Name: Genoma Analisi dei Aminoacylation (carica) I livelli di tRNA usando i microarrays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-18T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Impara a misurare i livelli di carica del tRNA in Saccharomyces cerevisiae usando microarray. Questo metodo biochimico consente di analizzare le risposte cellulari allo stress con alta affidabilità.

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Il lavoro lievito nel laboratorio Pan è stato finanziato da una sovvenzione da Ajinomoto, Inc. in Giappone e National Institutes of Health di formazione di Grant T32GM007183-33. Ringraziamo il Dott. Ronald Wek presso la Scuola di Medicina dell&#39;Università dell&#39;Indiana di collaborazione a lungo termine sui progetti di lievito. Ringraziamo anche il dottor Kimberly Dittmar per lo sviluppo del tRNA carica metodo microarray.

Parte 1: Isolamento del totale tRNA carico <ol><li> Celle di pellet in una centrifuga da tavolo a 2000 RFC per 5 minuti. L&#39;equivalente di 1 OD 600 di cellule dovrebbero produrre almeno 1μg di RNA totale e un minimo di 30 mg è raccomandato per la procedura. </li><li> Risospendere le cellule in lisi soluzione tampone costituito da 0,3 M tamponato Na +-acetato (pH 4,5) e 10 mM EDTA. Vortex con un uguale volume di Na +-saturata di acetato di fenolo / cloroformio (pH 4,5) per tre volte ciascuno per 30 s. Essere sicuri di mantenere sempre i campioni in ghiaccio tra vortex. Acetato tamponata possono essere preparati da NaOAC e HOAc mentre acetato saturi fenolo / cloroformio può essere preparata mescolando 1 parte 5 M tampone acetato (pH 4.5) con 9 parti di fenolo / cloroformio. Nota: L&#39;RNA totale isolamento viene effettuato in condizioni leggermente acida e sul ghiaccio per evitare deacylation di tRNA carica. </li><li> Centrifugare a 18.600 RFC per 15 minuti a 4 ° C. Rimuovere lo strato acquoso ed eseguire un altro saturata di acetato di estrazione fenolo / cloroformio. </li><li> Dopo la seconda estrazione precipitare l&#39;RNA con l&#39;aggiunta di 2,7 x volumi di etanolo e la centrifugazione a 18.600 RFC per 30 minuti a 4 ° C. </li><li> Risospendere pellet di RNA in una soluzione tampone di lisi e poi precipitare con etanolo una seconda volta. </li><li> Infine, risospendere l&#39;RNA in una soluzione contenente 10 mM di acetato tamponata (pH 4,5) e 1 mM EDTA per il successivo trattamento. Il campione può essere stabilmente conservati a -80 ° C per circa due settimane. Lunga conservazione non è raccomandato in quanto alcuni tRNA carico inizierà a deacylate. </li></ol> Parte 2: elaborazione di norme tRNA <ol><li> Calore E. coli standard tRNA a 10,5 micron a 85 ° C in 45 mM Tris-Cl pH 7.5 per 2 minuti. Prendete il tubo e lasciare a temperatura ambiente per 3 minuti. </li><li> Aggiungi MgCl 2 a una concentrazione finale di 20 mm e incubare a 37 ° C per 5 minuti. </li><li> Aggiungere la miscela di reazione sintetasi così la reazione finale contiene 5 mM tRNA, 60 mM Tris-HCl (pH 7,5), 12,5 mM MgCl 2, 10 mM KCl, 3 mM ditiotreitolo, 1,5 mM ATP, 1 mM spermina, 1 mM dei rispettivi amminoacidi, e 4,2 unità / mL E. coli-tRNA sintetasi mix. Incubare a 37 ° C per 15 minuti. </li><li> Aggiungere un volume equivalente di 0,5 M acetato tamponata (pH 4,5) ed estrarre con saturata di acetato di fenolo / CHCl 3 a pH 4,5. </li><li> Precipitare gli standard tRNA con volumi 2,7 x di etanolo e la centrifugazione a 18.600 RFC per 30 minuti a 4 ° C. </li><li> Risospendere gli standard in 50 mM acetato tamponata (pH 4,5) con 1 mM EDTA e conservare a -80 ° C per un massimo di un mese. </li></ol> Parte 3: Cy3/Cy5 etichettatura dei tRNA <ol><li> Per il campione tRNA carico incubare RNA totale ad una concentrazione di 0,1 mg / mL con 0,066 mM ogni E. coli standard tRNA (cioè 0,67 pmole ogni standard per mcg RNA totale) e 100 mM di tampone acetato (pH 4,5) in presenza di 50 mM NaIO4 per 30 minuti a temperatura ambiente. Per