Name: Modelli sperimentali per lo Studio di Fisiologia dellepitelio pigmentato retinico e fisiopatologia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-06T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Impara a coltivare cellule epiteliali pigmentate retiniche fetali umane per studiare la fisiologia e la fisiopatologia dell'occhio. Questo metodo riproducibile consente esperimenti in vitro e modelli preclinici per malattie oculari.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ringraziamo Lab membri Jeffrey Adijanto, Tina Banzon, Li Rong, Qin Wan, Congxiao Zhang Jing Zhao, Connie Zhi, Awais Zia, Natalia Strunnikova aiuto per caratterizzare queste colture cellulari. Un ringraziamento speciale a Zhao Jing, Connie Zhi, e Tina Banzon per il loro aiuto nel mantenere grandi scorte di colture cellulari. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health Research Programma Intramural.

1. Tessuto fetale umano Tutte le ricerche tessuti umani legati segue i principi della Dichiarazione di Helsinki e il comitato di revisione istituzionale NIH. Gli occhi del feto sono ottenuti da un lenone indipendente, avanzata Risorse Bioscience (ABR, Alameda, CA), da donatori random a 16 a 22 settimane di gestazione, posto in RPMI-1640 supporti contenenti tubi (forniti da ABR), imballati su ghiaccio, e consegnati da un servizio notturno di consegna prioritaria. I tessuti rimangono vitali fino a 48 ore dopo l'enucleazione. 2. Colture Cellulari Media MEM-alfa modificato medio (Sigma-Aldrich) è usato come mezzo di base per la preparazione del 5% e il 15% di siero contenenti supporti per la coltura di cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE medio; tabella 1). <table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Sigma </td><td> Gibco </td><td> Quantità </td><td> Immagazzinamento </td></tr><tr><td> MEM, alfa modifica </td><td> M-4526 </td><td></td><td> 500 ml </td><td> +4 ° C </td></tr><tr><td> N1 supplemento </td><td> N-6530 </td><td></td><td> 5 ml </td><td> +4 ° C </td></tr><tr><td> Penicillina-streptomicina </td><td></td><td> 15140-148 </td><td> 5 ml </td><td> -20 ° C </td></tr><tr><td> GlutaMax - I </td><td></td><td> 35050 </td><td> 5 ml </td><td> -20 ° C </td></tr><tr><td> Non amminoacidi essenziali </td><td> M-7145 </td><td></td><td> 5 ml </td><td> +4 ° C </td></tr><tr><td> THT * </td><td></td><td></td><td></td><td> -80 ° C </td></tr><tr><td> La taurina </td><td> T-0625 </td><td></td><td> 125 mg </td><td></td></tr><tr><td> Idrocortisone </td><td> H-0396 10 </td><td></td><td> 10 mcg </td><td></td></tr><tr><td> Triiodo-thyronin </td><td> T-5516 </td><td></td><td> 0,0065 mg </td><td></td></tr><tr><td> ** Siero fetale bovino </td><td></td><td></td><td> 5% o 15% </td><td> -80 ° C </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Fetale umano RPE medio dei componenti per la preparazione di 500 ml di mezzo THT * è preparata sciogliendo taurina-idrocortisone-triiodo-thyronin in 1 1,5 ml di PBS prima di effettuare il mezzo. Diverse aliquote sono realizzati e conservati a -80 ° C per semplificare la preparazione coltura del terreno di coltura. ** Siero fetale bovino non è ottenuta da Sigma-Aldrich o Gibco. Siero fetale bovino utilizzato nella preparazione dei media è ottenuta da Atlanta Biologicals (Norcross, GA). Ogni bottiglia del siero è inattivato con il calore (56 ° C per 1 ora) prima dell'uso. Per garantire coerenza grandi quantità di cellule cultura di siero prelevati dallo stesso lotto vengono acquistati e conservati in -20 ° C fino a quando non sono utilizzati per la preparazione dei media. Cellule scarsamente seminate da un lotto specifico di cellule hfRPE sono cresciute in 24 - o 12 - piastre per alcune settimane in un mezzo contenente 20% FBS di lotti diversi. Le cellule in più rapida crescita melanated con la morfologia RPE più classico (ciottoli) indicano un lotto appropriato siero che può essere utilizzato per la coltura cellulare. Terreno di coltura cellulare contenente anche: N1 supplemento (Sigma-Aldrich) 1:100 mL / mL, GlutaMax / penicillina-streptomicina 1:100 mL / mL (Gibco), e la soluzione di aminoacidi non essenziali (Sigma-Aldrich) 1:100 ml / mL. Inoltre, idrocortisone (20 mg / L), taurina (250 mg / L), e triiodo-thyronin (0,013 mg / L) (THT) è preparato in anticipo, sciogliendo questi tre componenti in PBS alla concentrazione finale di 1:500 (ml / ml). Aliquote di THT sono conservati a 80 ° C fino a quando in un terreno di RPE. 3. Colture Cellulari Al ricevimento, globi intatti sono sciacquato in soluzione antibiotica antimicotico (diluito a 10 volte;.. Gatto non 15240-096; Invitrogen) più gentamicina (1 mg / ml) per 3 a 5 minuti (figura 1). <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Dopo l'incubazione antibiotici sono risciacquato due volte con medium come HBSS o PBS. Un globo oculare al momento è trasferito al piatto cm 10 Petri con rivestito con Sylgard-184 (WPI) e fissato con aghi 27G. Utilizzando netta SidePort coltello (Alcon) un'incisione è fatta attraverso la sclera sotto il corpo ciliare (1 / 3 della distanza dall'equatore occhio sulla superficie anteriore). Questa incisione viene utilizzato per avviare un taglio circolare per la rimozione della porzione anteriore dell'occhio. Questo taglio è realizzato con un carburo di tungsteno rivestiti forbici curve iride con una lama seghettata (FST). Prima della rimozione della parte anteriore dell'occhio, un taglio è fatto attraverso il corpo vitreo per evitare di staccare il retina dal RPE al polo posteriore. Dopo la parte anteriore dell'occhio viene rimosso, il polo posteriore è incubato con dispasi-I soluzione (2 U / mL, cat non 04942086001;.. Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) nel 5% siero supporto contenente per 40-60 minuti a 37 ° C-5% di CO 2. Dopo il trattamento dispasi, i poli posteriori sono trasferiti ad un HBSS in piastre di Petri con imbottiture in silicone (Sylgard 184; Dow Corning, Midland, MI) e sezionato in quadranti o pezzi più grandi a sufficienza per appiattire tessuti. Poi la retina è delicatamente rimosso con una pinza. Cella singola strati RPE sono stati staccata in fogli e raccolti direttamente nel freddo tripsina-EDTA (Gibco, # 25200-056) soluzione. Dopo l'RPE sono raccolti, tubi con tessuti in tripsina-EDTA sono sigillate e trasferiti in bagnomaria per 10-15 minuti a 37 ° C. Dopo 10 minuti di incubazione, i tubi sono vigorosamente scossi per separare RPE in piccoli gruppi. Se la separazione non è completa, i tubi sono posti di nuovo in bagno d'acqua per altri 5 minuti. Dopo tripsina-EDTA incubazione, le provette vengono ispezionati per un eventuale non-disciolti gruppi di cellule miste. Ogni cluster osservati sono rimossi con punta sottile vetro pipetta Pasteur. Dopo riducendo la velocità (1,4 giri a centrifuga clinica per 4 min), le cellule hfRPE sono risospese in media RPE 15% e poi messo in Primaria palloni (esempio: Cat. 08-772-45, Fisher Scientific, Pittsburgh, PA.. ). Questo mezzo è sostituito dopo 1 giorno con 5% di siero contenente medio RPE, e successive modifiche sono state fatte ogni 2 o 3 giorni. Dopo 3 o 4 settimane, le cellule si confluenti e uniformemente pigmentate. Vengono poi trypsinized a 0,25% tripsina-EDTA per 10 a 15 minuti, risospese nel 15% di siero contenente cellule RPE media cultura, e seminate su inserti chiari colture cellulari da 150 a 200K cellule per pozzetto (Transwell; Corning Costar, Corning, NY), con 12 mm di diametro inserti, pori 0,4 um, membrane in poliestere (esempio: Cat. 07-200-161, Fisher Scientific)... Prima della semina, i pozzi sono stati rivestiti con umana matrice extracellulare (10 mg in 150 microlitri HBSS per pozzetto, Cat. 354237;.. BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) e curata con luce UV nella cappa per 2 ore. In alcuni casi, la procedura tripsinizzazione è stata ripetuta per la seconda volta, per raccogliere le cellule che non si sia staccata dopo il tripsinizzazione prima. Lo stesso protocollo (ad esclusione di rivestimento con ECM) è stato utilizzato per le cellule in coltura i flaconi per generare la popolazione di cellule P1. Queste cellule sono stati utilizzati in esperimenti, quando avevano una resistenza totale dei tessuti di ≥ 200 Ω • cm 2 e sono stati uniformemente pigmentate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2032/2032fig1full.jpg">Fare clic qui per una cifra più grande 1</a> . 4. Procedure passo-passo <ol><li> Preparare 12-pozzetti con soluzioni multiple (per ogni occhio 4 pozzi necessari): <ol class="lalpha"><li> aggiungere 10x soluzione antibiotica antimicotico - 1 e / occhio </li><li> aggiungere PBS / HBSS soluzione per lavare - 2 pozzi / occhio </li><li> aggiungere soluzione dispasi - 1 e / occhio </li></ol></li><li> Preparare dissezione Petri da spacchettamento 5 aghi di fissaggio e lo riempie di HBSS </li><li> Disimballare occhi e metterli in antibiotico-antimicotico soluzione per 3-5 minuti (preparata al punto 1) </li><li> Lavare gli occhi in due pozzi (preparata al punto 1) con PBS / HBSS, poi trasferirli dissezione piatto. </li><li> Assetto muscolare eccessivo e tessuto connettivo attorno agli occhi </li><li> 27G utilizzando aghi sicuro (da definire a base di silicio) gli occhi a sezionare piatto di allineamento in un modo in cui cornea rivolto verso l'alto. </li><li> Utilizzando coltello fare un'incisione sotto porta laterale della cornea, dove taglio circolare inizierà </li><li> Utilizzando le forbici iris fanno tagliare intorno all'occhio, poi con le forbici tagliare vitreo stesso e sollevare porzione anteriore dell'occhio distanza. Nota: in passi 3-8 evitare una pressione eccessiva meccanica bulbo oculare. </li><li> Trasferimento occhio aperto in soluzione dispasi (preparata al punto 1) </li><li> Incubare oculare per 40-60 minuti a 37 ° C con 5% di CO 2 </li><li> Sostituire la soluzione HBSS a sezionare piatto con uno fresco. </li><li> Trasferimento occhio dalla soluzione dispasi al piatto dissezione. </li><li> Occhio posizione nella capsula di Petri (coppa bulbo oculare verso l'alto) e fissarlo con due aghi 27G. </li><li> Sollevare delicatamente retina parzialmente separata e con le forbici taglio della retina retina lontano dal nervo ottico. Scartare retina. </li><li> Utilizzando le forbici iris fare una incisione dalla periferia degli occhi verso nervo ottico. </li><li> Utilizzando tutti e cinque gli aghi 27G appiattire strato RPE occhio facendo ben teso. </li><li> Utilizzando le forbici taglio della retina fare circolare intorno nervo ottico Strato di separazione RPE dall'attaccamento al nervo ottico. Nota: i passaggi 13-17 può essere fatto con bassi ingrandimenti o senza microscopio stereo </li><li> Regolare stereomicroscopio di ingrandimento 250xo più e trovare margini del foglio RPE vicino al nervo ottico lungo il taglio effettuato da forbici iris. </li><li> Utilizzando due pinze membrana separata RPE-Bruch dallo strato di tessuto coroide. Si può richiedere alcuni tentativi per trovare spazio lungo il bordo dove la connessione di RPE e coroide è più debole. </li><li> RPE fogli in luogo freddo tripsina-EDTA in 15 ml tubo </li><li> Dopo l'RPE sono raccolti, tubi cappuccio e trasferimento con tessuti in tripsina-EDTA in bagnomaria per 10-15min a 37 ° C. </li><li> Dopo 10 minuti di incubazione, scuotere vigorosamente provette da 15 ml per separare RPE in piccoli gruppi. Se la separazione non è completa, luogo tubi di