Caricamento di merci su Kinesin Navette Powered molecolare

L'obiettivo generale di questa procedura è caricare le nanosfere su microtubuli, che scivolano su una superficie rivestita di chinasi nei motori. Ciò si ottiene rivestendo prima la superficie di una cella a flusso di vetro con una soluzione di caseina. Il secondo passo della procedura consiste nell'assorbire le proteine motorie della chinesina sulla superficie della cella di flusso.

Il terzo passo della procedura consiste nell'aggiungere i microtubuli. Il passaggio finale della procedura consiste nell'aggiungere lo strept haver nelle molecole, che si legheranno ai microtubuli, e quindi aggiungere le nanosfere. Le nanosfere si legano alla superficie della cella di flusso, dove possono essere raccolte dai microtubuli.

In definitiva, si può osservare come le nanosfere vengono raccolte dai microtubuli e trasportate attraverso la superficie utilizzando la microscopia a fluorescenza. Ciao, sono Elaine Jen Smith del laboratorio del Dr.Henry Hess e del Dipartimento di Scienza e Ingegneria dei Materiali dell'Università della Florida. Oggi vi mostreremo una procedura per il test della motilità invertita.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare il carico del carico sui microtubuli e il movimento delle navette molecolari. Quindi iniziamo. Prima di iniziare questa procedura, prepara nuovamente tutte le soluzioni stock come descritto nella parte scritta di questo video.

Una volta preparate le soluzioni madre, iniziare la preparazione dei microtubari pipettando 25 microlitri di soluzione di crescita in una provetta per microcentrifuga da 0,65 millilitri. Quindi aggiungere 6,25 microlitri della soluzione di crescita a 20 microgrammi di tubulina biotinilata liofilizzata. Agitare la soluzione e metterla in un bagno di calore a 37 gradi Celsius per 30 minuti per polimerizzare dopo l'incubazione, diluire la soluzione 100 volte in Taxol Buffer e agitare delicatamente.

Questa soluzione serve a stabilizzare i microtubuli. Etichettare la soluzione come vuota 100 e conservarla a temperatura ambiente. Successivamente, effettuare una diluizione di dieci volte di MT 100 in tampone anti sbiadimento ed etichettare questa soluzione come MT 1000.

Quindi preparare i motori Kinesin diluendo la soluzione di chinesina 20 volte nel caso in un tampone TP. Etichettare la soluzione come chinasi in 20 e conservarla in ghiaccio. Infine, prepara le soluzioni di streptavidina e nanosfera.

Innanzitutto, aggiungi Alexa Fluor 5 6 8 streptavidina marcata a una concentrazione di 100 nano molari in Antifa Buffer. Etichettare la soluzione come STV 100, quindi diluire le nanosfere 5.000 volte in Antifa Buffer ed etichettare questa miscela come NS 5.000. Conservare entrambe queste soluzioni con ghiaccio.

Dopo la preparazione della soluzione per il saggio di carico del carico, costruire una cella di flusso utilizzando un vetrino di copertura e un vetrino di copertura separati da nastro biadesivo. Per prima cosa incollare due strisce di nastro biadesivo ai bordi di un vetrino di copertura, lasciando uno spazio di circa un centimetro tra le strisce. Quindi stendere un vetrino coprioggetto sul nastro.

Applicare pressione sul vetrino coprioggetto utilizzando il bordo piatto di una pinzetta per ottenere una guarnizione. La cella di flusso costruita è lunga circa due centimetri, larga un centimetro e alta 100 micron e ha un volume di circa 20 microlitri. Per iniziare l'assemblaggio del saggio invertito.

Posizionare la punta della pipetta tra il vetrino coprioggetti e il vetrino. Quindi iniettare 0,5 milligrammi per millilitro di soluzione di caseina nella cella di flusso. Questo rivestimento sulla cella di flusso consentirà alla chinesina di mantenere la sua funzionalità dopo l'assorbimento.

Attendere cinque minuti affinché la soluzione di caseina si rivesta. Successivamente, assorbire la chinesina sulla cella di flusso introducendo la chinasi in 20 soluzioni di soluzione che vengono introdotte nelle celle di flusso posizionando la punta della pipetta tra il vetrino coprioggetto e il vetrino. Quindi la soluzione viene iniettata nella cella di flusso da un lato, mentre contemporaneamente viene espulsa dall'altro lato.

Con la carta da filtro, attendere cinque minuti affinché la chinasi si assorba. Successivamente, introdurre i microtubuli nella cella a flusso pipettando la soluzione MT 1000 nella cella a flusso. Attendere cinque minuti affinché i microtubuli si stabilizzino e si attacchino alla chinasi nei motori dopo l'attacco microtubiale alla chinasi nei motori.

Rivestire i microtubuli con lo streptococco fluorescente TTR introducendo la soluzione STV 100 nella cella a flusso. Attendere cinque minuti affinché lo streptococco TTR nelle molecole si leghi ai microtubuli. Lavare via l'eccesso di STREPTOCOCCO introducendo tre lavaggi da 30 microlitri di soluzione Antifa nella cella di flusso.

Infine, introdurre le nanosfere di fluoresceina in polistirene biotinilato pipettando la soluzione NS 5.000 nella cella a flusso. La superficie assorbe stazionario. Le nanosfere si scontreranno con i microtubuli in movimento e si caricheranno su di essi.

In questo esperimento, viene utilizzato un microscopio a fluorescenza eclipse TE 2000 U dotato di un obiettivo ad olio 100x e sito X, una lampada 20 e una fotocamera E-M-C-C-D dell'esone. Per prima cosa, applicare una goccia di olio da immersione sull'obiettivo. Quindi montare la cella di flusso sul tavolino del microscopio utilizzando il cubo filtrante trixy.

Metti a fuoco i micro tubuli, quindi passa al cubo filtrante fitzy per visualizzare le nanosfere. Quindi, apri il programma dell'esone e o I e imposta la modalità di acquisizione su cinetica. Utilizzare un tempo di esposizione di 0,5 secondi, una lunghezza della serie cinetica di 20 e un tempo di ciclo cinetico di sei secondi.

Passa il microscopio dall'oculare alla fotocamera e inizia a scattare le immagini. Per le prime quattro immagini, usa il cubo trixi per visualizzare i microtubuli. Per le prossime 12 immagini, passa al cubo filtro Fitz per acquisire immagini delle nanosfere.

Quindi torna al cubo filtrante trixi. Per le ultime quattro immagini per visualizzare i microtubuli, i microtubuli vengono osservati utilizzando il cubo filtro Trissy, il cubo filtro viene commutato per adattarsi Per visualizzare le nanosfere qui, le nanosfere trasportate dai microtubuli sono identificate dalle frecce. Non tutte le nanosfere sono state rilevate dai microtubuli.

Ora la posizione delle nanosfere viene mostrata 36 secondi dopo, rivelando che le nanosfere si sono spostate. Quando i microtubuli vengono nuovamente visualizzati, diventa evidente che anche i microtubuli hanno viaggiato attraverso il campo visivo. Queste immagini dimostrano che le nanosfere sono state spostate a causa della micro navetta tubaria.

Vi abbiamo appena mostrato come eseguire il test della motilità invertita. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordarsi di cambiare i cubi del filtro durante l'acquisizione delle immagini in modo che sia i microtubuli che le nanosfere possano essere visti. Quindi questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.