Preparazione di campioni tumorali inclusi in paraffina fissati in formalina: un protocollo per conservare campioni di tessuto e citologia dal carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC)

- Per iniziare, ottenere campioni di tumore polmonare come campioni di tessuto o come campioni citologici da lavaggi bronchiali, un lavaggio salino contenente cellule dall'interno delle vie aeree. Per preparare i campioni di tessuto, trasferire il tessuto polmonare appena sezionato in una cassetta di inclusione. Fissare e conservare il tessuto con l'opportuna concentrazione di formalina.

Per preparare i campioni citologici, trattare innanzitutto i lavaggi bronchiali con DL-ditiotreitolo per l'omogeneizzazione. Centrifugare e rimuovere il surnatante. Successivamente, trattare con una soluzione mucolitica per liquefare il muco e separare le cellule. Centrifuga per pellettizzare le celle e fissarle con formalina. Trattare le cellule con un reagente adatto per la preparazione del blocco cellulare per concentrare il campione mentre si lavora con piccoli volumi di pellet.

Trasferire il pellet in una cassetta da incasso. Processare entrambi i tipi di campioni disidratandoli attraverso una serie di bagni alcolici graduati. Rimuovere l'alcol utilizzando un detergente appropriato seguito da infiltrazione di cera. Incorporare la cassetta nella cera di paraffina liquida e lasciarla solidificare. Questo forma uno strato attorno al tessuto, che tiene il campione in posizione.

Utilizzare un microtomo per ottenere sezioni tagliate sottilmente. Posizionare le sezioni su vetrini caricati positivamente per facilitare l'adesione. Asciugare e colorare per osservare i vetrini al microscopio. Nel seguente protocollo, dimostriamo le tecniche di preparazione dei campioni da campioni di tessuto tumorale polmonare e campioni citologici.

Per iniziare, fissare il tessuto tumorale in formalina tamponata neutra al 10% in una cassetta e incorporare la cassetta in paraffina come indicato nel protocollo di testo. Incorporare il tessuto infiltrato all'interno di uno stampo riempito con paraffina fusa. Lasciare che i fazzoletti rimangano nello stampo fino a quando la paraffina non si sarà solidificata. Successivamente, utilizzare un microtomo per sezionare il tessuto incluso nella paraffina a uno spessore di tre micrometri.

Trasferire il nastro di paraffina su un vetrino da microscopio in vetro caricato positivamente. Quindi asciugare lo scivolo per un'ora a 37 gradi Celsius. Per prima cosa, raccogli i lavaggi bronchiali in una soluzione conservante. Trasferire i panni in un tubo conico da 50 millilitri. Aggiungere due grammi di DL-ditiotreitolo e agitare il tubo per 30 minuti. Quindi centrifugare a 250 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente.

Rimuovere il surnatante e aggiungere 10 millilitri di una soluzione mucolitica. Agitare il campione a velocità media per 20 minuti e centrifugare a 250 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente. Successivamente, rimuovere il surnatante e depositare il pellet cellulare in una provetta di raccolta contenente il 10% di formalina tamponata neutra.

Aggiungere quattro gocce di un agente per la preparazione dei blocchi cellulari. Trasferire il pellet della cella in una cassetta. Fissare il pellet cellulare per l'inclusione e il sezionamento della paraffina utilizzando il processo precedentemente descritto per la preparazione di campioni di tessuto tumorale.