Coltura tridimensionale di cellule di carcinoma polmonare: un metodo per studiare le interazioni cellula-matrice

- Innanzitutto, scongelare le fiale della matrice della membrana basale a 4 gradi Celsius durante la notte. La matrice della membrana basale è costituita da proteine presenti nel microambiente tumorale che aiutano a mantenere le caratteristiche delle cellule tumorali in vitro. Il giorno successivo, posizionare la fiala della matrice della membrana basale sul ghiaccio per mantenere la matrice allo stato liquido. Prendi le cellule tumorali del polmone in una provetta da centrifuga pre-raffreddata e centrifuga a 4 gradi Celsius. Aspirare il surnatante e picchiettare delicatamente per rimuovere il pellet e metterlo sul ghiaccio. Quindi, aggiungere un volume appropriato di miscela di membrana basale in questa provetta e mescolare per ottenere una sospensione cellulare uniforme. Eseguire tutti i passaggi a bassa temperatura per evitare che la membrana basale si gelifichi.

Trasferire un volume appropriato di sospensione di matrice cellulare al centro di ciascun pozzetto in una piastra a pozzetti preraffreddata, coprendo l'intero pozzetto. Incubare la piastra a pozzetti per solidificare la matrice. Esaminare al microscopio per garantire una distribuzione uniforme delle cellule all'interno della matrice. Aggiungere il terreno completo di coltura 3D in ogni pozzetto e incubare a 37 gradi Celsius. Questo mezzo facilita le interazioni con la matrice cellulare. Pertanto, le cellule formano organoidi con strutture simili ad acinari. Nel seguente protocollo, eseguiremo la coltura 3D di cellule di carcinoma polmonare TUM622.

Per iniziare, scongelare le fiale di matrice della membrana basale in un frigorifero a 4 gradi Celsius durante la notte. Raffreddare le pipette di plastica da due millilitri e i puntali a meno 20 gradi Celsius durante la notte. Il giorno successivo, riscaldare i reagenti utilizzati per dissociare le cellule TUM622, il tampone HEPES, la tripsina-EDTA e il tampone di neutralizzazione della tripsina in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Togli la matrice della membrana del basamento scongelata dal frigorifero e metti la fiala sul ghiaccio. Raffreddare le piastre di coltura tissutale su un dispositivo di raffreddamento con piattaforma metallica posizionato sul ghiaccio. Posizionare le provette da centrifuga su una griglia di raffreddamento in metallo su ghiaccio. Calcolare la quantità di cellule necessarie, in base al numero di pozzetti e alla concentrazione di cellule in ciascun pozzetto, per essere preparati. Trasferire la sospensione di celle TUM622 in una provetta da centrifuga raffreddata e centrifugare a 300 volte g in una centrifuga a secchio sospeso a 4 gradi Celsius per cinque minuti.

Con una pipetta di aspirazione collegata a un puntale non filtrato, aspirare accuratamente il surnatante, lasciando circa 100 microlitri di terreno nella provetta. Picchiettare delicatamente sul lato del tubo per rimuovere e associare il pellet, quindi rimetterlo nella griglia di raffreddamento. Utilizzando le pipette preraffreddate da due millilitri, mescolare delicatamente la matrice sul ghiaccio pipettando su e giù alcune volte. Pipettare a una velocità uniforme e moderata in modo che durante questa procedura non vengano introdotte bolle nella matrice.

Trasferire 1,1 millilitri di matrice in ciascuna provetta da centrifuga. Utilizzando puntali preraffreddati, pipettare la matrice in ciascuna provetta su e giù circa 10 volte per ottenere una sospensione cellulare uniforme. Trasferire 310 microlitri della sospensione di matrice cellulare in ciascun pozzetto di una piastra preraffreddata a 24 pozzetti. Posizionare la pipetta a un angolo di 90 gradi rispetto alla superficie della piastra e aggiungere la sospensione al centro del pozzetto. La sospensione si diffonde e copre l'intero pozzo. Per facilitare l'analisi dell'immunofluorescenza a valle, trasferire 60 microlitri di sospensione di matrice cellulare al centro del pozzetto di un vetrino a camera a 2 pozzetti. Ciò consente alla matrice di formare una struttura a cupola con un volume molto più piccolo.

Riposizionare la piastra e la camera nell'incubatore per colture tissutali e incubare per 30 minuti per consentire alla matrice di solidificarsi. Successivamente, esaminare la piastra e il vetrino al microscopio ottico per assicurarsi che le singole cellule siano distribuite uniformemente all'interno della matrice. Aggiungere 1 millilitro di terreno di coltura 3D preriscaldato in ciascun pozzetto della piastra e 1,5 millilitri di terreno di coltura 3D in ciascun pozzetto del vetrino della camera. Quindi rimettili nell'incubatrice.