Laser Microdissezione Cattura di Drosophila Neuroni periferici

La MICRODISSEZIONE CON LASER o LCM si è affermata come uno strumento estremamente potente che può essere utilizzato per isolare tipi cellulari specifici da sezioni di tessuto con un elevato grado di risoluzione spaziale e precisione. Qui, la LCM viene impiegata per dissezionare neuroni periferici da larve di oph di terzo stadio larvale. Le larve di terzo stadio vengono incluse in uno stampo criogenico e congelate, quindi uno stato criogenico viene utilizzato per tagliare sezioni seriali di tessuto, che vengono posizionate su vetrini, scongelate e fissate in etanolo al 70%.

I vetrini vengono quindi incubati con tripsina per rimuovere i cuticoli larvali residui e sottoposti a disidratazione mediante gradiente di etanolo e chiarificazione con xilene. Successivamente, un cappuccio per microdissezione laser (LCM) viene posizionato sulla sezione di tessuto e cellule neuronali fluorescenti selezionate vengono catturate utilizzando un laser a impulsi. Infine, l'RNA viene isolato dalle cellule catturate per applicazioni successive, come analisi di R-T-P-C-R quantitativa o microarray.

Ciao, sono Dan Cox del Dipartimento di Biologia Molecolare e Microbiologia e dell'Istituto Krasnow per lo Studio Avanzato presso la George Mason University. Ciao, sono Ish AER del laboratorio del Dott. Dan Cox. Oggi vi mostreremo un procedimento per l'isolamento cellulare e la purificazione dell'RNA di singoli o multipli neuroni periferici di drosophila mediante microdissezione laser assistita.

Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare i meccanismi molecolari che mediano la morfogenesi del tasso DIN specifica della classe. Cominciamo dunque. Tutte le procedure mostrate in questo video vengono eseguite in condizioni rigorosamente prive di RNAsi, seguendo procedure standard.

Iniziare questo protocollo raccogliendo da 30 a 40 larve di terzo stadio adulte. Lavare le larve in acqua doppio-distillata.

Risciacquare brevemente per eliminare gli RNA, quindi lavare ancora una volta con acqua bidistillata. Per rimuovere gli RNA, utilizzare un fazzoletto Kim pulito per asciugare completamente qualsiasi residuo d'acqua. Successivamente, prendere uno stampo pulito per inclusione di tessuti e aggiungere uno strato sottile di OCT.

Posizionare lo stampo su un blocco di ghiaccio per raffreddarlo a zero gradi Celsius. Utilizzando pinzette, posizionare le larve pulite e l'OCT freddo. La bassa temperatura dell'OCT aiuterà a ridurre il movimento delle larve.

Durante il processo di inclusione, disporre le larve in modo parallelo l'una rispetto all'altra. Una volta disposte le larve, riempire lentamente lo stampo con OCT senza disturbarle. Successivamente congela rapidamente.

Congelare lo stampo appoggiandolo sull'anidride carbonica solida. Questo garantirà che la larva sia disposta lungo un singolo piano, massimizzando il numero di cellule disponibili per sezione. Utilizzando un criostato.

Tagliare sezioni congelate di spessore compreso tra cinque e otto micrometri su vetrini in vetro non trattati e privi di carica, etichettati e privi di RNAsi. Conservare i vetrini sul ghiaccio secco, quindi trasferirli a meno 80 gradi Celsius fino al momento della microdissezione. Tutte le soluzioni per la disidratazione devono essere preparate al momento prima di ogni sessione di LCM.

La completa disidratazione di sezioni di tessuto larvale congelate è essenziale per ottenere un'efficienza ottimale della microdissezione. Rimuovere i vetrini contenenti le sezioni di tessuto larvale congelate dal congelatore a meno 80 gradi Celsius e posizionarli sul ghiaccio secco. Prelevare un singolo vetrino dalla scatola dei vetrini e posizionarlo immediatamente in un tubo conico da 50 millilitri riempito con etanolo al 70% per tre-dieci secondi.