nuovo in bagno d'acqua per altri 5 minuti. </li><li> Ispezionare i tubi per un eventuale non-disciolti gruppi di cellule miste. Ogni cluster osservato deve essere rimosso utilizzando vetro sottile a punta della pipetta Pasteur. </li><li> Spin down (1,4 rpm centrifuga clinica per 4 min), le cellule hfRPE, rimuovere il surnatante e risospendere le cellule nel 15% RPE dei media (9 totali ml) </li><li> Mettere 3 ml di sospensione cellulare in fiasche Primaria aggiungere 2 ml di fresca dei media il 15% RPE, borraccia posto in incubatrice fino al giorno successivo (37 ° C, 5% CO 2) </li></ol> 5. Rappresentante Risultati Validazione funzionale di colture cellulari hfRPE In esperimenti precedenti abbiamo usato queste colture primarie per determinare l', polarizzazione espressione e la funzione delle proteine ​​di membrana plasmatica di trasporto e di individuare specifiche vie di segnalazione che regolano la funzione RPE 1-11 Queste caratteristiche così come sono accumulati fornire una validazione insieme di proprietà che possono essere applicate ad ogni generazione cellulare. Gli esperimenti sono riassunte qui di seguito identificare le proteine ​​che determinano il trasporto transepiteliale fluido e l'integrità del percorso paracellulare. Questi esperimenti in vitro sono stati validati in un modello animale di ri-riattacco della retina 6. <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Localizzazione di CFTR nelle cellule hfRPE Sinistra pannello superiore:. CFTR è stata rilevata nelle cellule hfRPE con membrana arricchiti estratti. M, marcatore di peso molecolare, corsia 1, grandi maturi (fascia C) e immaturi (fasce A e B) pannello centrale inferiore: la localizzazione di immunofluorescenza CFTR (etichetta verde) In alto a destra del pannello: allargata vista in sezione trasversale attraverso il piano z che mostra.. massima intensità di proiezione con l'asse z. ZO-1 (etichettato come rosso) serve come un marcatore nodo stretto delineando i lati apicale e basolaterale della RPE. DAPI (blu) le etichette dei nuclei situato vicino alla membrana basale. ZO-1 appare come giallo / arancio, dal momento che la sua fluorescenza verde sovrapposizioni etichetta rossa CFTR. <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Cambiamenti fisiologici IFNγ-indotta in hfRPE A:. Aggiunta di IFNγ al bagno basale maggiore di trasporto transepiteliale fluido (J v) in monostrato di primario, le cellule in coltura hfRPE J v è un grafico in funzione del tempo nella traccia superiore e fluido rete. assorbimento (apicale a bagno basale) è indicato da valori positivi; potenziale transepiteliale (TEP) e la resistenza dei tessuti totale (R T) vengono riportati in funzione del tempo nelle tracce fondo. B: L'aggiunta di CFTRinh-172 (5 micron) al bagno basale inibito l'IFNγ-stimolata J aumentare v. Di seguito è riportato un esempio di esperimenti modello animale confermando hfRPE risultati in vitro. In questo esperimento, create artificialmente distacco di retina è risultata significativamente ridotta dopo l'aggiunta di IFNg alla superficie esterna dell'occhio (Figura 4 A, B). Questo effetto può essere parzialmente bloccata da: (1) aggiunta del bloccante cAMP (fig. 4D), (2) completamente bloccato dopo l'aggiunta di JAK bloccanti cAMP +. Le immagini di seguito sono ottenuti utilizzando lo scanner ottobre <img src="/files/ftp_upload/2032/2032fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Esperimenti in vivo distacco di retina. Le procedure per tali esperimenti in vivo sono stati precedentemente descritti in dettaglio 6. In questi esperimenti, distacco della retina dell'occhio sono stati creati nel ratto mediante iniezione di 0,5-3 ml di soluzione PBS modificato nello spazio sottoretinico (SRS), da soli o con una combinazione di JAK-STAT e di inibitori della via di PKA. Ogni esperimento ha avuto un periodo iniziale di controllo di 40-70 minuti dopo la creazione del distacco di retina. Durante questo periodo, il tasso di variazione del volume bleb è stata misurata per assicurare la stabilità vescichetta. Tomografia a coerenza ottica per immagini (Istituto di Fisica Applicata, Accademia Russa delle Scienze, Nizhniy Novgorod, Russia) è stato utilizzato per misurare i tempi del cambiamento volume in SRS. La durata di ri-attaccamento volcambiare UME è stata misurata mediante tomografia a coerenza ottica (OCT). Immagini dal 4 ottobre esperimenti diversi (pannelli a sinistra; dC) che mostrano un cambiamento della dimensione distacco (frecce in A, B e D) dopo l'aggiunta di IFNγ sulla superficie anteriore per 40-70 min. Pannelli A e B mostrano che IFNγ aumentato Jv dal suo tasso di controllo (≈ 2 microlitri • cm 2 • h -1) a 14 e 12 microlitri • cm 2 • h-1, rispettivamente. In seguito all'aggiunta di JAK-STAT e di inibitori della PKA (C e D), l'IFNγ - tasso di assorbimento indotti erano significativamente ridotti a 0,2 e 7,9 microlitri • cm 2 • h-1, rispettivamente. Le frecce indicano il confine della vescichetta per il confronto con l'area racchiusa tra la linea tratteggiata, (volume di partenza). Lato destro della figura: il pannello superiore in-sintesi delle misurati i tassi di Jv da diversi esperimenti; mezzo pannello-film ( <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/2032/Bleb%205.wmv">clicca qui</a> ), inferiore del pannello 3D-sezioni di esperimenti riassunti in B. PseudoColor in blu indica l'estensione spaziale, di distacco a t = 0 e 40 minuti dopo l'aggiunta di INFγ. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con l'Associazione per la Ricerca in Oftalmologia Visione e dichiarazione. Il protocollo è stato approvato dalla cura degli animali e del Comitato utilizzo del National Institutes of Health.