il controllo totale del campione uso tRNA 50 mM NaCl al posto di NaIO4. Ricordati di diluire l&#39;RNA solo con soluzioni tampone per conservare la carica. </li><li> Per placare la reazione aggiungere il glucosio a 100 mm e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. </li><li> Al fine di rimuovere ogni residuo NaIO4 dal campione effettuare uno scambio di buffer utilizzando una colonna di spin G25. Per ottenere i migliori risultati equilibrare la prima colonna eseguendo 200 mM tampone tamponata (pH 4,5) attraverso di essa prima di applicare il vostro campione. </li><li> Precipitare il campione con l&#39;aggiunta di acetato tamponata (pH 4.5) ad una concentrazione finale di 133 mM e NaCl ad una concentrazione finale di 66 mm e 2,7 x volumi di etanolo. Occasionalmente una precipitazione secondo può essere necessaria per i campioni ossidati. Ciò è necessario solo se il pellet appare significativamente diversa rispetto al pellet di controllo del campione stesso. Ad esempio, una molto più grandi o più diffuso pellet. Se una precipitazione in etanolo secondo è necessario risospendere pellet in 50 mM tampone acetato pH 4.5 e 200 mM di NaCl prima dell&#39;aggiunta di etanolo. </li><li> Per deacylation i campioni tRNA sono risospesi in 50 mM Tris-HCl (pH 9) e incubate a 37 ° C per 30 min. La reazione è neutralizzato con l&#39;aggiunta di un uguale volume di 50 mM tampone acetato (pH 4,5) e 100 mM NaCl. Precipitato con 2,7 x volumi di etanolo. Dopo la precipitazione, l&#39;RNA è risospeso in acqua a circa 1 mg / mL. Sia il controllo e campioni ossidato deve essere eseguito su gel di agarosio per verificare la qualità dell&#39;RNA. </li><li> Per collegare i tag oligo fluorescenti sul tRNA 0,1 mg / mL di RNA deacylated è incubato in 1x buffer di ligasi, 15% DMSO, 4 mM Cy3 o Cy5 contenenti oligonucleotidi, 0,5 unità / mL DNA ligasi T4, e lievito exo-fosfatasi (5.000 unità / mL) a 16 ° C per una notte (oltre 16 h). L&#39;eso-fosfatasi è necessaria solo per i campioni ottenuti da lieviti e può essere omitted se questo protocollo è utilizzato per E. coli o di campioni umani. </li><li> Dopo la legatura campioni vengono miscelati con 4 volumi di 50 mM KOAc (pH 7), 200 mM KCl, e poi estratto con un uguale volume di fenolo / cloroformio. Dopo l&#39;estrazione della fase acquosa, le preparazioni di RNA sono precipitati con etanolo e risospeso in acqua per circa 0,1 mg / mL. </li><li> Efficienza legatura può essere valutato eseguendo il 5-10% dei campioni su gel di poliacrilammide 12% a base di urea 7M e visualizzate con uno scanner gel fluorescenti. Questa analisi PAGINA è utile anche per determinare la quantità di ossidato e campioni di controllo necessari per l&#39;ibridazione di microarray. Un buon risultato legatura dovrebbe mostrare ~ 10% o più del oligonucleotide Cy3/Cy5 contenente essere legatura al tRNA. Per i campioni con efficienza corretta etichettatura, 0,1-0,5 mg di RNA totale per campione è usato per l&#39;ibridazione di array. </li></ol> Parte 4: ibridazione e Analisi dei Microarray <ol><li> Prima di diapositive ibridazione microarray vengono bolliti in acqua distillata per 1-2 minuti per rimuovere oligonucleotidi non legati. </li><li> Cy3/Cy5 campioni etichettati sono combinati con 140 ml di buffer di ibridazione e DNA spermatico salmone ad una concentrazione finale di 140 mg / ml e poli (A) ad una concentrazione finale di 70 mg / ml. </li><li> Un programma di ibridazione, (tabella 1), viene eseguito su un Hybridizer serie automatica. Per lavori di tRNA, è altamente raccomandato che una macchina automatica ibridazione essere utilizzato in quanto l&#39;ibridazione manuale produce fondo elevato. </li><li> Dopo che il programma è completato manualmente lavare i vetrini con Lavare 3 soluzione almeno due volte agitando delicatamente in un tubo da 50 ml conica per 3-5 minuti. </li><li> Le diapositive possono essere essiccati mediante centrifugazione a