Risposta chemiotattica di microrganismi marini a livelli di nutrienti Micro-Scale

Ciao, mi chiamo Marcos. Sto lavorando con il professor Roman Stalker presso il Dipartimento di Ingegneria Civile e Ambientale del MIT e vi mostrerò come realizzare un microcanale utilizzando la tecnica della self-photography. Per cominciare, dobbiamo progettare una maschera.

Questa è quindi la maschera, che rappresenta sostanzialmente il disegno finale del microcanale che intendiamo realizzare. Si tratta del progetto di un iniettore, grazie al quale possiamo creare uno strato sottile di nutriente in cui inserire microrganismi che nuotano attorno, osservando così il loro chemotassi; inoltre, è presente un canale laterale con una cavità per generare un microvortice all'interno della cavità stessa. Successivamente, dopo aver ottenuto la maschera, verrà mostrato un video dimostrativo. Prendiamo quindi le wafer e andiamo in camera bianca, dove le collochiamo all'interno della piastra di Petri. E ora ci dirigiamo in camera bianca.

Ok, ora che abbiamo la nostra maschera stampata e pronta, siamo ora nella stanza pulita per eseguire le effettive microfabbricazioni. Quello che farò ora è prendere un pezzo di wafer pulito appena acquistato e voglio assicurarmi che sia particolarmente pulito utilizzando i seguenti tre solventi. Il primo passo consiste nella pulizia con acetone, seguita immediatamente da metanolo.

E quindi l'ultimo passaggio è l'isopropanolo. E stiamo lavorando sul lato lucido della wafer, che è stato preparato per il rivestimento. Ora procederò all'essiccazione con azoto.

Dopo aver asciugato la piastrina, ora la inseriamo in un forno a circa 130 gradi Celsius e la riscaldiamo per cinque o dieci minuti. Nel frattempo, mentre attendiamo la cottura della piastrina, possiamo preparare le due piastre riscaldanti, una a 175 gradi Celsius e l'altra a 195 gradi Celsius. Dopo cinque minuti di cottura, togliamo la piastrina dal forno e la lasciamo raffreddare a temperatura ambiente per circa cinque minuti.

E poi siamo pronti per la deposizione con centrifuga. Prima di versare il photoresist, dobbiamo assicurarci che non ci siano particelle di polvere sulla sua superficie; utilizziamo azoto per spruzzarlo sulla superficie della wafer. Il movimento di spruzzatura va dal centro verso l'esterno.

Ora verserò il photoresist sulla superficie di questo wafer. Verseremo una quantità di circa tre millilitri. Cercate di tenere la bottiglia il più vicino possibile in modo da non generare bolle durante il versamento del photoresist sul wafer.

Lasciamo ora il photoresist depositato sulla wafer per circa un minuto prima di iniziare la centrifugazione. E come menzionato, otterrò uno strato di rivestimento di spessore pari a cento micron. Impostiamo quindi un tempo totale di centrifugazione di 55 secondi e possiamo iniziare la rotazione.

Prima di tutto, proviamo ad aumentare la velocità di rotazione da zero a 500 giri al minuto in cinque secondi e lasciamo ruotare per circa 10 secondi, in modo da poter osservare che il photoresist sta ricoprendo l'intero wafer; successivamente aumentiamo la velocità fino a 3000 giri al minuto per circa sette secondi e lasciamo ruotare per 30 secondi. Dopo aver ricoperto il wafer con il photoresist, ora pongo il wafer sopra la piastra riscaldante e lo sottopongo a una cottura leggera a 65 gradi Celsius per cinque minuti e a 95 gradi Celsius per 20 minuti. Al termine della cottura leggera a 95 gradi, lo raffreddiamo fino alla temperatura ambiente; tuttavia, prima di ciò, lo riportiamo a 65 gradi Celsius per circa due o tre minuti, in modo da evitare una diminuzione rapida della temperatura.

E poi lo lasciamo a temperatura ambiente per raffreddarlo per circa cinque minuti. Ora lo esporrò alla luce UV in modo che la parte esposta si indurisca, mentre la parte non esposta verrà rimossa successivamente mediante lavaggio. Questa è la fase in cui utilizziamo la maschera e, come potete vedere, la maschera è composta da due parti: una parte trasparente e un'altra parte completamente opaca o nera in questa configurazione.

Quindi posizionerò questa maschera sopra la wafer rivestita. La maschera che si ottiene dalla società di stampa ha due lati. Uno è quello su cui viene stampato l'inchiostro.

E questo è un sito che si desidera mettere a contatto con la wafer. Ora esporrò la wafer attraverso la maschera con luce UV. E per motivi di sicurezza, indosserò questi occhiali di protezione.