<ol><li>Bharti, K., Miller, S. S., Arnheiter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+paradigm%3A+Retinal+pigment+epithelium+cells+generated+from+embryonic+stem+cells+or+induced+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+%26+Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">The new paradigm: Retinal pigment epithelium cells generated from embryonic stem cells or induced pluripotent cells.</a> Pigment Cell & Melanoma Research. , Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Strunnikova, N. V., Maminishkis, A., Barb, J. J., Wang, F., Zhi, C., Sergeev, Y., Chen, W., Edwards, A. O., Stambolian, D., Abecasis, G., Swaroop, A., Munson, P. J., Miller, S. S., S, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+and+molecular+signature+of+human+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis and molecular signature of human retinal pigment epithelium.</a> Hum Mol Genet. 19 (12), 2468-2486 (2010).</li>
<li>Miller, S. S., Maminishkis, A., Li, R., Adijanto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+184%3A+Phototransduction%3A+RPE+transport+Retina+Phototransduction%3A+RPE+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedia+of+the+Eye%22%5BJournal%5D)">Chapter 184: Phototransduction: RPE transport Retina Phototransduction: RPE transport.</a> Encyclopedia of the Eye. , Elsevier. 2540-2540 (2010).</li>
<li>Bryant, D. M., Mostov, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+cells+to+organs%3A+Building+polarized+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">From cells to organs: Building polarized tissue.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (11), 887-901 (2008).</li>
<li>Maminishkis, A., Chen, S., Jalickee, S., Banzon, T., Shi, G., Wang, F. E., Ehalt, T., Hammer, J. A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3612-3624 (2006).</li>
<li>Shi, G., Maminishkis, A., Banzon, T., Jalickee, S., Li, R., Hammer, J., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+chemokine+gradients+by+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Control of chemokine gradients by the retinal pigment epithelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 4620-4630 (2008).</li>
<li>Economopoulou, M., Hammer, J., Wang, F. E., Fariss, R., Maminishkis, A., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+localization%2C+and+function+of+junctional+adhesion+molecule-C+%28JAM-C%29+in+human+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Expression, localization, and function of junctional adhesion molecule-C (JAM-C) in human retinal pigment epithelium.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (3), 1454-1463 (2008).</li>
<li>Li, R., Maminishkis, A., Banzon, T., Wan, Q., Jalickee, S., Chen, S., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN%7Bgamma%7D+Regulates+Retinal+Pigment+Epithelial+Fluid+Transport%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">IFN{gamma} Regulates Retinal Pigment Epithelial Fluid Transport.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 297, C1452-C1465 (2009).</li>
<li>Li, R., Maminishkis, A., Wang, F. E., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGF-C+and+-D+induced+proliferation%2Fmigration+of+human+RPE+is+abolished+by+inflammatory+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">PDGF-C and -D induced proliferation/migration of human RPE is abolished by inflammatory cytokines.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 5722-5732 (2007).</li>
<li>Maminishkis, A., Jalickee, S., Blaug, S. A., Rymer, J., Yerxa, B. R., Peterson, W. M., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P2Y%282%29+receptor+agonist+INS37217+stimulates+RPE+fluid+transport+in+vitro+and+retinal+reattachment+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">The P2Y(2) receptor agonist INS37217 stimulates RPE fluid transport in vitro and retinal reattachment in rat.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 43, 3555-3566 (2002).</li>
<li>Wang, F. E., Zhang, C., Maminishkis, A., Dong, L., Zhi, C., Li, R., Zhao, J., Majerciak, V., Gaur, A. B., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-204%2F211+alters+epithelial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology.</a> FASEB J. 24, (2010).</li>
<li>Adijanto, J., Banzon, T., Jalickee, S., Wang, N. S., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CO2-induced+ion+and+fluid+transport+in+human+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">CO2-induced ion and fluid transport in human retinal pigment epithelium.</a> J Gen Physiol. 133, 603-622 (2009).</li>
<li>Li, R., Maminishkis, A., Zahn, G., Vossmeyer, D., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+alpha5beta1+mediates+attachment%2C+migration%2C+and+proliferation+in+human+retinal+pigment+epithelium%3A+relevance+for+proliferative+retinal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Integrin alpha5beta1 mediates attachment, migration, and proliferation in human retinal pigment epithelium: relevance for proliferative retinal disease.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 5988-5996 (2009).</li>
<li>Peterson, W. M., Meggyesy, C., Yu, K., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+ATP+activates+calcium+signaling%2C+ion%2C+and+fluid+transport+in+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extracellular ATP activates calcium signaling, ion, and fluid transport in retinal pigment epithelium.</a> J Neurosci. 17, 2324-2337 (1997).</li>
<li>Voloboueva, L. A., Liu, J., Suh, J. H., Ames, B. N., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R%29-alpha-lipoic+acid+protects+retinal+pigment+epithelial+cells+from+oxidative+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">R)-alpha-lipoic acid protects retinal pigment epithelial cells from oxidative damage.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 4302-4310 (2005).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Negli esperimenti attuali, si descrivono ulteriori modifiche delle nostre tecniche precedentemente pubblicato 3, intesa a semplificare il più passaggi necessari a produrre coerente culture hfRPE primaria con un numero maggiore di cellule disponibili per occhio. Ogni modifica della procedura originale è stato rigorosamente testato in fisiologia e più esperimenti di biologia molecolare per garantire che le modifiche non introdurre artefatti e di essere continuamente testati da molti altri laboratori usando queste cellule. Infine, ulteriori esperimenti sono stati condotti per confrontare i risultati in vitro a perturbazioni simili in modelli animali.