Quindi risciacquare il vetrino in un tubo conico da 50 millilitri riempito con acqua distillata doppia priva di RNAsi per cinque-dieci secondi per rimuovere la cuticola dalle sezioni di tessuto, che potrebbe interferire con il recupero mediante LCM. Pipettare delicatamente 50 microlitri di tripsina al 2,5% direttamente sulla sezione di tessuto e incubare per cinque-trenta secondi a temperatura ambiente; risciacquare brevemente le sezioni in un tubo conico da 50 millilitri contenente acqua distillata doppia priva di RNAsi per rimuovere la tripsina e eventuali frammenti di cuticola debolmente aderenti. Completare il processo di disidratazione immergendo i vetrini sequenzialmente nelle seguenti soluzioni.

70%etanolo, 95%etanolo, 100%etanolo, 100%etanolo, 100%xilene. E infine, un’altra volta in 100%xilene. Dopo la disidratazione, asciugare completamente i vetrini sotto un flusso d’aria leggero per 60-120 secondi a temperatura ambiente.

Se possibile, eseguire la microdissezione in una stanza con umidità controllata per evitare qualsiasi riduzione dell'efficienza dovuta all'aumento dell'umidità. Accendere innanzitutto l'alimentazione del microscopio e del box di controllo del laser. Caricare i tappi sull'assiemino porta-tappi utilizzando tappi H-S-L-C-M.

Ogni capsula è in grado di catturare numerose cellule. Successivamente, aprire il software dei dispositivi molecolari e inserire i dettagli dell'esperimento, inclusi il numero del vetrino e i numeri dei lotti delle capsule. Posizionare il vetrino con le sezioni di tessuto larvale sul palchetto del microscopio per la microdissezione.

Caricare un nuovo tappo HS LCM dal cartuccio sull'apparecchio P cell two ELCM e posizionarlo correttamente rispetto al joystick per garantire un allineamento preciso del tappo rispetto all'area di cattura; individuare quindi le cellule marcate con fluorescenza nelle linee transgeniche reporter PPK GAL four U-A-S-M-C-D eight GFP o 21 7 G four UASM CD eight GFP. I neuroni dell'arborizzazione dendritica, o neuroni DA, del sistema nervoso periferico possono essere facilmente identificati mediante la fluorescenza GFP. Per massimizzare la specificità, selezionare cellule con un segnale fluorescente intenso e un minimo sovrapposizione cellulare.

Successivamente, regolare i parametri di potenza e durata dell'impulso laser per ottenere un punto preciso di polimero fuso le cui dimensioni corrispondono alla dimensione del punto laser selezionata per la microdissezione di singoli neuroni DA di classe. Si raccomandano le seguenti impostazioni: diametro del punto 7,5 micrometri, intensità del laser da 30 a 50 milliwatt, tempo del laser da due a quattro millisecondi e da uno a due impulsi per cellula.

Le impostazioni del laser possono variare in base al tipo di tessuto, allo spessore del tessuto e al tipo di capsula utilizzata per la LCM. In definitiva, le impostazioni del laser richiedono test empirici per ottenere risultati ottimali di cattura. Successivamente, sottoporre il tessuto a LCM.

Durante la LCM, il cappuccio viene posizionato sulla zona di interesse e un laser a infrarossi a bassa potenza. L'impulso viene diretto attraverso il cappuccio su un sottile film polimerico termolabile posto sopra la cellula o le cellule di interesse. Quando viene emesso l'impulso laser, il film si ammorbidisce, aderisce alle cellule bersaglio e si risolidifica con le cellule di interesse attaccate ad esso.