La durata del tempo di esposizione dipende dall'SUA che si sta utilizzando e anche dallo spessore che si desidera ottenere. Dopo l'esposizione, pongo la wafer sulla piastra a 65 gradi e la cotto nuovamente per cinque minuti, quindi a 95 gradi Celsius per 20 minuti. Ricordo che il tempo di cottura varia in base allo spessore desiderato e anche in base al tipo di procedura che si sta utilizzando.

Dopo questo passaggio, procederemo allo sviluppo del wafer. Lo sviluppo consiste nella rimozione della parte indesiderata del photoresist, in modo che rimanga soltanto la zona esposta sul wafer. Per sviluppare il wafer e lavare via la parte indesiderata del photoresist, utilizziamo lo sviluppatore.

In questo caso, sto utilizzando l'acetato di pomonal come sviluppatore e verserò questo solvente in questo becher, quindi inserirò la wafer immergendola nel becher per circa 10 minuti. Ancora una volta, il tempo varia a seconda dello spessore e del solvente utilizzato. Dopo 10 minuti, si può osservare che ciò che rimane sulla wafer è il disegno del canale desiderato, mentre tutta la parte indesiderata è stata rimossa; si procede semplicemente con un risciacquo.

Utilizziamo lo stesso solvente, uno fresco, lo stesso acetato di polivinile e lo spruzziamo semplicemente sopra la wafer per risciacquarla. Infine, per rimuovere il solvente, usiamo l'isopropanolo e risciacquiamo brevemente. Ora asciughiamo con flusso di azoto.

Ora si dispone di un wafer pulito con il modello desiderato. Chiamiamo questo elemento il "master". Ora torniamo in laboratorio per versarvi sopra il PDMS e proseguire con il resto della procedura.

Ora siamo tornati dalla camera pulita e abbiamo ottenuto il master, che è fondamentalmente lo stampo per ciò che andremo a realizzare. Quello che faremo ora è versare il PDMS, un polimero che successivamente polimerizzerà. Come potete vedere, versando un polimero su questo stampo, il polimero presenterà delle scanalature; infine, una volta legato a un vetrino di vetro, il polimero stesso formerà il canale.

Ora prepareremo il PDMS. Questo è il PDMS, ovvero il polimero, il poli dimetil silossano PDMS. E questo è l'agente indurente.

Quello che farò è versare l'agente indurente in questo bicchiere e versare il PDMS in questo bicchiere e mescolarli in un rapporto di uno a dieci. Di solito si utilizza un bastoncino per mescolare in modo omogeneo. Durante il mescolamento, si formano molte bolle, e la presenza di bolle funge da indicazione per capire se il mescolamento è stato effettuato o meno.

Ora, dopo aver mescolato il PDMS con l'agente indurente, siamo pronti a versare questa miscela sopra il master, che è una wafer. Per assicurarci che la wafer non si sposti durante il versamento, l'abbiamo fissata con del nastro adesivo. Prima di versare la miscela di PDMS sulla wafer, dobbiamo cercare di eliminare dalla sua superficie tutta la polvere che potrebbe esservi caduta.

Quindi accendiamo il compressore per rimuovere la polvere dalla wafer. Ok, si può notare che il PDMS presenta molte bolle. Le rimuoveremo posizionando il campione all'interno di una camera a vuoto.

Pertanto, la messa sotto vuoto richiede circa 30 minuti per rimuovere tutte le bolle. Una volta terminata la rimozione delle bolle, si estrae il campione e lo si inserisce in forno a 65 gradi Celsius, lasciandolo cuocere per almeno 12 ore. Dopo 12 ore, la wafer sarà pronta per essere tagliata.

Utilizzerò questo coltello per tagliare il PDMS ed estrarre il PDMS dalla piastrina, quindi userò questo punzone per creare i fori per gli ingressi e le uscite dei tubicini. Quando tagliate, posizionate il coltello fino a quando non tocca la piastrina, ma non applicate troppa pressione per non rompere la piastrina; tagliate intorno al vostro canale. Ora staccatelo.

Avete, quindi ora potete vedere che questo è il canale, ovvero il modello proveniente dalla wafer. Potete dunque osservare che sono identici. E ora questo modello è stato inciso su questo polimero, il PDMS.

E una volta che si legano a un vetrino, questo formerà il canale per il nostro esperimento. Il passaggio successivo, che è importante, consiste nel ricordarsi di praticare dei fori in modo da poter inserire ingressi e uscite nei microcanali, dopo aver praticato i fori nei microcanali nel PDMS. Quindi abbiamo usato del nastro adesivo trasparente per fissarlo sul lato del canale, cioè dove si trova la scanalatura, e lo abbiamo incollato.

