Caricamento di merci su Kinesin Navette Powered molecolare
3 novembre 2010
Navette molecolari costituiti da microtubuli funzionalizzati scivolando sulla superficie aderito chinesina proteine motore può servire come sistema di trasporto su scala nanometrica. Qui, l'assemblaggio di un sistema di navetta tipico è descritto.
L'obiettivo generale di questa procedura è caricare le nanosfere sui microtubuli, che si muovono su una superficie rivestita con chinesina in forma di motori. Questo viene ottenuto innanzitutto rivestendo la superficie di una camera di flusso in vetro con una soluzione di caseina. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'assorbire le proteine motrici della chinesina sulla superficie della camera di flusso.
Il terzo passaggio della procedura consiste nell'aggiungere i microtubuli. L'ultimo passaggio della procedura è aggiungere le molecole di streptavidina, che si legheranno ai microtubuli, e successivamente aggiungere le nanosfere. Le nanosfere si legano alla superficie della camera di flusso, dove possono essere raccolte dai microtubuli.
In definitiva, è possibile osservare come le nanosfere vengano raccolte dai microtubuli e trasportate lungo la superficie mediante microscopia a fluorescenza. Ciao, sono Elaine Jen Smith del laboratorio del Dott. Henry Hess e del Dipartimento di Scienza e Ingegneria dei Materiali dell'Università della Florida. Oggi vi mostreremo una procedura per il saggio di motilità invertito.
Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare il caricamento del carico sui microtubuli e il movimento dei trasportatori molecolari. Cominciamo dunque. Prima dell'inizio di questa procedura, preparare frescamente tutte le soluzioni stock come descritto nella parte scritta di questo video.
Dopo aver preparato le soluzioni stock, iniziare la preparazione dei microtubuli pipettando 25 microlitri di soluzione di crescita in un tubo microcentrifuga da 0,65 millilitri. Aggiungere quindi 6,25 microlitri della soluzione di crescita a 20 microgrammi di tubulina biotinilata liofilizzata. Vortexare la soluzione e collocarla in un bagno termico a 37 gradi Celsius per 30 minuti per favorire la polimerizzazione; al termine dell'incubazione, diluire la soluzione 100 volte in Taxol Buffer ed eseguire un vortex delicato.
Questa soluzione serve a stabilizzare i microtubuli. Etichettare la soluzione come vuota 100 e conservarla a temperatura ambiente. Successivamente, preparare una diluizione dieci volte più concentrata di MT 100 nel buffer anti-fade ed etichettare questa soluzione come MT 1000.
Quindi preparare i motori della chinesina diluendo la soluzione di chinesina di 20 volte nel buffer TP. Etichettare la soluzione come chinesina 20x e conservarla sul ghiaccio. Infine, preparare le soluzioni di streptavidina e di nanosfere.
Per prima cosa, aggiungere streptavidina marcata con Alexa Fluor 5 6 8 fino a una concentrazione di 100 nano molari nel Buffer Antifa. Etichettare la soluzione come STV 100, quindi diluire le nanosfere 5.000 volte nel Buffer Antifa ed etichettare questa miscela come NS 5.000. Conservare entrambe le soluzioni sul ghiaccio.
Dopo aver preparato le soluzioni per il saggio di caricamento del carico, costruire una camera di flusso utilizzando un vetrino da copertura e un'ulteriore lamellina di vetro separati da nastro adesivo doppio. Incollare innanzitutto due strisce di nastro adesivo doppio ai bordi del vetrino da copertura, lasciando un'apertura di circa un centimetro tra le strisce. Successivamente, posizionare la lamellina sopra il nastro.
Applicare pressione sul cover slip utilizzando il bordo piatto di una pinzetta per creare un sigillo. La cella di flusso costruita è lunga circa due centimetri, larga un centimetro e alta 100 micron, e ha un volume di circa 20 microlitri. Per iniziare il montaggio del saggio invertito.
Posizionare la punta della pipetta tra il coprioggetto e il vetrino. Quindi iniettare 0,5 milligrammi per millilitro di soluzione di caseina nella cella di flusso. Questo rivestimento della cella di flusso permetterà alla chinesina di mantenere la propria funzionalità dopo l'assorbimento.
