Isolamento delle isole pancreatiche attraverso la perfusione di collagenasi: un metodo enzimatico per isolare le cellule delle isole pancreatiche

- Le cellule insulari del pancreas producono ormoni essenziali coinvolti nelle funzioni endocrine. Per isolare le isole, per prima cosa, metti in sicurezza un topo soppresso ed esponi chirurgicamente la sua cavità addominale. Spazzola via il fegato e l'intestino per individuare e bloccare il dotto biliare comune. Identificare l'ampolla di Vater, il dotto formato dall'unione dei dotti biliari pancreatici e comuni.

Successivamente, iniettare una soluzione di enzima collagenasi nel dotto biliare comune. Il riflusso dal dotto gonfia con successo il pancreas, facilitando la dissociazione dei tessuti pancreatici indotta dalla collagenasi. Asciugare il pancreas in un tubo contenente altra soluzione di collagenasi. Tritare meccanicamente il tessuto e incubare per favorire la digestione dei tessuti da parte della collagenasi.

Una volta ottenuta una sospensione omogenea, fermare la digestione enzimatica aggiungendo una soluzione contenente proteine che inibiscono l'attività della collagenasi. Centrifuga per raccogliere un pellet di tessuto. Risospendere il pellet in un mezzo di gradiente di densità appropriato, sovrapporvi sopra un tampone adatto e centrifugare per generare strati di gradiente.

Raccogli le isole dallo strato formato tra il mezzo del gradiente di densità e il buffer. Infine, scegli isolotti sani per la coltivazione. Nel seguente protocollo, dimostreremo l'isolamento delle isole pancreatiche murine mediante somministrazione di collagenasi seguita da centrifugazione in gradiente di densità.

- Inizia fissando gli arti del topo in posizione supina e spruzzando il corpo con etanolo al 70%. Utilizzando una pinza di vetro di copertura e forbici chirurgiche curve, praticare un'incisione orizzontale della pelle addominale di circa 3 centimetri e aprire la pelle per esporre la parete addominale. Praticare un'incisione verticale di 3-4 centimetri sul peritoneo addominale per esporre completamente il pancreas e posizionare il topo sotto un microscopio da dissezione.

Spingere il lobo del fegato superiormente per esporre il dotto biliare, che appare come un tubo pallido e rosa, e spostare delicatamente l'intestino dalla regione lombare e iliaca destra alla destra della cavità addominale per esporre il dotto biliare e l'arteria epatica. Utilizzare i Micro Serrefines di Schwartz per bloccare con cura il dotto biliare comune il più vicino possibile al fegato e identificare l'ampolla di Vater, che si trova sulla papilla duodenale ed è formata dall'unione del dotto pancreatico e del dotto biliare comune.

Utilizzando una pinza Micro Adson per tendere il dotto biliare comune, inserire un ago da mezzo pollice calibro 30 collegato a una siringa da 3 millilitri contenente 3 millilitri di soluzione di collagenasi P appena preparata nell'ampolla di Vater, spingendo l'ago nel dotto parallelo al vaso per circa un quarto della lunghezza del vaso. Una volta posizionato l'ago, stabilizzare l'ago con la pinza Micro Adson e iniettare lentamente e costantemente 3 millilitri di soluzione di collagenasi P nel condotto. L'iniezione è considerata riuscita se le regioni della testa, del collo, del corpo e della coda del pancreas sono completamente gonfiate.

- Il corretto ingresso nell'ampolla e l'incannulamento del dotto biliare comune sono fondamentali per una digestione di successo. La perforazione delle pareti duttali riduce l'efficacia dell'isolamento.

- Utilizzando una pinza curva e Micro Adson, estrarre con cautela il pancreas gonfiato partendo dalla milza e continuando verso lo stomaco e lungo il duodeno. Quindi mettere il pancreas in una provetta per digestione da 50 millilitri contenente 3 millilitri di soluzione ghiacciata di collagenasi P. Per raccogliere le isole, in primo luogo, utilizzare le forbici chirurgiche fini per tritare il pancreas per 3-5 secondi prima di mettere il tubo in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius a 100-120 rotazioni al minuto per 12-13 minuti.

Al termine dell'incubazione, agitare delicatamente la provetta per circa 30 secondi per disgregare il tessuto fino a quando la soluzione non è omogenea, come confermato dalle particelle di tessuto pancreatico fini e sabbiose. Non appena il tessuto è digerito, posizionare la provetta sul ghiaccio e aggiungere 40 millilitri di soluzione di stop ghiacciata per terminare la reazione enzimatica. Dopo aver disgregato delicatamente il pellet, centrifugare il tessuto digestivo in una centrifuga a secchio oscillante seguita da due centrifugazioni con 20 millilitri di soluzione fresca per lavaggio.

Dopo l'ultimo lavaggio, risospendere il pellet in 40 millilitri di HBSS ghiacciato per altri tre lavaggi, risospendendo il pellet in 5 millilitri di soluzione a gradiente di densità a temperatura ambiente dopo l'ultimo lavaggio. Agitare brevemente il tubo a bassa velocità fino a quando la soluzione non è omogeneizzata prima di aggiungere altri 5 millilitri di gradiente di densità a temperatura ambiente al tubo. Ora usa una pipetta da 10 millimetri per aggiungere delicatamente e lentamente 10 millimetri di HBSS a temperatura ambiente alla provetta in modo goccia per consentire la formazione di un gradiente, e usa una centrifuga a secchiello oscillante per isolare le popolazioni cellulari mediante separazione per gradiente di densità.

Al termine della centrifugazione, utilizzare una pipetta da 10 millilitri, pre-bagnata con HBSS freddo per raccogliere da 5 a 10 millilitri dello strato di isole tra il gradiente di densità e l'HBSS. Trasferire le isole in una nuova provetta da 50 millilitri contenente 20 millilitri di HBSS fresco e ghiacciato e raccogliere le cellule mediante centrifugazione in una centrifuga a secchiello oscillante. Aspirare con cura tutti tranne gli ultimi 3 millilitri di surnatante senza disturbare il pellet e lavare le isole almeno altre tre volte con 20 millilitri di HBSS fresco per lavaggio.

Dopo l'ultimo lavaggio, sostituire il surnatante con 4 millilitri di 37 gradi Celsius RPMI 1640 medium e agitare delicatamente il tubo per rimuovere il pellet. Versare immediatamente le isole in una capsula di Petri da 100 millimetri e lavare il tubo con 5 millilitri di terreno fresco RPMI 1640 per raccogliere eventuali isolotti rimanenti, raggruppando il lavaggio con gli altri isolotti.

Quindi utilizzare un microscopio da dissezione e una punta per pipetta da 20 microlitri per prelevare dalla piastra di Petri isole sane sferiche o oblunghe, di colore marrone dorato e una superficie liscia, per trasferirle in una nuova piastra di Petri contenente 10 millilitri di terreno RPMI 1640 completo. Quando tutte le isole sono state raccolte, posizionarle nell'incubatrice sterile a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica in aria umidificata per una notte.