 minuti in TSS potrebbe influenzare lo sviluppo, utilizzando una pipetta. Sotto un fazzoletto Kim. Rimuovere la maggior parte del TSS.La superficie dell'agar dovrebbe essere leggermente umida, il che facilita lo spostamento degli embrioni. Tuttavia, non devono rimanere pozzetti di liquido in alcuna parte della piastra, poiché l'eccesso di liquido durante la centrifugazione causerebbe lo scivolamento degli embrioni fuori dai fori. L'aspetto più difficile di questa procedura è il montaggio degli embrioni e della coclea.Questo è particolarmente difficile perché gli embrioni sono delicati e possono essere facilmente danneggiati o maneggiati in modo troppo brusco. Per evitare ciò, l'ago deve essere mosso lentamente, con attenzione e a piccoli incrementi. L'esercizio è il modo migliore per imparare esattamente quanto tatto e pressione l'embrione può sopportare. Montare la pinza e l'ago al contrario in un portaghi, in modo che l'estremità smussata sporga, mentre si osserva.Sotto il microscopio, utilizzare l'ago per praticare fori verticali nell'agar vicino a ciascun embrione, in modo da poter osservare contemporaneamente al microscopio mentre si pratica il foro nell'agar. L'ago viene tenuto inclinato, pertanto è difficile praticare fori perfettamente verticali. Tuttavia, l'inclinazione leggera dell'ago crea una lieve depressione o solco su un lato del foro, consentendo all'embrione di scivolare agevolmente lungo di esso ed entrare nel foro.Successivamente, identificare le estremità anteriore e posteriore degli embrioni allungati, poiché l'embrione deve essere inserito nei fori in un'orientazione costante. Solitamente con l'estremità anteriore in alto, la membrana ign all'estremità anteriore è caratterizzata da una struttura specializzata. La micro pila, utilizzando l'estremità smussata dell'ago, spingere l'embrione per farlo avanzare lungo l'agar e orientare nonché manovrare la sua estremità posteriore verso un foro perforato.Poi spingere l'estremità anteriore verso il foro. L'embrione dovrebbe scivolare agevolmente all'interno del foro lungo la leggera depressione creata durante la perforazione. Mentre l'embrione si inclina verso l'alto, spingerlo più in profondità all'interno del foro.L'agar è abbastanza morbido da permettere che, una volta inserito parzialmente un embrione in un foro praticato, possa essere spinto ulteriormente senza subire danni. Quando è completamente inserito, l'embrione di solito è già abbastanza verticale. Se non lo è, allineare l'embrione inserito in posizione più verticale, spingendo lateralmente.Se il foro non è troppo grande, la posizione dell'embrione verrà mantenuta stabilmente dall'agar durante tutta la centrifugazione. Con la pratica, è possibile incorporare da 100 a 250 embrioni per piastra. Il numero di embrioni necessari dipende dall'applicazione successiva.Mantenere breve il tempo di montaggio. Se si desidera una fase di sviluppo ristretta, poiché gli embrioni continuano a svilupparsi durante il montaggio, rimuovere gli embrioni in eccesso non utilizzati con un pennello umido per moscerini. Successivamente, gli embrioni montati nell'agar vengono centrifugati.Trasferire le piastre contenenti gli embrioni di moscerino nei secchielli oscillanti della centrifuga, con il lato dell'agar rivolto verso il basso. Assicurarsi che la centrifuga sia bilanciata uniformemente e centrifugare le piastre a 4.000 giri al minuto per 30 minuti a una temperatura compresa tra quattro e 10 gradi Celsius. Al termine della centrifugazione, posizionare la piastra in agar sotto il microscopio stereoscopico e coprirla con uno strato di TSS utilizzando l'estremit&agrave; ottusa dell'ago.Estrarre gli embrioni dalle loro cavità. Gli embrioni galleggiano nel TSS ma rimangono sommersi. Gli embrioni appaiono chiaramente stratificati, con una calotta marrone all'estremità anteriore, una regione centrale trasparente e un'area grigio scuro all'estremità posteriore.Scartare gli embrioni che non mostrano una stratificazione distinta, visibile mediante microscopia in campo chiaro o in fluorescenza episcopica. Utilizzare una pipetta P200 per trasferire gli embrioni ben stratificati in TSS in una provetta da microcentrifuga. Successivamente, trasferire gli embrioni in tampone su un vetrino e montarli come descritto nel protocollo scritto allegato.Se gli embrioni devono essere fissati, utilizzare una pipetta P200 per trasferire gli embrioni ben stratificati in TSS in un vial per scintillazione. Fissare gli embrioni utilizzando tecniche di fissazione standard. Poiché per gli embrioni in centrifuga, l'efficienza