Quando il cappuccio viene sollevato dalla sezione di tessuto, la o le cellule vengono microdissezionate dal tessuto circostante per catturare ulteriori cellule in un nuovo campo e ripetere il processo. Una volta che le cellule di interesse sono state catturate, sollevare il cappuccio di microdissezione laser (LCM) e posizionarlo su un vetrino pulito per verificare la presenza delle cellule catturate e l'assenza di cellule indesiderate o detriti. Acquisire un'immagine del cappuccio LCM HS utilizzando illuminazione a fluorescenza e luce trasmessa.

Attaccare il cappuccio contenente le cellule microdissezionate a un dispositivo di estrazione. Quindi aggiungere 12 microlitri di tampone per l'estrazione dell'RNA sulla superficie del cappuccio e collegare una provetta a pareti sottili capovolta come mostrato qui. Posizionare l'insieme su un vassoio di allineamento e coprirlo con un blocco di incubazione preriscaldato.

Quindi posizionare il vassoio in un incubatore a 42 gradi Celsius per 30 minuti dopo la centrifuga di incubazione. Centrifugare i tubi contenenti gli estratti a 800 volte la forza di gravità per due minuti. Dopo aver rimosso i tubi dalla centrifuga, chiuderli e conservare gli estratti cellulari a -80 gradi Celsius fino al momento della purificazione dell'estratto di RNA e della purificazione colonnare dell'RNA.

Secondo le istruzioni del kit di estrazione dell'RNA pico pure, il trattamento del DNA è facoltativo e può essere eseguito in colonna durante la purificazione dell'RNA, se necessario. Una volta purificato l'RNA, conservarlo a meno 80 gradi Celsius. È stata utilizzata la microdissezione con laser per isolare singoli neuroni dopaminergici specifici per classe o multipli di Drosophila da larve di terzo stadio.

La LCM consente un elevato grado di precisione e specificità nell'isolamento dei corpi cellulari dei neuroni D di Drosophila. Qui è mostrata un'immagine rappresentativa di una sezione di tessuto di otto micron disidratata e trattata con tripsina. Prima di eseguire la LCM, due neuroni DA di classe quattro sono marcati con GFP.

La freccia indica il neurone evidenziato per la cattura. Il corpo cellulare del neurone evidenziato viene microdissecato in modo preciso e con elevata specificità dalla sezione di tessuto. L'insetto mostra una vista endone di un singolo neurone DA di classe quattro catturato sul tappo del microdissecatore laser (LCM).

L'RNA totale purificato dai neuroni DA isolati si è rivelato di eccellente qualità, come indicato dalla presenza di picchi nitidi dell'RNA ribosomiale 5.8S e 28S, analizzati mediante bioanalizzatore Agilent 2100. È stata eseguita una PCR quantitativa in tempo reale con trascrizione inversa del marcatore specifico per il gene neuronale Lev, al fine di valutare l'arricchimento specifico per cellule neuronali delle cellule isolate, utilizzando il metodo delta delta CT. Un arricchimento superiore a 2,5 volte nei livelli di Lev è stato osservato nei neuroni DA catturati mediante microdissezione laser (LCM) rispetto all'intero animale.

È stato appena mostrato come isolare e purificare l'RNA da neuroni Joss o periferici mediante microdissezione laser. Quando si esegue questa procedura, è importante ottimizzare la concentrazione di tripsina e il tempo di digestione in base al tessuto da microdissezionare e allo spessore delle sezioni. Tempi di incubazione più lunghi possono provocare la perdita delle cellule di interesse dalle sezioni di tessuto, mentre un tempo di incubazione troppo breve potrebbe non essere sufficiente per rimuovere l'esoscheletro larvale, con conseguente inefficienza della LCM.

È importante che tutte le soluzioni per la disidratazione dei tessuti siano preparate fresche. Inoltre, per evitare danni al polimero del cappuccio per LCM, il xilene deve essere completamente evaporato prima della LCM. Infine, per preservare l'integrità dell'RNA dalle cellule purificate, è essenziale mantenere condizioni di protezione dell'RNA per tutta la durata della procedura.

Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.