bassa velocità, meno di 200 RFC, per 5-10 minuti. E &#39;importante mantenere le diapositive dalla luce poiché l&#39;esposizione alla luce la candeggina fluorofori. </li><li> Dopo le diapositive sono secchi devono essere acquisiti immediatamente per ottenere risultati ottimali, se necessario, possono essere salvati per diversi giorni in un luogo asciutto buio a temperatura ambiente. Le diapositive possono essere acquisiti 2-3 volte senza degradazione nella qualità dell&#39;immagine. </li></ol> Parte 5: Risultati Rappresentante Quando isolato correttamente il campione totale di RNA dovrebbe produrre uno spettro molto pulita con un 260 OD: OD 280 rapporto vicino a 2. Non ci dovrebbero essere proteine ​​rilevabili o contaminazione fenolo. Quando viene eseguito il 1% gel di agarosio, un gruppo forte tRNA devono essere osservati con altre band possibili acido nucleico che varia tra gli organismi. Dopo l&#39;ossidazione una band pulito tRNA devono essere osservati. Se un campione è notevolmente più debole di altri campioni o macchie si osserva, i campioni non devono essere utilizzati per microarray. Microarray dovrebbe avere sfondo molto basso, che è un ordine di grandezza inferiore a quello dei più deboli sonda tRNA. Elevato background è di solito a causa di problemi durante le fasi di lavaggio. Questo di solito può essere risolto preparando nuove soluzioni di lavaggio e lavaggio a fondo tutte le apparecchiature e le tubazioni per rimuovere residui e precipitato SDS. <table border="1"><tbody><tr><td> Passo </td><td> Dettagli </td></tr><tr><td> O-ring di condizionamento </td><td> 75 ° C, 2 min </td></tr><tr><td> Introdurre campione </td><td> 60 ° C </td></tr><tr><td> Esempio di denaturare </td><td> 90 ° C, 5 min </td></tr><tr><td> Ibridazione </td><td> 60 ° C, 16h </td></tr><tr><td> Lavare 1 </td><td> 50 ° C, 10s flusso tenere &#39;20 </td></tr><tr><td> Lavare 2 </td><td> 42 ° C, 10s flusso tenere &#39;20 </td></tr><tr><td> Lavare 3 </td><td> 42 ° C, 10s flusso tenere &#39;20 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: protocollo di ibridazione

<ol><li>Zaborske, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+tRNA+charging+and+activation+of+the+eIF2+kinase+Gcn2p%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p.</a> J Biol Chem. 284 (37), 25254-25267 (2009).</li>
<li>Wek, S. A., Zhu, S., Wek, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histidyl-tRNA+synthetase-related+sequence+in+the+eIF-2+alpha+protein+kinase+GCN2+interacts+with+tRNA+and+is+required+for+activation+in+response+to+starvation+for+different+amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The histidyl-tRNA synthetase-related sequence in the eIF-2 alpha protein kinase GCN2 interacts with tRNA and is required for activation in response to starvation for different amino acids.</a> Mol Cell Biol. , 4497-4506 (1995).</li>
<li>Hinnebusch, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+Regulation+of+GCN4+and+the+General+Amino+Acid+Control+of+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Translational Regulation of GCN4 and the General Amino Acid Control of Yeast.</a> Annual Review of Microbiology. 59 (1), 407-450 (2005).</li>
<li>Braeken, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+horizons+for+%28p%29ppGpp+in+bacterial+and+plant+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New horizons for (p)ppGpp in bacterial and plant physiology.</a> Trends in Microbiology. 14 (1), 45-54 (2006).</li>
<li>Dong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncharged+tRNA+Activates+GCN2+by+Displacing+the+Protein+Kinase+Moiety+from+a+Bipartite+tRNA-Binding+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Uncharged tRNA Activates GCN2 by Displacing the Protein Kinase Moiety from a Bipartite tRNA-Binding Domain.</a> Molecular Cell. 6 (2), 269-279 (2000).</li>
