Risposta chemiotattica di microrganismi marini a livelli di nutrienti Micro-Scale

La realizzazione di canali di microfluidica e la loro attuazione in esperimenti per studiare il comportamento chemiotattica foraggiamento dei microbi marini all'interno di un paesaggio marino irregolare dei nutrienti e il comportamento di nuoto di batteri all'interno del flusso di taglio sono descritti.

Ciao, mi chiamo Marcos. Sto lavorando con il professor Roman Stalker al MIT Civil Environmental Engineering e vi mostrerò come creare un micro canale utilizzando la tecnica dell'autofotografia. E per iniziare, dobbiamo progettare una maschera.

Quindi questa è la maschera, che è fondamentalmente il design finale del microcanale che intendiamo realizzare. Questo è un design di un iniettore, quindi possiamo fare un sottile strato di nutriente dove mettiamo microrganismi che nuotano intorno ad esso e vediamo come la chemio tassa, e questo è un canale di una cavità laterale per generare un micro vortice all'interno della cavità, che sono, ci sarà un video che lo mostrerà più tardi dopo aver ottenuto una maschera, Portiamo i wafer nella camera bianca e li mettiamo nella capsula di Petri. E ora andremo nella camera bianca.

Ok, dopo aver stampato e preparato la nostra maschera, ora siamo in camera bianca per fare le micro fabbricazioni vere e proprie. E quello che sto per fare ora, sto prendendo un pezzo del wafer pulito che ho appena comprato e voglio solo assicurarmi che sia extra pulito usando i seguenti solventi per alberi. Il primo passo è quello di pulire con un acetone e poi immediatamente con metanolo.

E poi il passaggio finale è l'isopropanolo. E stiamo lavorando sul lato lucido del wafer, che viene preparato per il rivestimento. E ora lo asciugherò con l'azoto.

Dopo aver asciugato la cialda, ora mettiamo la cialda in un forno a circa 130 gradi Celsius e la cuociamo per cinque o 10 minuti. Nel frattempo, mentre aspettiamo la cottura della cialda, possiamo preparare le due piastre calde, 1 da 7 a 65 gradi e l'altra da 1 a 95 gradi centigradi. Quindi, dopo aver cotto per cinque minuti, togliamo un'ostia dal forno e la lasciamo riposare a temperatura ambiente per circa cinque minuti.

E poi siamo pronti per la centrifuga. Prima di versare il fotoresist, dobbiamo solo assicurarci che non ci siano particelle di polvere sopra di esso, usiamo l'azoto per spruzzarlo sopra il wafer. Il movimento di schizzo è dal centro verso l'esterno.

Ora verserò il fotoresist sopra questo wafer. Versiamo la quantità di circa tre millilitri. Cerca di mettere la bottiglia il più in basso possibile in modo che non generi bolle mentre versi il fotoresist sopra il wafer.

Quindi ora lascia riposare il photo resist sul wafer per circa un minuto prima di iniziare a girarlo. E come ho detto, ho intenzione di fare uno spessore di cento micron di rivestimento. Quindi impostiamo il tempo di centrifuga totale a 55 secondi e possiamo iniziare a girare.

Prima di tutto, proviamo ad aumentare la velocità di rotazione da zero a 500 giri/min in cinque secondi e lasciarlo girare per circa 10 secondi in modo che tu possa vedere che il fotoresist sta rivestendo l'intero wafer e poi aumentarlo fino a 3000 giri/min per circa sette secondi e lasciarlo girare per 30 secondi. Quindi, dopo aver rivestito il wafer con il fotoresist, ora posiziono il wafer sopra la piastra calda e lo cuocio dolcemente a 65 gradi Celsius per cinque minuti e 95 gradi Celsius per 20 minuti. Dopo che la cottura morbida a 95 gradi è completata, la raffreddiamo a temperatura ambiente, ma prima la raffreddiamo di nuovo a 65 gradi Celsius per circa due o tre minuti in modo che non abbia una rapida diminuzione della temperatura.

E poi lo mettiamo a temperatura ambiente a raffreddare per circa cinque minuti. E ora lo esporrò con la luce UV in modo che la parte esposta sia indurita e la parte non esposta venga lavata via in seguito. Quindi questa è la parte in cui usiamo la maschera e, come puoi vedere, la maschera ha due parti, la parte in cui è trasparente e l'altra parte che è completamente opaca o nera in questo, in questa impostazione.

Quindi metterò questa maschera sopra il wafer rivestito. Quindi la maschera che ricevi dalla tipografia ha due lati. Uno è quello con cui stampano con l'inchiostro.

