Modelli sperimentali per lo Studio di Fisiologia dell'epitelio pigmentato retinico e fisiopatologia

L'obiettivo generale di questa procedura è generare colture di pigmento retinico fetale umano, epitelio o RPE che possono essere utilizzate come modello. Nelle indagini sulle malattie dell'occhio umano, i tessuti vengono ricevuti dai donatori come globi oculari intatti. Il primo passo della procedura consiste nel tagliare via il muscolo e il tessuto connettivo in eccesso e quindi aprire l'occhio rimuovendo la cornea e il cristallino.

L'occhio viene trattato con dispa e appiattito, quindi il monostrato di RPE viene staccato dalla coroide. Sezionato. Gli RPE vengono seminati in fiasche e coltivati per diverse settimane fino a raggiungere i monostrati confluenti e sviluppare il pigmento. Le colture cellulari sono utilizzate in esperimenti funzionali in vitro.

Gli esperimenti in vitro di successo vengono ripetuti in modelli animali di sperimentazione preclinica in cui le risposte RPE possono essere valutate meglio in ambienti di segnalazione più complessi. Il modello qui dimostrato porterà a una migliore comprensione della fisiologia dell'EPR e a nuovi interventi terapeutici per il trattamento delle malattie oculari. Ciao, mi chiamo Sheldon Miller.

Il mio laboratorio si trova nel National Eye Institute, che fa parte del National Institutes of Health nel campus di Bethesda, nel Maryland. Ciao, sono Arki di Miller Lab. Oggi vi mostreremo una procedura per la preparazione di colture primarie di cellule epiteliali pigmentate retiniche fetali umane.

Queste celle saranno preparate come monostrati confluenti che possono essere montati in camere di cangiante modificate. Utilizzeremo anche queste cellule RPE umane isolate per studi di biochimica e genetica. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per stabilire colture primarie di cellule epiteliali per studiare la funzione e la regolazione dei processi fisiologici e fisiopatologici e sviluppare un modello clinico animale di malattie.

Ci concentriamo sull'epitelio pigmentato retinico o RPE, che si trova nella parte posteriore dell'occhio, separando la retina neurale e l'afflusso di sangue coroideale. Questo diagramma schematico dell'occhio mostra la posizione del foglio RPE nella parte posteriore dell'occhio, proprio adiacente ai fotorecettori. L'inserto mostra le cellule della retina con i fotorecettori a destra e le cellule gangliari a sinistra.

Questo epitelio è metabolicamente estremamente attivo. Fagocitosi fotorecettori continuamente su base diurna e immagazzina reis, mizes e trasporta il pigmento visivo vitamina A ai fotorecettori. Nel ciclo visivo, agisce omeostaticamente per mantenere la composizione chimica e il volume degli spazi extracellulari circostanti.

Una proprietà critica degli epiteliali è la loro polarità. Il continuo rilascio asimmetrico di proteine alle membrane laterali apicali e basali è un processo regolato che consente all'epitelio di effettuare il traffico vettoriale di metaboliti, ioni e fluidi da uno spazio extracellulare all'altro. Questa attività aiuta l'epitelio a mantenere la salute e l'integrità della retina neurale.

La preparazione in vitro che descriviamo qui consente l'analisi delle proteine di trasporto, dei recettori e delle vie di segnalazione che determinano la polarità e la funzione epiteliale prima di iniziare la dissezione. Preparare una piastra a 12 pozzetti in una cappa a flusso laminare con soluzioni a temperatura ambiente. Ogni occhio richiede un pozzetto di 10 volte una soluzione antibiotica antimicotica, due pozzetti di un XPBS e un pozzetto di due unità per millilitro di spazio discale diluito in terreno RPE al 5% con siero Riempire una capsula di dissezione imbottita in silicone con un X-H-B-S-S, drenare il liquido e trasferire ciascun occhio in un pozzetto di soluzione antibiotica antimicotica.