<li>Cashel, M. The Stringent Response. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCashel%2C+M+%22Escherichia+coli+and+Salmonella%3A+cellular+and+molecular+biology%22">Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology</a>. Neidhardt, F. C. , ASM Press. Washington DC. 1458-1496 (1996).</li>
<li>Dittmar, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+charging+of+tRNA+isoacceptors+induced+by+amino-acid+starvation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation.</a> EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).</li>
<li>Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+levels+of+tRNA+abundance+and+alteration+of+tRNA+charging+by+bortezomib+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">High levels of tRNA abundance and alteration of tRNA charging by bortezomib in multiple myeloma.</a> Biochem Biophys Res Commun. 385 (2), 160-164 (2009).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Vi presentiamo un metodo per determinare simultaneamente i livelli relativi di carica di tutti i tRNA su scala genomica. Il protocollo presentato qui è stato ottimizzato per S. cerevisiae, ed è anche stato utilizzato con successo per misurare profili tRNA carica in E. coli e colture di cellule umane. Può essere modificato per adattarsi a qualsiasi organismo con una sequenza genomica nota (che consente per l&#39;annotazione di tutti i geni tRNA) finché totale tRNA carica può essere ottenuto.

<table><tbody><tr><td>Colonne Microspin G-25</td><td>GE Healthcare</td><td>25-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA&lt;sup&gt;Phe&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3143</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA&lt;sup&gt;Tyr&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0258</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA&lt;sup&gt;Lys&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6018</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; aminoacil-tRNA sintetasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3646</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligasi</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>70042X</td><td></td></tr><tr><td>PerfectHyb Plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-7033</td><td></td></tr><tr><td>Stazione Hyb4</td><td>Digilab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scanner GenePix 4000B</td><td>Axon instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GenePix 6.0</td><td>Axon instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

genoma analisi dei aminoacylation (carica) i livelli di trna usando i microarrays

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

aminoacylation tRNA, o la ricarica, i livelli possono cambiare rapidamente all&#39;interno di una cellula in risposta all&#39;ambiente [1]. Cambiamenti nei livelli di tRNA di ricarica nelle cellule, sia procarioti ed eucarioti portare alla regolamentazione traslazionale, che è un importante meccanismo di risposta allo stress cellulare. Esempi familiari sono la risposta a rigorosi<em&gt; E. coli</em&gt; E il percorso Gcn2 risposta allo stress nel lievito ([2-6]). Recenti lavori in<em&gt; E. coli</em&gt; E<em&gt; S. Saccharomyces</em&gt; Hanno dimostrato che i modelli di tRNA di ricarica sono molto dinamici e dipende dal tipo di stress sperimentato dalle cellule [1, 6, 7]. La altamente dinamico, la natura variabile del tRNA ricarica rende indispensabile per determinare i cambiamenti nei livelli di tRNA carica su scala genomica, al fine di chiarire completamente la risposta cellulare alle variazioni ambientali. In questa recensione vi presentiamo un metodo per misurare simultaneamente i livelli relativi di carica di tutti i tRNA in<em&gt; S. Saccharomyces</em&gt;. Mentre il protocollo presentato qui è per il lievito, questo protocollo è stato applicato con successo per determinare relativi livelli di carica in una grande varietà di organismi tra cui<em&gt; E. coli</em&gt; E le culture di cellule umane [7, 8].