Strumenti necessari per il protocollo dissezione <ol><li> Stereo microscopio - qualsiasi X250 disponibili con ingrandimento di lavoro necessario per la dissezione </li><li> Piatto dissezione - ad esempio Kimble 100 x 20mm # 23062 (uno per dissezione) qualsiasi fonte </li><li> Sylgard 184 - Cat WPI. # SYLG184 * * Per preparare la dissezione piatto seguire Sylgard 184 incluso delle istruzioni di miscelazione, versare misto elastomero liquido in piastra di Petri per formare 5-8mm layer. Lasciare elastomero di cura per almeno 24 ore. Piatto con elastomero curate possono essere sterilizzati con etanolo al 70% e riutilizzabili più volte (~ 100 volte) </li><li> Aghi da 27 G BD PrecissionGlide 1 ¼ lunghezza (5 per dissezione) qualsiasi fonte </li><li> HBSS 1X Soluzione contenente sali di Ca e Mg - Cat # 14025 GIBCO 500ml (buona per dissezioni multiple). </li><li> Iris forbici carburo lama seghettata, curva - FST Cat # 14559-11 (uno). </li><li> Forbici della retina - Katena Cat # K4-5300 (uno). </li><li> Pinza - per esempio pinzette Dumont # 5 con punte lucido da Cat WPI # 500085 (2 pezzi). </li><li> Sideport coltello - Alcon, clearcut 1mm, Bevel Dual, Cat angolato # 8065921540. </li><li> Centrifuga tubo 15ml - (uno per occhio) qualsiasi fonte </li><li> Pipetta Pasteur in vetro - (uno per dissezione) qualsiasi fonte </li><li> Tavola 12 bene (uno per dissezione) qualsiasi fonte </li><li> Primaria 25 centimetri Pallone 2 - (2-3 per occhio) qualsiasi fonte </li></ol>

