Iniezione della vena caudale: un metodo per somministrare cellule tumorali per studi metastatici in un modello murino

Inizia aggiungendo la tripsina in una capsula di Petri contenente cellule marcate del cancro al seno per staccarle dalla superficie. Aggiungere un terreno contenente siero per fermare l'azione della tripsina. Trasferire la sospensione della cella in una provetta conica e centrifugarla in una cella a pellet.

Scartare il surnatante e risospendere le cellule in soluzione salina tamponata con fosfato. Posizionare il tubo sul ghiaccio per rallentare il metabolismo cellulare. Caricare questa sospensione cellulare contenente la quantità richiesta di cellule in una siringa Luer lock e fissare un ago su di essa.

Metti un topo in un sistema di ritenuta per roditori con la coda all'esterno. Immergi la coda in acqua tiepida per dilatare le vene. Ci sono due vene sui lati laterali e un'arteria sul lato ventrale della coda. Pulire la coda con alcool, inserire l'ago e iniettare la sospensione cellulare.

Una volta nel flusso sanguigno, le cellule tumorali iniettate invadono gli organi, come i polmoni, e proliferano. Rimuovere lentamente l'ago e utilizzare una garza sterile sul sito di iniezione per applicare pressione per fermare l'emorragia. Rimetti il mouse nella sua gabbia e assicurati un recupero completo. Nel seguente protocollo, dimostriamo l'iniezione di cellule tumorali metastatiche marcate in un modello murino per quantificare le metastasi e la colonizzazione del cancro al seno.

Aspirare il terreno e sciacquare le piastre cellulari con 1X PBS. Tripsinizzare le cellule con 5 millilitri di tripsina per piastra da 15 centimetri per due-cinque minuti e trasferire tutte le cellule in una provetta conica. Lavare le cellule rimanenti dalla piastra di coltura tissutale con una quantità sufficiente di terreno di crescita completo per estinguere la tripsina. Aggiungere il lavaggio nello stesso tubo conico. Conta le celle utilizzando un contatore di celle automatico per determinare il numero totale di celle.

Quindi, centrifugare le cellule a 122 volte G per tre minuti e aspirare il surnatante. Risospendere le cellule in 1X PBS alla concentrazione desiderata. Qui, 25.000 cellule vengono iniettate in ogni topo in 100 microlitri di PBS, quindi le cellule risospese sono a 250.000 cellule per millilitro. Mantenere le sospensioni cellulari in ghiaccio fino all'iniezione.

Lavorando in una cappa presso la struttura per animali, mescolare delicatamente ma accuratamente le cellule capovolgendo il tubo o utilizzando una siringa da 1 millilitro per assicurarsi che siano ririsospese uniformemente. Ora, caricare una siringa Luer lock da 1 millilitro con sospensione cellulare ed espellere le bolle d'aria in eccesso. Posizionare un ago da 1/2 pollice calibro 30 sulla siringa con lo smusso rivolto verso l'alto ed espellere le bolle d'aria.

Posiziona delicatamente il mouse in un sistema di ritenuta per roditori. La vena caudale laterale dovrebbe essere visibile e dilatata. In caso contrario, pizzica delicatamente la base della coda e immergi la coda in acqua tiepida del rubinetto per dilatare le vene. Usa una salvietta imbevuta di alcol per pulire la coda. Quindi inserire l'ago nella vena caudale, con il lato smussato rivolto verso l'alto, e iniettare 100 microlitri di sospensione cellulare. Se l'ago è inserito correttamente nella vena, dovrebbe scivolare facilmente leggermente avanti e indietro e non dovrebbe esserci resistenza quando lo stantuffo viene spinto.

Le iniezioni riuscite dovrebbero anche provocare un rossore, in cui il colore blu della vena diventa bianco per alcuni secondi dopo l'iniezione. Rimuovere lentamente l'ago e, utilizzando una garza sterile, applicare pressione sul sito di iniezione per arrestare l'eventuale sanguinamento. Rimetti il mouse nella sua gabbia e monitora per 15 minuti per garantire il pieno recupero.