Descriviamo un metodo per l&#39;analisi di microarray per determinare i livelli aminoacylation relativa di tutti i tRNA da<em&gt; S. cerivisiae.</em

Genoma Analisi dei Aminoacylation (carica) I livelli di tRNA usando i microarrays

I livelli di aminoacilazione, o carica, del tRNA possono variare rapidamente all'interno di una cellula in risposta all'ambiente[1]. Le variazioni nei livelli di carica del tRNA sia in...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è determinare le variazioni relative nei livelli di carico dell'RNA transfer (TRNA). Questo viene ottenuto isolando l'RNA a pH basso prima e dopo il trattamento, al fine di ottenere un TRNA con livelli di carico intatti. Come secondo passaggio, l'RNA viene sottoposto a un trattamento di ossidazione con periodato, che consente di determinare i livelli relativi di carico. Successivamente, legare i campioni a un oligonucleotide fluorescente e ibridarli su un microarray al fine di misurare le variazioni nei livelli di legatura dovute al caricamento di A-T-R-N-A; vengono ottenuti i risultati. Le variazioni a livello genomico del CHO nel caricamento degli tRNA in base alla tecnologia del microarray per tRNA. Ciao, sono John Zai del laboratorio del Dottor DRT Pan del dipartimento di Biochimica e biologia molecolare dell'Università di Chicago.Oggi vi mostrerò una procedura per isolare e misurare il tRNA carico a livello genomico. Utilizziamo questo metodo per misurare le variazioni nel carico del tRNA durante stimoli di stress nel nostro laboratorio. Cominciamo dunque.Per isolare il carico totale di tRNA, iniziare coltivando almeno l'equivalente di 30 OD 600 di cellule di lievito, il che dovrebbe produrre 30 microgrammi di RNA totale. Centrifugare le cellule in una centrifuga da banco. Ri-sospendere le cellule in una soluzione tampone per la lisi. Aggiungere un volume uguale di acetato di sodio, fenolo cloroformato saturo e vortexare per 30 secondi, seguito da raffreddamento sul ghiaccio per almeno 30 secondi.Ripetere la vortexazione e il tritamento altre due volte. Centrifugare il campione a 18.600 RFC per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi rimuovere il livello acquoso ed eseguire un'altra estrazione con fenile cloroformio satura di acetato dopo la seconda estrazione.Precipitare l'RNA aggiungendo 2,7 volumi di etanolo e centrifugando a 18.600 ×g per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Risospendere i pellet di RNA in soluzione tampone di lisi e quindi precipitare nuovamente con etanolo. Infine, risospendere l'RNA in una soluzione contenente acetato tampone 10 millimolare ed EDTA 1 millimolare per il successivo trattamento.Il campione può essere conservato stabilmente a meno 80 gradi Celsius per circa due settimane in più. La conservazione non è raccomandata poiché alcune TNA cariche inizieranno a deacilarsi prima dell'etichettatura con i marcatori oligonucleotidici fluorescenti S3 o SCI cinque. L'RNA totale viene sottoposto a un trattamento di ossidazione con paraidite, che consente la determinazione dei livelli relativi di carica; si mescola l'RNA totale con 0,066 micromolare di ciascuno standard eco irna e acetato tamponato 100 millimolare in presenza di paraidite di sodio 50 millimolare. Per il campione di RNA di controllo che non verrà ossidato, si utilizza cloruro di sodio 50 millimolare al posto della paraidite di sodio.Incubare le reazioni per 30 minuti a temperatura ambiente; trascorsi 30 minuti, arrestare la reazione aggiungendo glucosio fino a una concentrazione finale di 100 millimolari e incubando a temperatura ambiente per cinque minuti. Una volta arrestata la reazione, eseguire uno scambio di tampone utilizzando una colonna G 25 da centrifuga per rimuovere eventuali residui di prorato di sodio dai campioni. Precipitare i campioni aggiungendo acetato tampone a una