E il motivo per cui stiamo sigillando questo canale con il nastro adesivo è rimuovere tutte le particelle di polvere. Il passaggio successivo è quindi il legame al plasma. E prima del legame al plasma, che effettueremo nell'altro laboratorio, rimuoveremo il nastro per esporre la superficie che desideriamo legare, ovvero questa superficie insieme alla lamella di vetro, per poi esporla al plasma di ossigeno e, successivamente, unirle in modo che si saldino.

Ciao, mi chiamo Justin Seymour e sono un ricercatore postdottorato nel laboratorio di Roman Stocker al MIT. La mia ricerca si concentra sull'ecologia microbica, più specificamente sull'analisi di come i microrganismi marini riescano a trovare zone ricche di cibo nell'oceano. Utilizziamo tecniche di microfluidica per studiare questi tipi di schemi.

Quindi utilizzeremo il canale che Marcus ha dimostrato come produrre in precedenza e dopo il legame al plasma. A questo punto, saremo liberi di utilizzarlo in un esperimento di microfluidica. Prima di questo esperimento, dobbiamo preparare i substrati che verranno usati nell'esperimento.

E nel corso dell'esperimento odierno analizzeremo in che modo il fitoplancton marino donella tur electro riesce a individuare zone microscopiche ricche di cibo. In questo caso si tratta di ammonio, e gli forniremo una concentrazione di cento micromoli di ammonio. In questi esperimenti, siamo in grado di visualizzare le zone ricche di cibo aggiungendo un colorante fluorescente ai nutrienti che forniamo agli organismi.

Quindi utilizziamo il colorante fluoresceina. Qui sto pipettando la fluoresceina a una concentrazione finale di 100 micromolare nell'ammonio, che usiamo come nutriente. Possiamo quindi visualizzare questo nutriente mediante microscopia a fluorescenza, il che ci permette di osservare come una macchia di nutriente si diffonde e analizzare la risposta degli organismi a tale macchia di nutrienti.

Negli esperimenti di microfluidica utilizziamo siringhe di vetro. La prima cosa da fare è quindi aggiungere i nostri substrati e organismi nelle siringhe che andremo a utilizzare. Il passo successivo consiste nell'inserire i tubi nell'apparato microfluidico.

Eseguiamo questa procedura sulla piastra del microscopio. Posizioniamo quindi il nostro canale microfluidico sulla piastra del microscopio e inseriamo i tubicini negli ingressi e nelle uscite. Inseriamo poi un serbatoio di raccolta dei rifiuti e ci assicuriamo che il serbatoio sia riempito per metà con fluido, in modo che il tubicino nel serbatoio di raccolta sia completamente immerso.

Questo ci permette di mantenere una pressione costante all'interno del canale. Successivamente, collegamo delle siringhe al tubo che alimenta il canale microfluidico contenente gli organismi, in questo caso donella, lector, e il substrato nutritivo, in questo caso ammonio. Poi prepariamo il microscopio e osserviamo il canale microfluidico nella posizione appropriata prima di iniziare gli esperimenti.

Una volta che il canale è in posizione, passiamo alla visualizzazione del canale attraverso la telecamera e possiamo visualizzarlo sul computer. Ora possiamo effettuare regolazioni più fini del fuoco e visualizzare l'iniettore da cui vengono iniettiti i nutrienti. Questo è costituito da una punta di ago filiforme da 100 micrometri integrata nel canale di microfluidica.

E possiamo produrre un gradiente di nutrienti iniettandoli. Da questo momento, prima di iniziare gli esperimenti, dobbiamo rimuovere eventuali bolle d'aria che potrebbero essersi introdotte nel sistema di microfluidica. Per fare ciò, utilizziamo una siringa riempita con acqua marina artificiale, nel caso specifico, che possiamo collegare al canale di microfluidica tramite una valvola.

E quindi spingiamo questa siringa per rimuovere le bolle dal canale. Possiamo eliminare le bolle in due modi: forzandole verso l'esterno attraverso la pressione generata dalla siringa all'uscita, oppure possiamo rimuoverle forzandole attraverso le pareti del materiale PDMS, che è permeabile ai gas. Una volta rimosse le bolle e quando siamo pronti a iniziare l'esperimento, impostiamo le portate appropriate per l'iniezione e l'introduzione dei materiali nel canale utilizzando una pompa per siringhe.