modelli sperimentali per lo studio di fisiologia dell&#39;epitelio pigmentato retinico e fisiopatologia

 Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

Abbiamo sviluppato un procedimento di coltura cellulare in grado di produrre grandi quantità di monostrati confluenti di primaria umano fetale epitelio pigmentato retinico (hfRPE) culture morfologiche, fisiologiche e genetiche autoctone di RPE umano. Queste colture cellulari hfRPE mostra pigmentazione pesante, e la microscopia elettronica mostrano ampie microvilli della membrana apicale. I complessi giunzionali sono stati identificati con etichettatura immunofluorescenza di varie proteine ​​di giunzione stretta. Polarità epiteliale e la funzione di queste culture facilmente riproducibile primarie sono molto simili precedentemente studiato i modelli di RPE mammiferi nativi, compresi gli esseri umani. Questi risultati sono stati estesi con lo sviluppo di interventi terapeutici in diversi modelli animali di malattie dell&#39;occhio umano. Ci siamo concentrati sulle strategie per la rimozione di anomalo accumulo di liquido nella retina o spazio sottoretinico. Lo spazio extracellulare subretinico separa i segmenti esterni dei fotorecettori e la membrana apicale del RPE ed è fondamentale per il mantenimento degli allegati della retina e tutta una serie di RPE / retina interazioni.

Forniamo un metodo riproducibile per la coltura monostrati confluenti di cellule fetali dell&#39;epitelio pigmentato retinico (hfRPE), le cellule che presentano morfologia, fisiologia, polarità e proteine ​​e schemi di espressione genica dei tessuti adulti nativi. Questo lavoro è stato esteso ad un modello animale di malattie degli occhi diversi.

Modelli sperimentali per lo Studio di Fisiologia dell&#39;epitelio pigmentato retinico e fisiopatologia

Abbiamo sviluppato una procedura di coltura cellulare in grado di produrre grandi quantità di monostrati confluenti di epitelio pigmentato retinico fetale umano primario...