E questo è un sito che vuoi mettere in contatto con il wafer. Ora esporrò il wafer attraverso la maschera con la luce UV. E per motivi di sicurezza, indosserò questi occhiali di sicurezza.

La quantità di tempo di esposizione dipende dall'analizzatore standard standard in uso e dallo spessore che si sta cercando di ottenere. Ora, dopo l'esposizione, metto il wafer sulla piastra calda a 65 gradi e lo cuocio di nuovo per cinque minuti e poi a 95 gradi Celsius per 20 minuti. E ricorda solo che questo tempo di cottura varia dallo spessore desiderato e anche diverso dal modo in cui stai utilizzando.

A seguito di questo punto, svilupperemo il wafer. Sviluppare significa rimuovere la parte del fotoresist che è indesiderata in modo che solo la regione esposta rimanga sul wafer. Per sviluppare il wafer e lavare via la parte indesiderata del fotoresist, stiamo utilizzando lo sviluppatore.

In questo caso, sto usando l'acetato di pomonal come sviluppatore e verserò questo solvente in questo becher e metterò il wafer e lo immergerò nel becher per circa 10 minuti. Anche in questo caso, il tempo varia a seconda dello spessore e del solvente che si sta utilizzando. Ora, 10 minuti dopo puoi vedere che ciò che è rimasto su questo wafer è il design del canale che si desidera e tutta la parte indesiderata è stata lavata via solo per dargli un risciacquo.

Usiamo lo stesso solvente, uno nuovo, lo stesso acetato di polioni, e basta spruzzare sopra il wafer solo per risciacquarlo via. E infine, per lavare via il solvente, usiamo l'iso propanolo e lo sciacquiamo semplicemente. E ora lo asciughiamo con azoto.

E ora hai un wafer pulito con il motivo desiderato su di esso. E noi lo chiamiamo il maestro. Ora torniamo al nostro laboratorio per versare PDMS su di esso e continuare il resto della procedura.

Quindi ora siamo tornati dalla camera bianca e abbiamo, otteniamo il master, che è fondamentalmente lo stampo per quello che faremo questo stampo. Quello che faremo dopo è versare il PDMS, che è un polimero e sta per polimerizzare. Quindi, come potete vedere, se versiamo un polimero sopra questo stampo, il polimero avrà una scanalatura su di esso e alla fine, se ci leghiamo a una luce di vetro, quel polimero stesso sarà il canale.

Quindi ora prepareremo il PDMS. Quindi questo è il PDMS, che è il polimero, il poli dile Sloane PDMS. E questo è un agente indurente.

Quello che farò è versare questo agente indurente in questa tazza e versare questo PDMS in questa tazza e mescolarlo con un rapporto di uno a 10. Quindi generalmente vogliamo usare un for per mescolarlo in modo omogeneo. Mentre mescoliamo, generiamo un sacco di bolle, e la bolla è un po' come un'indicazione per dirci se l'abbiamo mescolata o meno.

Ora, dopo aver mescolato il PDMS con l'agente indurente, siamo pronti per versare questa miscela sopra il master, che è un wafer. E solo per assicurarci che il wafer non vada da nessuna parte durante il versamento, abbiamo fissato il wafer con un nastro adesivo. Prima di versare la miscela PDMS sopra il wafer, vogliamo cercare di rendere il wafer il più pulito possibile dalla polvere che potrebbe essere caduta su di esso.

Quindi accendiamo il compressore per spolverare il wafer. Ok, puoi vedere che il PDMS ha un sacco di bolle. Quindi rimuoveremo la bolla mettendola all'interno di una camera a vuoto.

Quindi l'aspirazione richiede circa 30 minuti per rimuovere tutte le bolle. E una volta che abbiamo finito di togliere le bolle, lo tiriamo fuori e lo mettiamo in forno a 65 gradi Celsius e lo cuociamo per almeno 12 ore. E una volta che saremo 12 ore dopo, avremo il wafer pronto per il taglio.

Userò questo coltello per tagliare il PDMS e togliere il PDMS dal wafer e poi usare questo intero perforatore per praticare il foro per gli ingressi e le uscite del tubo. Quindi, quando tagli, vuoi tagliare, metti il coltello finché non colpisce il wafer, ma non applicare troppa pressione in modo da non rompere il wafer e tagliare attorno al tuo canale. Ora staccalo.

Così ora potete vedere che questo è il canale, che è il modello del wafer. Quindi puoi vedere che sono gli stessi. E ora questo modello è stato grave su questo polimero, questo PDMS.