Attendere cinque minuti affinché la soluzione di caseina rivesta la superficie. Successivamente, assorbire la chinesina sulla cella di flusso introducendo la chinasi in soluzione 20; le soluzioni vengono introdotte nelle celle di flusso posizionando la punta della pipetta tra il coprioggetto e il vetrino. Quindi, la soluzione viene iniettata nella cella di flusso da un lato, mentre contemporaneamente viene aspirata dall'altro lato.
Con carta da filtro, attendere cinque minuti per consentire al chinasi di assorbire. Successivamente, introdurre i microtubuli nella cella a flusso pipettando la soluzione MT 1000 nella cella a flusso. Attendere cinque minuti affinché i microtubuli si depositino e si attacchino ai motori chinasi dopo l'attaccamento dei microtubuli ai motori chinasi.
Rivestire i microtubuli con streptavidina fluorescente TTR introducendo la soluzione STV 100 nella camera di flusso. Attendere cinque minuti per consentire alle molecole di streptavidina TTR di legarsi ai microtubuli. Rimuovere l'eccesso di streptavidina TTR eseguendo tre lavaggi con 30 microlitri di soluzione Antifa nella camera di flusso.
Infine, introdurre le nanosfere fluorescenti di polistirene biotinilato pipettando la soluzione NS 5.000 nella cella di flusso. La superficie assorbe in modo stazionario. Le nanosfere collidono con i microtubuli in movimento e si legano ad essi.
In questo esperimento, si utilizza un microscopio a fluorescenza Eclipse TE 2000 U dotato di un obiettivo ad immersione da 100x e X site, una lampada 20 e una camera E-M-C-C-D. Applicare innanzitutto una goccia di olio di immersione sull'obiettivo. Quindi montare la cella a flusso sul portacampioni del microscopio utilizzando il cubetto filtro trixy.
Mettere a fuoco i microtubuli, quindi passare al cubo del filtro fitzy per visualizzare le nanosfere. Successivamente, aprire il programma and or I exon e impostare la modalità di acquisizione su cinetica. Utilizzare un tempo di esposizione di 0,5 secondi, una lunghezza della serie cinetica di 20 e un tempo di ciclo cinetico di sei secondi.
Passare dal microscopio all'oculare alla telecamera e iniziare ad acquisire le immagini. Per le prime quattro immagini, utilizzare il cubo trixi per visualizzare i microtubuli. Per le successive 12 immagini, passare al cubo filtro Fitz per acquisire le immagini delle nanosfere.
Quindi tornare al cubo filtro trixi. Per le ultime quattro immagini, destinate all'osservazione dei microtubuli, i microtubuli vengono visualizzati utilizzando il cubo filtro Trissy; il cubo filtro viene commutato su fite per visualizzare le nanosfere. Qui, le nanosfere trasportate dai microtubuli sono indicate dalle frecce. Non tutte le nanosfere sono state prelevate dai microtubuli.
Ora la posizione delle nanosfere viene mostrata 36 secondi dopo, rivelando che le nanosfere si sono spostate. Quando i microtubuli vengono nuovamente immagini, risulta evidente che anche i microtubuli hanno percorso un tratto attraverso il campo visivo. Queste immagini dimostrano che le nanosfere sono state spostate a causa del trasporto mediato dai microtubuli.
Vi abbiamo appena mostrato come eseguire il saggio di motilità invertito. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di cambiare i cubetti filtro durante l'acquisizione delle immagini, in modo da poter visualizzare sia i microtubuli che le nanosfere. Ecco fatto.
Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.
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Panoramica
In questo articolo viene descritta l'assemblaggio di un sistema di trasporto molecolare mediante microtubuli funzionalizzati che scorrono su proteine motrici chinesina. Il sistema funge da meccanismo di trasporto su scala nanometrica, facilitando il caricamento di nanosfere sui microtubuli.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biophysica
- Sistemi di trasporto a scala nanometrica
Sfondo
- I trasportatori molecolari sono essenziali per il trasporto intracellulare.
- I microtubuli e le proteine chinesina svolgono ruoli fondamentali nel movimento cellulare.
- Comprendere questi sistemi può portare a progressi nella nanotecnologia.
- Microtubuli funzionalizzati possono migliorare l'efficienza del trasporto.
Scopo dello studio
- Dimostrare l'assemblaggio di un sistema di trasporto basato sui microtubuli.
- Esplorare l'interazione tra nanosfere e microtubuli.