Incubare per tre-cinque minuti a temperatura ambiente. Evitare di applicare una pressione eccessiva sul bulbo oculare. Sciacquare l'occhio in due pozzetti successivi di un XPBS per rimuovere l'antibiotico in eccesso.

Quindi utilizzare una pinza per trasferirlo nel piatto di dissezione riempito con un X-H-B-S-S sotto uno stereomicroscopio da dissezione. Usa le forbici dell'iride per rimuovere i muscoli in eccesso e il tessuto connettivo intorno all'occhio. Allineare l'occhio in modo che la cornea sia rivolta verso l'alto.

Utilizzare due aghi sterili calibro 27 per fissare l'occhio dal tessuto connettivo senza danneggiare la sclera al cuscinetto di silicone. In questo orientamento, utilizzare un coltello laterale per praticare un'incisione attraverso la sclera. Il taglio dovrebbe essere un terzo della distanza tra l'equatore dell'occhio e la superficie anteriore.

Usa le forbici dell'iride per continuare il taglio circolarmente intorno all'occhio per evitare danni al pigmento retinico. Epitelio, abbreviato RPE dall'attrazione della retina vitreale. Usa le stesse forbici per tagliare il corpo vitreo per separare il lembo oculare anteriore dalla conchiglia oculare.

Sollevare la parte anteriore dell'IOA e gettarla. Usa il forcipe per trasferire l'occhio aperto nel pozzo di dys. Assicurati che non ci siano bolle d'aria negli occhi. Tazza.

Incubare per 40-60 minuti a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Trasferire l'occhiello dal dis spazio al piatto di dissezione, che è stato riempito con temperatura ambiente fresca uno X-H-B-S-S. Posizionare la cruna con la coppetta rivolta verso l'alto e fissarla con 2 aghi da 27 gauge.

Sotto il microscopio da dissezione, utilizzare una pinza sottile per sollevare delicatamente la retina parzialmente separata con le forbici retiniche. Taglia la retina lontano dal nervo ottico. Scartare la retina con le forbici dell'iride.

Praticare un'incisione dalla periferia dell'occhio al nervo ottico. Spillare l'occhio con 5 aghi calibro 27. Per allungare lo strato di RPE, utilizzare le forbici retiniche per eseguire un taglio circolare attorno al nervo ottico.

Separare lo strato RPE passando a un ingrandimento di 250x o più. Trova il bordo del foglio RPE lungo il taglio effettuato dalle forbici dell'iride e vicino al nervo ottico. Utilizzare due paia di pinze per separare l'RPE e la membrana brus dallo strato di tessuto coroideale.

Prova diverse aree lungo il bordo di taglio per trovare dove la connessione tra l'RPE e la coroide è più debole. Staccare delicatamente la membrana per rimuoverla completamente. Posizionare i fogli RPE in un tubo conico da 15 millilitri riempito con viaggi a temperatura ambiente in EDTA.

Quando tutti i fogli sono raccolti, tappare la provetta, incubare le provette a bagnomaria per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Agitare energicamente il tubo per separare l'RPE in piccoli gruppi. L'assenza di grumi di cellule scure significa che la separazione è completa.

Rimetti il tubo nel bagnomaria per altri cinque minuti. Utilizzare una pasta, una pipetta e un'aspirazione delicata per rimuovere eventuali residui di tessuto non digerito. Far girare le celle in una centrifuga a 280 5G per quattro minuti.

Rimuovere il surnatante. Portare il volume finale fino a nove millilitri con una pipetta media al 15% di RPE per la risospensione. Le cellule pipettano tre millilitri della sospensione cellulare in un pallone quadrato di 25 centimetri.

Aggiungere due millilitri di coltura media fresca a temperatura ambiente, 15% di RPE. Le celle pernottano a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Man mano che le colture maturano, la loro pigmentazione aumenterà dopo tre o quattro settimane.

Le colture di successo saranno confluenti e uniformemente e intensamente pigmentate. Vi abbiamo appena mostrato come preparare le colture primarie di RP fetale umano. Quindi questo è tutto.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.