concentrazione finale di 133 millimolari di cloruro di sodio a una concentrazione finale di 66 millimolari e 2,7 volumi di etanolo.Successivamente, isolare i campioni di tRNA mediante Resus, sospedendoli in 50 millimoli di tris HCl e incubando a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo 30 minuti, neutralizzare la reazione aggiungendo un volume uguale di acetato tamponato 50 millimolare e cloruro di sodio 100 millimolare, quindi precipitare con 2,7 volumi di etanolo. Ri-sospendere il pellet di RNA in acqua a una concentrazione di circa un microgrammo per microlitro.Dopo aver verificato la qualità dell'RNA dei campioni di controllo e ossidati mediante elettroforesi su gel di agarosio, si può procedere con la marcatura fluorescente per l'aggiunta di oligo etichette fluorescenti sul tRNA. Combinare 0,1 microgrammi per microlitro di RNA con oligonucleotidi contenenti SI3 o SI5 a quattro micromolari, buffer per ligasi 1, tampone 15% DMSO, 0,5 unità per microlitro di DNA ligasi T4 ed esofosfatasi da lievito; incubare a 16 gradi Celsius per oltre 16 ore. Dopo la ligazione, mescolare i campioni con quattro volumi di acetato di potassio e cloruro di potassio, quindi effettuare un'estrazione con un volume uguale di fenolo-cloroformio. Dopo l'estrazione della fase acquosa, precipitare le preparazioni di RNA con etanolo. Infine, risospendere i pellet di RNA in acqua fino a una concentrazione di circa 0,1 microgrammi per microlitro prima dell'ibridazione. Trattare le lamelle per microarray e acqua distillata per uno o due minuti per rimuovere gli oligonucleotidi non legati.Successivamente, combinare i cinque campioni etichettati S3 o SCI con 140 microlitri di buffer di ibridazione contenente DNA di sperma di salmone a una concentrazione finale di 140 microgrammi per millilitro e poli A a una concentrazione finale di sette D microgrammi per millilitro, quindi eseguire un programma di ibridazione su un ibridizzatore automatico per microarray. Si raccomanda vivamente l'uso di una macchina automatica per l'ibridazione nel lavoro con tRNA, poiché l'ibridazione manuale produce un background elevato. Al termine del programma di ibridazione, lavare manualmente le lamelle con la soluzione di lavaggio tre agitando delicatamente in un tubo conico da 50 millilitri per tre-cinque minuti.Lavare i vetrini almeno due volte in provette precedentemente avvolte con carta d'alluminio. Asciugare i vetrini centrifugandoli a bassa velocità per cinque-dieci minuti per ottenere risultati ottimali. I vetrini devono essere scansionati immediatamente dopo l'essiccazione.Le diapositive possono essere scansionate due o tre volte senza un degrado evidente della qualità dell'immagine. Di seguito sono mostrati risultati rappresentativi di un campione di RNA totale correttamente isolato e della sua analisi. Questo campione presenta uno spettro molto pulito con un rapporto OD 260/OD 280 prossimo a 2 e senza alcuna contaminazione rilevabile da proteine o fenolo quando analizzato su gel di agarosio al 1%. Sia i campioni ossidati che i controlli dovrebbero mostrare una banda TNA intensa, mentre altre bande di acidi nucleici possono variare a seconda degli organismi.Se un campione è visibilmente più debole rispetto ad altri campioni, oppure se si osserva uno strisciamento, i campioni non devono essere utilizzati per i microarray. I microarray devono presentare un fondo molto basso, di un ordine di grandezza inferiore rispetto alla sonda TRNA più debole. Vi ho appena mostrato come isolare e determinare i livelli relativi di carica della TRNA durante l'esecuzione di questa procedura.È importante ricordare di mantenere i propri reagenti privi di nucleasi, specialmente durante i passaggi di ossidazione e dilatazione. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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