Genoma Analisi dei Aminoacylation (carica) I livelli di tRNA usando i microarrays

L'obiettivo generale del seguente esperimento è determinare le variazioni relative nei livelli di carico dell'RNA transfer (TRNA). Questo viene ottenuto isolando l'RNA a pH basso prima e dopo il trattamento, al fine di ottenere un TRNA con livelli di carico intatti. Come secondo passaggio, l'RNA viene sottoposto a un trattamento di ossidazione con periodato, che consente di determinare i livelli relativi di carico.

Successivamente, legare i campioni a un oligonucleotide fluorescente e ibridarli su un microarray al fine di misurare le variazioni nei livelli di legatura dovute al caricamento di A-T-R-N-A; vengono ottenuti i risultati. Le variazioni a livello genomico del CHO nel caricamento degli tRNA in base alla tecnologia del microarray per tRNA. Ciao, sono John Zai del laboratorio del Dottor DRT Pan del dipartimento di Biochimica e biologia molecolare dell'Università di Chicago.

Oggi vi mostrerò una procedura per isolare e misurare il tRNA carico a livello genomico. Utilizziamo questo metodo per misurare le variazioni nel carico del tRNA durante stimoli di stress nel nostro laboratorio. Cominciamo dunque.

Per isolare il carico totale di tRNA, iniziare coltivando almeno l'equivalente di 30 OD 600 di cellule di lievito, il che dovrebbe produrre 30 microgrammi di RNA totale. Centrifugare le cellule in una centrifuga da banco. Ri-sospendere le cellule in una soluzione tampone per la lisi. Aggiungere un volume uguale di acetato di sodio, fenolo cloroformato saturo e vortexare per 30 secondi, seguito da raffreddamento sul ghiaccio per almeno 30 secondi.

Ripetere la vortexazione e il tritamento altre due volte. Centrifugare il campione a 18.600 RFC per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi rimuovere il livello acquoso ed eseguire un'altra estrazione con fenile cloroformio satura di acetato dopo la seconda estrazione.

Precipitare l'RNA aggiungendo 2,7 volumi di etanolo e centrifugando a 18.600 ×g per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Risospendere i pellet di RNA in soluzione tampone di lisi e quindi precipitare nuovamente con etanolo. Infine, risospendere l'RNA in una soluzione contenente acetato tampone 10 millimolare ed EDTA 1 millimolare per il successivo trattamento.

Il campione può essere conservato stabilmente a meno 80 gradi Celsius per circa due settimane in più. La conservazione non è raccomandata poiché alcune TNA cariche inizieranno a deacilarsi prima dell'etichettatura con i marcatori oligonucleotidici fluorescenti S3 o SCI cinque. L'RNA totale viene sottoposto a un trattamento di ossidazione con paraidite, che consente la determinazione dei livelli relativi di carica; si mescola l'RNA totale con 0,066 micromolare di ciascuno standard eco irna e acetato tamponato 100 millimolare in presenza di paraidite di sodio 50 millimolare. Per il campione di RNA di controllo che non verrà ossidato, si utilizza cloruro di sodio 50 millimolare al posto della paraidite di sodio.

Incubare le reazioni per 30 minuti a temperatura ambiente; trascorsi 30 minuti, arrestare la reazione aggiungendo glucosio fino a una concentrazione finale di 100 millimolari e incubando a temperatura ambiente per cinque minuti. Una volta arrestata la reazione, eseguire uno scambio di tampone utilizzando una colonna G 25 da centrifuga per rimuovere eventuali residui di prorato di sodio dai campioni. Precipitare i campioni aggiungendo acetato tampone a una concentrazione finale di 133 millimolari di cloruro di sodio a una concentrazione finale di 66 millimolari e 2,7 volumi di etanolo.

Successivamente, isolare i campioni di tRNA mediante Resus, sospedendoli in 50 millimoli di tris HCl e incubando a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo 30 minuti, neutralizzare la reazione aggiungendo un volume uguale di acetato tamponato 50 millimolare e cloruro di sodio 100 millimolare, quindi precipitare con 2,7 volumi di etanolo. Ri-sospendere il pellet di RNA in acqua a una concentrazione di circa un microgrammo per microlitro.

Dopo aver verificato la qualità dell'RNA dei campioni di controllo e ossidati mediante elettroforesi su gel di agarosio, si può procedere con la marcatura fluorescente per l'aggiunta di oligo etichette fluorescenti sul tRNA. Combinare 0,1 microgrammi per microlitro di RNA con oligonucleotidi contenenti SI3 o SI5 a quattro micromolari, buffer per ligasi 1, tampone 15% DMSO, 0,5 unità per microlitro di DNA ligasi T4 ed esofosfatasi da lievito; incubare a 16 gradi Celsius per oltre 16 ore. Dopo la ligazione, mescolare i campioni con quattro volumi di acetato di potassio e cloruro di potassio, quindi effettuare un'estrazione con un volume uguale di fenolo-cloroformio. Dopo l'estrazione della fase acquosa, precipitare le preparazioni di RNA con etanolo. Infine, risospendere i pellet di RNA in acqua fino a una concentrazione di circa 0,1 microgrammi per microlitro prima dell'ibridazione. Trattare le lamelle per microarray e acqua distillata per uno o due minuti per rimuovere gli oligonucleotidi non legati.

Successivamente, combinare i cinque campioni etichettati S3 o SCI con 140 microlitri di buffer di ibridazione contenente DNA di sperma di salmone a una concentrazione finale di 140 microgrammi per millilitro e poli A a una concentrazione finale di sette D microgrammi per millilitro, quindi eseguire un programma di ibridazione su un ibridizzatore automatico per microarray. Si raccomanda vivamente l'uso di una macchina automatica per l'ibridazione nel lavoro con tRNA, poiché l'ibridazione manuale produce un background elevato. Al termine del programma di ibridazione, lavare manualmente le lamelle con la soluzione di lavaggio tre agitando delicatamente in un tubo conico da 50 millilitri per tre-cinque minuti.

Lavare i vetrini almeno due volte in provette precedentemente avvolte con carta d'alluminio. Asciugare i vetrini centrifugandoli a bassa velocità per cinque-dieci minuti per ottenere risultati ottimali. I vetrini devono essere scansionati immediatamente dopo l'essiccazione.

Le diapositive possono essere scansionate due o tre volte senza un degrado evidente della qualità dell'immagine. Di seguito sono mostrati risultati rappresentativi di un campione di RNA totale correttamente isolato e della sua analisi. Questo campione presenta uno spettro molto pulito con un rapporto OD 260/OD 280 prossimo a 2 e senza alcuna contaminazione rilevabile da proteine o fenolo quando analizzato su gel di agarosio al 1%. Sia i campioni ossidati che i controlli dovrebbero mostrare una banda TNA intensa, mentre altre bande di acidi nucleici possono variare a seconda degli organismi.

Se un campione è visibilmente più debole rispetto ad altri campioni, oppure se si osserva uno strisciamento, i campioni non devono essere utilizzati per i microarray. I microarray devono presentare un fondo molto basso, di un ordine di grandezza inferiore rispetto alla sonda TRNA più debole. Vi ho appena mostrato come isolare e determinare i livelli relativi di carica della TRNA durante l'esecuzione di questa procedura.

È importante ricordare di mantenere i propri reagenti privi di nucleasi, specialmente durante i passaggi di ossidazione e dilatazione. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.