Selezione delle cellule di leucemia basata su colonna G-10: un metodo per purificare le cellule di leucemia linfoblastica acuta dalle cellule stromali del midollo osseo

- Per iniziare, aggiungere la tripsina a una piastra contenente cellule leucemiche co-coltivate con cellule stromali del midollo osseo per la dissociazione cellulare. Centrifugare e risospendere il pellet utilizzando un terreno preriscaldato per mantenere la vitalità cellulare. La colonna G-10 contiene perle di destrano reticolate che si gonfiano in acqua per formare una matrice di gel.

Equilibrare la colonna G-10 con mezzi preriscaldati per riempire lo spazio tra le perline, garantendo una lenta elusione dei supporti dalla colonna. Mantenere una temperatura adeguata nella colonna per evitare la formazione di bolle d'aria. Caricare lentamente la miscela di celle sulle perle di gel nella colonna G-10. Incubare le cellule sulla colonna G-10 a temperatura ambiente per la durata desiderata. In base alle caratteristiche e alle dimensioni della superficie cellulare, le perle di gel limitano preferenzialmente le cellule stromali del midollo osseo più grandi, consentendo la separazione delle cellule leucemiche.

Aggiungere il terreno preriscaldato alla colonna e raccogliere la sospensione delle cellule leucemiche. Centrifugare la sospensione cellulare e risospendere il pellet in un tampone appropriato. Utilizzare la popolazione pura di cellule leucemiche per ulteriori analisi. Nell'esempio seguente, separeremo una popolazione pura di cellule leucemiche dalla co-coltura stromale utilizzando la colonna G-10.

- Con il rubinetto completamente chiuso per ogni sottopopolazione, utilizzare una pipetta da 1000 microlitri per aggiungere l'intero volume di 1 millilitro di cellule, goccia a goccia, sulla parte superiore di una delle colonne G-10 preparate, assicurandosi che le cellule rimangano sopra o all'interno del pellet G-10. Lasciare incubare le cellule sul pellet G-10 per 20 minuti a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere da 1 a 3 millilitri di terreno fresco e preriscaldato alla colonna e aprire il rubinetto in modo che il fluido esca lentamente dalle colonne in senso di caduta.

Continuare ad aggiungere il terreno preriscaldato alle colonne con incrementi di 1 o 2 millilitri. Quando sono stati raccolti da 15 a 20 millilitri di cellule leucemiche, chiudere il rubinetto e tappare la provetta di raccolta. Quindi, far girare le celle e risospendere il pellet nell'apposito tampone di analisi a valle.