L'obiettivo generale di questa procedura è generare colture di epitelio pigmentato retinico fetale umano, o RPE, utilizzabili come modello. Nelle indagini sulle malattie oculari umane, i tessuti vengono ricevuti da donatori sotto forma di globi oculari integri. Il primo passaggio della procedura consiste nell'asportare i muscoli e i tessuti connettivi in eccesso, quindi aprire l'occhio rimuovendo la cornea e il cristallino.L'occhio viene trattato con dispa e appiattito, quindi il monolayer di epitelio pigmentato retinico (RPE) viene staccato dalla coroide. Il RPE isolato viene seminato in fiasche e coltivato per diverse settimane fino al raggiungimento di monolayer confluenti e allo sviluppo del pigmento. Le colture cellulari vengono utilizzate in esperimenti funzionali in vitro.Gli esperimenti in vitro di successo vengono ripetuti in modelli animali di prova preclinica, in cui le risposte dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) possono essere valutate meglio in ambienti di segnalazione più complessi. Il modello qui descritto porterà a una migliore comprensione della fisiologia dell'RPE e a nuovi interventi terapeutici per il trattamento delle malattie oculari. Ciao, mi chiamo Sheldon Miller.Il mio laboratorio si trova presso l'Istituto Nazionale per la Salute degli Occhi, che fa parte degli Istituti Nazionali della Salute nel campus di Bethesda, Maryland. Ciao, sono Arki del Miller Lab. Oggi vi mostreremo un procedimento per la preparazione di colture primarie di cellule epiteliali pigmentate retiniche fetali umane.Queste cellule verranno preparate come monocapati confluenti che possono essere montati in camere per singoli utilizzate in forma modificata. Utilizzeremo anche queste cellule RPE umane isolate per studi di biochimica e genetica. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per stabilire colture primarie di cellule epiteliali al fine di studiare la funzione e la regolazione di processi fisiologici e patofisiologici e sviluppare modelli animali clinici di malattie.Ci concentriamo sull'epitelio pigmentato retinico o RPE, che si trova nella parte posteriore dell'occhio, separando la retina neurale e l'afflusso sanguigno corioideo. Questo diagramma schematico dell'occhio mostra la posizione del foglietto RPE nella parte posteriore dell'occhio, proprio adiacente ai fotoricettori. L'insetto mostra le cellule della retina con i fotoricettori a destra e le cellule gangliari a sinistra.Questo epitelio è estremamente attivo dal punto di vista metabolico. Fagocita continuamente i fotorecettori su base circadiana, e immagazzina, modifica e trasporta il pigmento visivo vitamina A ai fotorecettori. Nel ciclo visivo, agisce in modo omeostatico per mantenere la composizione chimica e il volume degli spazi extracellulari circostanti.Una proprietà fondamentale degli epiteli è la loro polarità. Il costante trasporto asimmetrico di proteine verso le membrane apicali e basolaterali è un processo regolato che consente all'epitelio di effettuare il traffico vettoriale di metaboliti, ioni e fluidi da uno spazio extracellulare all'altro. Questa attività aiuta l'epitelio a mantenere la salute e l'integrità della retina neurale.Il preparato in vitro che descriviamo qui consente l'analisi di proteine di trasporto, recettori e vie di segnalazione che determinano la polarità e la funzione epiteliale prima di iniziare la dissezione. Preparare una piastra a 12 pozzetti in una cappa a flusso laminare con soluzioni a temperatura ambiente. Ogni occhio richiede un pozzetto di soluzione antibiotica antimicotica 10x, due pozzetti di XPBS e un pozzetto di due unità per millilitro di spazio disco diluite in mezzo RPE al 5% con siero. Riempire una bacinella da dissezione foderata con silicone con X-H-B-S-S, eliminare il liquido e trasferire ciascun occhio in un pozzetto di soluzione antibiotica antimicotica.Incubare per tre-cinque minuti a temperatura ambiente. Evitare di applicare pressione eccessiva sul bulbo oculare. Sciacquare l'occhio in due pozzetti successivi di un XPBS per rimuovere l'antibiotico in eccesso.Quindi utilizzare una pinzetta per trasferirlo nella piastra per dissezione riempita con X-H-B-S-S 1X sotto un microscopio stereoscopico per dissezione. Utilizzare forbici da iridectomia per rimuovere l'eccesso di muscolo e tessuto connettivo intorno all'occhio. Posizionare l'occhio in modo che la cornea sia rivolta verso l'alto.Usare due aghi sterili da 27 gauge per fissare l'occhio al pad di silicone tramite il tessuto connettivo, senza danneggiare la sclera. In questa orientazione, utilizzare un bisturi per fori laterali per praticare un'incisione attraverso la sclera. Il taglio deve trovarsi a un terzo della distanza tra l'equatore oculare e la superficie anteriore.Utilizzare forbici da iridectomia per proseguire il taglio in modo circolare attorno all'occhio, evitando danni all'epitelio pigmentato retinico, abbreviato RPE a causa dell'attrazione della retina con il corpo vitreo. Utilizzare le stesse forbici per tagliare attraverso il corpo vitreo e separare la parte anteriore dell'occhio dalla coppa oculare.Sollevare la porzione anteriore dell'IOA e scartarla. Utilizzare pinzette per trasferire l'occhio aperto nel pozzetto della piastra. Assicurarsi che non ci siano bolle d'aria nell'occhio.Cup.Incubare per 40-60 minuti a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Trasferire l'occhio dal piatto di dissezione alla capsula di dissezione, precedentemente riempita con soluzione X-H-B-S-S fresca a temperatura ambiente. Posizionare l'occhio con la coppa rivolta verso l'alto e fissarla con 2 aghi da 27 gauge.Sotto il microscopio stereoscopico, utilizzare pinzette fini per sollevare delicatamente la retina parzialmente separata con forbici per retina. Recidere la retina dal nervo ottico. Scartare la retina con le forbici per iride.Eseguire un'incisione dalla periferia dell'occhio fino al nervo ottico. Fissare l'occhio con 5 aghi da 27 gauge. Per stirare il livello dell'epitelio pigmentato retinico (RPE), utilizzare forbici retiniche per effettuare un taglio circolare intorno al nervo ottico.Separare il foglio dell'epitelio pigmentato retinico passando a un ingrandimento di 250x o superiore. Individuare il bordo del foglio dell'epitelio pigmentato retinico lungo il taglio effettuato con le forbici per iridectomia e vicino al nervo ottico. Utilizzare due paia di pinze per staccare l'epitelio pigmentato retinico e la membrana di Bruch dallo strato del tessuto corioideo.Prova diverse aree lungo il bordo tagliato per individuare dove il collegamento tra l'epitelio pigmentato retinico (RPE) e la coroide è più debole. Stacca delicatamente la membrana all'indietro per rimuoverla completamente. Posiziona i fogli di RPE in un tubo conico da 15 millilitri riempito con tripsina a temperatura ambiente in EDTA.Dopo aver raccolto tutti i fogli, chiudere il tubo con il tappo e incubare i tubi in un bagno termico per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Agitare vigorosamente il tubo per separare l'epitelio pigmentato retinico (RPE) in piccoli aggregati. L'assenza di grumi scuri indica che la separazione è completa.Riportare il tubo nel bagnomaria per altri cinque minuti. Utilizzare un puntale, una pipetta e una leggera aspirazione per rimuovere eventuali residui di tessuto non digerito. Centrifugare le cellule a 280 ×g per quattro minuti.Rimuovere il soprannatante. Portare il volume finale a nove millilitri con mezzo RPE al 15% utilizzando una pipetta per risospendere. Pipettare tre millilitri della sospensione cellulare in un’area di coltura da 25 centimetri quadrati.Aggiungere due millilitri di mezzo di coltura RPE fresco al 15% a temperatura ambiente. Incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Maturando le colture, la loro pigmentazione aumenterà dopo tre o quattro settimane.Le colture di successo saranno confluenti e uniformemente, intensamente pigmentate. Abbiamo appena mostrato come preparare colture primarie di RP fetale umano. Ecco fatto.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