E una volta che lo legheranno su una luce di vetro, questo sarà il canale per il nostro esperimento. Il passo successivo, che è importante, è ricordarsi di praticare i fori in modo da poter inserire gli ingressi e le uscite nei micro canali dopo aver praticato i fori nei micro canali nel PDMS. Quindi abbiamo usato lo scotch per fissare il nastro sul lato del canale, quindi dove si trova il solco e fissarlo con del nastro adesivo.

E il motivo per cui stiamo registrando questo canale con lo scotch è per rimuovere tutte le particelle di polvere. Quindi il passo successivo è il legame al plasma. E prima dell'incollaggio al plasma, che faremo nell'altro laboratorio, rimuoveremo il nastro ed esporremo la superficie che vogliamo incollare, che è questa superficie e il vetro scivolano insieme e poi lo esporremo sul plasma di ossigeno e poi, li metteremo insieme e si legheranno.

Ciao, mi chiamo Justin Seymour e sono un ricercatore post-dottorato nel laboratorio romano di stockers al MIT. E la mia ricerca si concentra sull'ecologia microbica, più specificamente su come i microbi marini sono in grado di trovare macchie di cibo nell'oceano. E stiamo usando tecniche di microfluidica per osservare questo tipo di modelli.

Quindi useremo il canale che Marcus ha dimostrato come produrre prima e dopo il legame al plasma. Siamo quindi liberi di usarlo in un esperimento microfluidico. Prima di questo esperimento, dobbiamo preparare i substrati che utilizzeremo nell'esperimento.

E nell'esperimento di oggi vedremo come il fitoplancton marino donella tur electro è in grado di trovare macchie di cibo su microscala. In questo caso si tratta di ammonio e gli forniremo una concentrazione di un centinaio di micromolari di ammonio. Quindi, in questi esperimenti, siamo in grado di visualizzare le chiazze di cibo aggiungendo una macchia fluorescente ai contro dei nutrienti che forniamo loro.

Quindi usiamo il colorante fluoresceina. Quindi qui sto pipettando la fluoresceina a una concentrazione finale di 100 micromolari nell'ammonio, che usiamo come nutriente. E possiamo quindi visualizzare quel nutriente al microscopio a fluorescenza e che ci permette di osservare come si diffonde una chiazza di nutrienti, e quindi osservare la risposta degli organismi a quella macchia di nutrienti.

Quindi, negli esperimenti di microfluidica, usiamo siringhe di vetro. Quindi la prima cosa che vogliamo fare è aggiungere i nostri substrati e organismi alle siringhe che utilizzeremo. Il passaggio successivo consiste nell'inserire il tubo nella configurazione microfluidica.

E lo facciamo di nuovo nella fase del microscopio. Quindi posizioniamo il nostro canale microfluidico sul tavolino del microscopio e poi inseriamo i tubi negli ingressi e nelle uscite. Inseriamo quindi un serbatoio di scarico e ci assicuriamo che il serbatoio sia riempito a metà di fluido in modo che il tubo nel serbatoio di scarico sia completamente sommerso.

Questo ci permette di avere una pressione costante all'interno del canale. Inseriamo quindi le siringhe nel tubo che alimenta il canale microfluidico contenente gli organismi, che in questo caso è la donella, il lettore, e il substrato nutritivo, che in questo caso è l'ammonio. Quindi impostiamo il microscopio e osserviamo il canale microfluidico nella posizione appropriata prima di iniziare gli esperimenti.

Una volta che il canale è in posizione, passiamo a visualizzare il canale con la telecamera e possiamo visualizzarlo sul computer. Ora possiamo eseguire regolazioni più fini con la messa a fuoco e ora possiamo visualizzare l'iniettore da cui iniettiamo i nutrienti. E questo consiste in una punta dell'ago cablata da 100 micrometri nel canale microfluidico incorporato.

E possiamo produrre un gradiente di nutrienti iniettandoli. Da questo punto, prima di iniziare gli esperimenti, dobbiamo rimuovere tutte le bolle che potrebbero essere entrate nel sistema microfluidico. E lo facciamo utilizzando una siringa riempita con acqua di mare artificiale in questo caso, che possiamo collegare al canale microfluidico tramite una valvola.

E poi spingiamo questa siringa per rimuovere le bolle dal canale. Possiamo rimuovere le bolle in due modi, forzandole fuori attraverso la pressione prodotta dalla siringa fuori dall'uscita, oppure possiamo anche rimuovere le bolle forzandole attraverso le pareti del materiale PDMS, che è permeabile ai gas. Una volta rimosse le bolle e pronti per iniziare l'esperimento, impostiamo le portate appropriate per l'iniezione e i materiali nel canale utilizzando una pompa a siringa.

