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0 visualizzazioni • 5:00 min • April 30th, 2023
- Le cellule T attivate si spostano nel microambiente tumorale del pancreas, dove rilasciano citochine come l'interferone-gamma, o IFN gamma, e il fattore di necrosi tumorale-alfa, o TNF alfa, che aiuta a mediare un'efficace risposta antitumorale. Poiché le citochine si spostano rapidamente fuori dalla cellula T, i livelli intracellulari possono essere non rilevabili. Pertanto, la cellula T richiede una stimolazione per aumentare la produzione di citochine basali per studiare il loro ruolo terapeutico nel tumore.
Inizia prendendo una sospensione di cellule tumorali dal pancreas del topo. Ora, trattare le cellule T presenti in sospensione cellulare con un cocktail di stimolazione delle citochine e incubare la miscela per il tempo desiderato. Questo cocktail facilita il rilascio di ioni calcio dal reticolo endoplasmatico al citoplasma. Alti livelli di calcio, a loro volta, attivano alcuni fattori di trascrizione nucleare, portando ad un aumento della produzione di citochine nelle cellule T.
Successivamente, trattare le cellule con un cocktail di inibitori del trasporto proteico e incubare la provetta. Questo cocktail blocca il trasporto delle citochine dal reticolo endoplasmatico al complesso del Golgi, con conseguente accumulo di citochine all'interno della cellula. Infine, colorare le cellule utilizzando marcatori intracellulari appropriati per l'analisi della citometria a flusso. Nel seguente protocollo, eseguiremo la stimolazione delle cellule T per aumentare la concentrazione intracellulare di citochine.
- Per iniziare, usa una pinza per trasferire il tumore su una capsula di Petri. Conservare 5 millilitri di terreno di digestione in un tubo da 50 millilitri su ghiaccio per prevenire l'inizio dell'attività enzimatica. Prendi una piccola aliquota di questa soluzione per coprire il tumore sulla capsula di Petri. Usa un bisturi sterile e una pinza per tagliare il tumore in piccoli pezzi, lunghi circa meno di 3 millimetri. Raschiare i pezzi di tumore nel tubo e capovolgere delicatamente il tubo fino a quando tutti i pezzi sono immersi nel mezzo di digestione. Trasferire il tubo su un dispositivo di agitazione per 20 minuti a 37 gradi Celsius per digerire. Assicurarsi che tutti i pezzi di tumore siano sommersi e non attaccati al bordo del tubo.
Immediatamente dopo la fase di digestione, posizionare il tubo sul ghiaccio per rallentare l'attività enzimatica. Aggiungere EDTA per ottenere una concentrazione finale di 20 millimolari e agitare brevemente il campione per mescolarlo al fine di rallentare ulteriormente l'attività enzimatica. Aprire la provetta e sciacquare il digestato del tumore dal coperchio della provetta con un nuovo mezzo RPMI. Quindi, prepara un colino da 70 micron. Mettilo su un tubo aperto da 50 millilitri con ghiaccio. Pre-bagnare il filtro con il fluido. Risospendere le cellule digerite e lavare i lati del tubo con una stripette da 25 millilitri o più grande. L'apertura più ampia della stripette permette al digestato denso di passare facilmente.
Trasferisci tutto il digestato sul colino usando la stripette da 25 millilitri. Schiacciare su e giù il tumore sopra il filtro usando uno stantuffo per siringa da 1 millilitro. Lavare continuamente le celle attraverso il filtro con RPMI. Assicurati di lavare con forza sufficiente per spingere le celle. Continuare il lavaggio fino a quando tutte le celle sono passate attraverso il colino. Centrifugare la provetta per cinque minuti a 300 volte g e 4 gradi Celsius.
Risospendere con cura il pellet di cella e completare l'RPMI, quindi passare direttamente attraverso un altro filtro per rimuovere eventuali matrici extracellulari o grandi grumi di cellule che non possono essere adeguatamente risospesi. Se non è richiesta alcuna stimolazione, colorare immediatamente le cellule isolate per l'analisi di citometria a flusso o risospenderle in un mezzo di congelamento al 10% di DMSO in FBS e conservarle a meno 80 gradi Celsius.
Per eseguire la stimolazione, per prima cosa contare le cellule. Diluire le cellule in terreno completo per ottenere una concentrazione da 2 volte 10 a 6 per 100 microlitri. Piastra 100 microlitri di cellule in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con fondo a U. Aggiungere 100 microlitri di terreno completo contenente una preparazione 2X di PMA e ionomicina. Mettere la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per un'ora. Quindi, aggiungere 20 microlitri di una preparazione 10X di Brefeldin-A e Monensin e completare il terreno per ottenere una concentrazione finale di 1,06 micromolari e 2,0 micromolari, rispettivamente. Rimettere la piastra nell'incubatrice per altre quattro ore.