del passaggio di devitalizzazione è bassa.Iniziare con un numero di embrioni praticabile. Se gli embrioni devono essere utilizzati in esperimenti di trapianto, trasferirli su piastre di agar e montarli su coprioggetti. Utilizzando procedure standard per la manipolazione degli embrioni, i riferimenti a tali procedure possono essere trovati nel protocollo scritto.Lo strato formato per effetto della centrifugazione è stabile per decine di minuti. Qui di seguito sono mostrate immagini in luce brillante di embrioni di oph vivi prima della centrifugazione, con l'estremità anteriore a sinistra e l'estremità posteriore a destra, lato dorsale in alto e lato ventrale in basso; gli embrioni allo stadio di segmentazione appaiono uniformi.Le fasi brune come questa sono ideali per la centrifugazione in vivo. Gli embrioni Blaster derm presentano un margine chiaro che appare simile su tutti i lati. Questa periferia chiara si espande fino a poco prima della fine della izzazione.Gli embrioni possono ancora essere stratificati con successo mediante centrifugazione fino alla fine della gastrulazione. La stratificazione del tuorlo e dei nuclei non è così costante come nelle fasi di segmentazione. Una volta che gli embrioni cellulari appaiono asimmetrici, i lati dorsale e ventrale diventano distinti e si sviluppano diverse pieghe.L'embrione mostrato è in una fase iniziale di allungamento della fascia germinale. In queste fasi, la centrifugazione non è più efficace nel separare gli organelli principali. L'embriogenesi è un continuum.Pertanto, queste fasi non sono entità distinte, ma si trasformano l'una nell'altra man mano che procede lo sviluppo. Questo filmato in time-lapse cattura quattro ore di genesi dell'embrione a partire dalle fasi di segmentazione. L'estensione della banda germinale è accelerata di 720 volte.Di seguito sono riportate immagini di embrioni centrifugati acquisite mediante illuminazione trasmessa. L'embrione a sinistra ha stratificato correttamente. Le goccioline lipidiche a bassa densità formano un cappuccio lipidico all'estremit&agrave; anteriore pi&ugrave; distale.I veicoli della tuorlo ad alta densità si accumulano come una zona grigio scuro all'estremità posteriore. Questi due strati sono separati da un'ampia zona chiara che rappresenta altri organelli e il citoplasma. L'embrione a destra è stato centrifugato dopo la fertilizzazione.La stratificazione è minima se è disponibile un microscopio a fluorescenza epiluminescente. Questi embrioni vivi centrifugati possono essere esaminati in condizioni di eccitazione UV, in cui il tuorlo mostra un'intensa fluorescenza blu dell'acqua. Uno strato compatto di materiale autofluorescente al polo posteriore indica un'esecuzione corretta della centrifugazione e funge da marcatore per l'estremità posteriore.L'aspetto degli strati cambia drasticamente se gli embrioni vengono fissati. Le goccioline lipidiche diventano traslucide e lo strato lipidico appare biancastro e soffice alla microscopia in luce brillante, anziché marrone scuro. La fluorescenza di Yo corso viene parzialmente o completamente distrutta dalla fissazione, diventando molto meno intensa o addirittura non rilevabile.In questa immagine, gli organelli sono etichettati con marcatori fluorescenti e i marcatori si accumulano in posizioni caratteristiche lungo l'asse antero-posteriore. Alcune proteine fuse con le istoni si localizzano sia sulle goccioline lipidiche che sui nuclei, e possono quindi essere utilizzate per marcare questi compartimenti cellulari e per monitorare lo stadio dell'embrione in base al numero di nuclei etichettati. Come hai appena visto, uno degli aspetti più complessi di questa procedura è l'inclusione degli embrioni nella vite senza fine.Ma con un po' di pratica, sarai in grado di eseguire questa procedura rapidamente ed in modo efficiente. Una volta padroneggiata, questa tecnica rende molto semplici esperimenti di codistribuzione che altrimenti sarebbero noiosi.Ad esempio, il nostro laboratorio utilizza regolarmente questa tecnica per verificare mediante microscopia a fluorescenza se una proteina di interesse si localizza in un determinato organulo principale. Inoltre, singoli strati possono essere recuperati dagli embrioni centrifugati per analisi biochimiche o esperimenti di trapianto. Questa tecnica non è utile soltanto per gli embrioni di moscerino della frutta.La centrifugazione separa inoltre gli organelli in base alla densità nelle uova di altre specie e in altri tipi cellulari di grandi dimensioni, come i citi.

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