In questo caso, utilizziamo una portata di due microlitri al minuto, che equivale a una portata nel canale di 266 micrometri al secondo. Una volta impostata la portata appropriata, possiamo iniziare l'esperimento iniziando, iniziando il flusso, che crea una sottile banda di nutrienti. In questo modo possiamo visualizzare i nutrienti mentre vengono iniettati nel canale dal punto di iniezione aggiungendo colorante di fluoresceina ai nutrienti e visualizzandoli al microscopio a fluorescenza APF, possiamo quindi osservare la dinamica del cerotto interrompendo il flusso nel canale microfluidico e visualizzando la banda di nutrienti diffusa lateralmente dalla loro posizione originale.

Passiamo quindi alla microscopia a contrasto di fase per visualizzare gli organismi che nuotano all'interno del canale e osservare le loro posizioni in relazione al cerotto di nutrienti. Siamo in grado di farlo prendendo una sequenza di fotogrammi a una frequenza di fotogrammi di 10 al secondo, che produce un filmato in cui possiamo visualizzare questi organismi. Possiamo quindi visualizzare gli organismi che nuotano prendendo le differenze di tempo tra due singoli fotogrammi in cui un fotogramma viene sottratto dal precedente, in modo da visualizzare solo gli oggetti in movimento.

Quindi possiamo rimuovere il rumore di fondo dalle immagini. Registriamo quindi filmati a intervalli regolari per 10-20 minuti dopo il rilascio iniziale del cerotto nutriente. E utilizzando il software di analisi delle immagini per sovrapporre le posizioni degli organismi da un fotogramma all'altro della sequenza, possiamo osservare i cambiamenti di posizione di questi organismi per ottenere informazioni sulle loro traiettorie di nuoto da cui possiamo poi ottenere informazioni più dettagliate sulle loro statistiche di nuoto, comprese le velocità e i cambi di direzione.

Quindi questi esperimenti ci hanno permesso, per la prima volta, di esaminare direttamente come i microbi marini sono in grado di trovare e sfruttare le macchie di nutrienti su microscala. Ciò potrebbe avere importanti implicazioni per le dinamiche trofiche e il ciclo dei nutrienti nell'oceano. Quindi, seguendo ciò che Justin ha menzionato, il modo in cui i microrganismi, in particolare i batteri, interagiscono con il loro cibo nell'oceano può avere molti effetti sui cicli biochimici.

Quindi, però, l'oceano è molto in difficoltà, non sono affrontati e ci sono molte condizioni di flusso come la turbolenza, che è generata dal vento o dalla superficie. E nella scala dei microrganismi, ciò che stanno sperimentando non è realmente la grande turbolenza, ma è la pura e più piccola parte dei resti di turbolenza è nota come il grafico di coog Eddie. E quello che stiamo cercando di fare qui è come, cosa vogliamo studiare, quali sono gli effetti di questo Eddie sul comportamento presunto dei microrganismi.

E per fare ciò, stiamo creando un altro canale utilizzando questa massa che vi ho mostrato prima. E c'è un, c'è una cavità al centro. E lasciatemi disegnarlo per ingrandire il diagramma.

Quindi questo è l'aspetto del canale, abbiamo un, questa è la vista che vediamo dall'alto, e iniettiamo il flusso da sinistra a destra e, a causa del taglio, genera una regione di ricircolo all'interno di questa cavità. E questa cavità è una rappresentazione di, di un grafo Addis. Possiamo semplicemente usare la stessa configurazione che Justin ha già spiegato in precedenza quando la pompa a siringa è spenta, e non ho attivato alcun flusso, puoi vedere che i batteri nuotano praticamente in modo casuale e felice all'interno di questa cavità cav.

E non c'è un orientamento preferito. E il film che state vedendo è un film sulla differenza di fuso orario, che è esattamente la stessa tecnica che sta usando Justin. Quindi, quando il flusso è molto veloce, come potete vedere, i batteri vengono trasportati via dal vortice.

E la traiettoria dei batteri stessi segue la linea di flusso del vortice. E ciò che è in realtà più interessante è quanto segue quando accendiamo la pompa a siringa. Ma la velocità non è così elevata.

Non è troppo veloce che i batteri, i batteri non sono in grado di combatterlo. Ma in un certo senso, si può ancora vedere una somiglianza con un vortice in questo film. Da questo esperimento, abbiamo imparato che in presenza di un batterio molto forte, turbolento, in balia del flusso, non sono in grado di combattere il flusso.

Tuttavia, in una regione di lieve turbolenza, sono ancora in grado di nuotare di propria iniziativa.