- Fornire un protocollo ai ricercatori per replicare il sistema.
Metodi Utilizzati
- Rivestimento di una cella a flusso in vetro con soluzione di caseina.
- Assorbimento delle proteine motrici chinesina sulla superficie della cella a flusso.
- Aggiunta di microtubuli al sistema.
- Introduzione di molecole di streptavidina per legarsi ai microtubuli e aggiunta di nanosfere.
Risultati principali
- Le nanosfere si legano con successo alla superficie della cella a flusso.
- I microtubuli possono raccogliere le nanosfere legate.
- Il processo di assemblaggio è riproducibile ed efficiente.
- Questo sistema può essere utilizzato per varie applicazioni di trasporto su scala nanometrica.
Conclusioni
- Il sistema di trasporto basato sui microtubuli è efficace per il trasporto su scala nanometrica.
- Questo metodo può essere adattato per diversi tipi di carico.
- Ulteriori ricerche possono ampliare le applicazioni di questa tecnologia.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
I trasportatori molecolari azionati da chinesina consentono il trasporto programmabile di carichi su scala nanometrica, offrendo una piattaforma per il rilascio e la manipolazione controllati di biomolecole in ambienti sintetici e analitici. Questo sistema supporta la ricerca e sviluppo precoce nel settore biofarmaceutico fornendo un saggio modulare e riproducibile per lo studio dei meccanismi di trasporto attivo e la valutazione delle interazioni molecolari. La sua adattabilità a diversi tipi di carico lo posiziona come strumento riutilizzabile per la validazione di bersagli e lo sviluppo di saggi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi dei percorsi di trasporto molecolare utilizzando interazioni definite tra carico e proteine motrici.
- Consente la validazione funzionale dell'ancoraggio del carico mediato da biotina-streptavidina ai microtubuli.
- Supporta una previsione affidabile negli studi meccanicistici dei processi di trasporto intracellulare.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce una piattaforma standardizzata per il caricamento e il tracciamento di diversi carichi biotinilati, inclusi DNA, anticorpi e nanomateriali.
- Consente letture quantitative e riproducibili mediante microscopia a fluorescenza per il movimento e l'ancoraggio dei carichi.
- Permette la scalabilità del saggio e il riutilizzo della piattaforma per lo screening di composti o biomolecole.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Permette l'adattamento a carichi pertinenti per le malattie, come antigeni o acidi nucleici, per modellare il trasporto in sistemi sintetici.
- Supporta la continuità dalla scoperta meccanicistica allo sviluppo di saggi preclinici per applicazioni basate sul trasporto.
- Fornisce una valutazione predittiva per ridurre i rischi nelle strategie di somministrazione molecolare in ambienti ingegnerizzati.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo sistema molecolare a navetta si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica come saggio modulare per studi sul trasporto, la validazione di bersagli e lo screening delle interazioni tra carico e motore.
- Biologia della scoperta: Consente la verifica di ipotesi sui meccanismi di trasporto attivo e sulla specificità delle vie.
- Screening: Offre risultati quantitativi e riproducibili per valutare il carico e il movimento del cargo.
- Analisi: Fornisce misurazioni basate sulla fluorescenza per confrontare l'attaccamento del cargo e l'efficienza del trasporto.
- Ricerca traslazionale: Permette l'adattamento a cargo rilevanti per le malattie o di tipo terapeutico, per modelli preclinici.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma saggistica riutilizzabile per studi diversificati sul trasporto molecolare.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva negli studi sul trasporto molecolare e sulla validazione degli obiettivi.
- Valore operativo: Fornisce condizioni sperimentali standardizzate, scalabili e riproducibili.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di proseguimento o interruzione nello sviluppo di saggi e piattaforme basati sul trasporto.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata al rischio delle strategie di consegna e trasporto molecolare.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in biochimica delle proteine, microscopia a fluorescenza e microfabbricazione.
- Necessita dell'accesso a sistemi di imaging a fluorescenza e strumenti per l'assemblaggio di celle a flusso microfluidiche.
- Richiede una standardizzazione intersettoriale della funzionalizzazione del carico e delle condizioni del saggio.
- Consente l'adattamento a diversi carichi biotinilati e sistemi modello.
- Limitato a ambienti sintetici in vitro; non direttamente trasferibile a sistemi in vivo senza ulteriore validazione.