In questo caso, utilizziamo una portata di due microlitri al minuto, equivalente a una velocità di flusso nel canale di 266 micrometri al secondo. Una volta impostata la portata appropriata, possiamo avviare l'esperimento iniziando il flusso, che crea una sottile banda di nutrienti. Possiamo quindi visualizzare i nutrienti mentre vengono iniettati nel canale dal punto di iniezione aggiungendo un colorante fluorescente ai nutrienti e osservandoli mediante microscopia a fluorescenza APF; successivamente, possiamo analizzare la dinamica delle macchie interrompendo il flusso nel canale microfluidico e osservando la diffusione laterale della banda di nutrienti dalla loro posizione iniziale.

Passiamo quindi alla microscopia a contrasto di fase per visualizzare gli organismi che nuotano all'interno del canale e osservarne la posizione in relazione alla zona ricca di nutrienti. Questo è possibile acquisendo una sequenza di fotogrammi a una velocità di 10 fotogrammi al secondo, generando così un filmato in cui è possibile osservare questi organismi. Successivamente, possiamo visualizzare gli organismi in movimento calcolando la differenza temporale tra due fotogrammi consecutivi, sottraendo un fotogramma dal precedente, in modo che vengano visualizzati soltanto gli oggetti in movimento.

Quindi possiamo rimuovere il rumore di fondo dalle immagini. Successivamente registriamo filmati a intervalli regolari per 10-20 minuti dopo il rilascio iniziale della macchia di nutriente. Utilizzando un software di analisi delle immagini per sovrapporre le posizioni degli organismi da un fotogramma all'altro della sequenza, possiamo osservare i cambiamenti di posizione di questi organismi per ottenere informazioni sulle loro traiettorie di nuoto, dalle quali possiamo poi ricavare dati più dettagliati sulle loro statistiche di nuoto, inclusi velocità e variazioni di direzione.

Questi esperimenti ci hanno permesso, per la prima volta, di esaminare direttamente come i microrganismi marini riescono a individuare e sfruttare le microaree ricche di nutrienti. Ciò potrebbe avere importanti implicazioni per la dinamica trofica e il riciclo dei nutrienti nell'oceano. Seguendo quanto menzionato da Justin, le modalità con cui i microorganismi, in particolare i batteri, interagiscono con il loro cibo nell'oceano possono influenzare notevolmente i cicli biochimici.

Pertanto, anche se l'oceano è molto dinamico, questi aspetti non sono stati affrontati, e vi sono numerose condizioni di flusso come la turbolenza, generata dal vento o dalla superficie. E su scala di microrganismi, ciò che essi percepiscono, ciò che sperimentano, non è realmente la grande turbolenza, ma piuttosto le forze di taglio e i più piccoli residui di turbolenza, noti come vortici di Kolmogorov. Quello che stiamo cercando di fare qui è comprendere come, cosa vogliamo studiare, quali siano gli effetti di questi vortici sul comportamento di accumulo dei microrganismi.

E per fare ciò, stiamo creando un altro canale utilizzando questa massa che vi ho mostrato precedentemente. E c'è una cavità al centro. Lasciatemi semplicemente disegnarla per ingrandire il diagramma.

Quindi questo è l'aspetto del canale: abbiamo questa vista che osserviamo dall'alto, e iniettiamo il flusso da sinistra verso destra; a causa dello sforzo di taglio, si genera una zona di ricircolo all'interno di questa cavità. Questa cavità rappresenta un grafo Addis. Possiamo utilizzare semplicemente lo stesso apparato che Justin ha già spiegato in precedenza. Quando la pompa per siringa è spenta e non ho attivato alcun flusso, si può osservare che i batteri nuotano in modo sostanzialmente casuale e attivo all'interno di questa cavità.

E non c'è un'orientazione preferenziale. E il filmato che state vedendo è un filmato a differenza temporale, che utilizza esattamente la stessa tecnica impiegata da Justin. Quindi quando il flusso è molto veloce, come potete vedere, i batteri vengono deviati via dal vortice.

E la traiettoria dei batteri stessi segue le linee di flusso del vortice. E ciò che è effettivamente più interessante è quanto segue, quando attiviamo la pompa a siringa. Ma la velocità non è così elevata.

Non è troppo veloce da impedire ai batteri di contrastarla. Ma in un certo senso, è ancora possibile osservare una somiglianza con un vortice in questo filmato. Da questo esperimento abbiamo appreso che, in presenza di un flusso molto intenso e turbolento, i batteri sono alla mercé del flusso stesso e non riescono a opporvisi.

Tuttavia, in una regione di turbolenza lieve, sono ancora in grado di nuotare di loro spontanea volontà.