experimental-models-for-study-retinal-pigment-epithelial-physiology

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Qui presentiamo un protocollo per differenziare cellule del pigmento retinico epitelio (RPE) da cellule staminali pluripotenti umane recanti mutazioni paziente-derivate. Le linee cellulari mutanti possono essere utilizzate per analisi funzionali tra cui immunoblotting, immunofluorescenza e patch clamp. Questo approccio di malattia-in-un-piatto aggira la difficoltà di ottenere cellule RPE umane native.

Differenziazione, manutenzione e l'analisi delle cellule dell'epitelio del pigmento retinico umano: un modello di malattia-in-un-piatto per le mutazioni BEST1

Qui, presentiamo un metodo per registrare le risposte elettriche evocate dalla luce dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) nei topi usando una tecnica nota come DC-ENG descritta per la prima volta da Marmorstein, Peachey e colleghi nei primi anni 2000.

Elettroretinogramma ad accoppiamento diretto (DC-ERG) per la registrazione delle risposte elettriche evocate dalla luce dell'epitelio pigmentato retinico del mouse

Questo protocollo, originariamente riportato da Fernandez-Godino et al. La procedura dura circa 3 ore.

Dissezione e coltura efficienti delle cellule epiteliali del pigmento retino del topo primario

Questo protocollo presenta e descrive i passaggi per l'isolamento, la dissezione, la coltivazione e la colorazione degli espianti retinici ottenuti da un topo adulto. Questo metodo è utile come modello ex vivo per lo studio di diverse malattie neurovascolari retiniche come la retinopatia diabetica.

Espianto retinico della retina del topo adulto come modello ex vivo per lo studio delle malattie neurovascolari retiniche

Descriviamo un metodo per separare in modo efficiente l'epitelio pigmentato retinico (RPE) dalla retina negli occhi umani e generare interi supporti piatti RPE / coroidi per analisi istologiche e morfometriche dell'RPE.

Generazione efficiente e coerente di epitelio/coroide pigmentato retinico Flatmounts da occhi umani per analisi istologiche

Descriviamo un metodo semplice ed efficiente per isolare le cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) dagli occhi di giovani cavie pigmentate. Questa procedura consente studi di biologia molecolare di follow-up sull'RPE isolato, comprese le analisi di espressione genica.

Isolamento delle cellule epiteliali pigmentate retiniche da occhi di porcellino d'India

I modelli murini possono essere strumenti utili per studiare la biologia dell'epitelio pigmentato retinico (RPE). È stato stabilito che i topi possono sviluppare una serie di patologie RPE. Qui, descriviamo un protocollo di fenotipizzazione per chiarire e quantificare le patologie RPE nei topi utilizzando luce, elettrone di trasmissione e microscopia confocale.

Un protocollo per valutare e quantificare le patologie dell'epitelio pigmentato retinico in modelli murini di degenerazione maculare legata all'età

Le malattie degenerative dell'occhio che colpiscono lo strato di epitelio pigmentato retinico dell'occhio hanno origini monogeniche e poligeniche. Diversi modelli di malattia e un'applicazione software, LipidUNet, sono stati sviluppati per studiare i meccanismi della malattia, nonché potenziali interventi terapeutici.

Metodo basato sull'apprendimento automatico di LipidUNet per la caratterizzazione e la quantificazione dei depositi lipidici utilizzando l'epitelio pigmentato retinico derivato da iPSC

Questo protocollo delinea la procedura per ottenere e coltivare cellule epiteliali pigmentate retiniche primarie (RPE) da occhi suini di provenienza locale. Queste cellule rappresentano un'alternativa di alta qualità alle cellule staminali e sono adatte per la ricerca retinica in vitro .

Isolamento di cellule epiteliali pigmentate retiniche primarie suine per la modellazione in vitro

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) agisce come una barriera cruciale tra la coroide e la retina, promuovendo la salute e la funzione dei tipi di cellule retiniche, come i fotorecettori. In questo articolo, descriviamo un protocollo semplice ed efficace per isolare e coltivare l'EPR murino adulto.

Un metodo semplificato per l'isolamento e la coltura di cellule epiteliali pigmentate retiniche da topi adulti

Impara a coltivare cellule epiteliali pigmentate retiniche fetali umane per studiare la fisiologia e la fisiopatologia dell'occhio. Questo metodo riproducibile consente esperimenti in vitro e modelli preclinici per malattie oculari.

Modelli sperimentali per lo Studio di Fisiologia dell'epitelio pigmentato retinico e fisiopatologia

Esplora altri video