Saggio di formazione di sfere: un metodo in vitro per identificare le cellule staminali del cancro del pancreas e le terapie di screening

- L'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) contiene un sottogruppo di cellule staminali tumorali (CSC) esclusivamente tumorigeniche. Le CSC sono autorinnovabili, pluripotenti e in grado di formare tumori. Esprimono proteine anti-apoptotiche e contengono anche geni multiresistenti, che li rendono resistenti alla chemioterapia. Per identificare le cellule staminali tumorali e studiare l'effetto dei farmaci su di esse, eseguiamo un saggio di formazione di sfere.

Innanzitutto, sospendere le cellule staminali tumorali estratte nel terreno di coltura cellulare desiderato. Quindi, seminare la sospensione cellulare in una piastra a più pozzetti e incubare per la durata desiderata. Aggiungere una quantità richiesta di farmaco di interesse in alcuni pozzetti e placebo in altri pozzetti come controllo negativo. Incubare le cellule per la durata desiderata. Le cellule staminali tumorali formano colonie a forma di sfera in un ambiente di coltura non aderente.

Dopo l'incubazione, pipettare una piccola quantità di sospensione cellulare su un emocitometro e inserirla in un contatore di cellule automatizzato. Ora, conta il numero di sfere formate. Le cellule trattate con il farmaco di solito mostrano una sostanziale riduzione delle dimensioni e del numero di sfere. Nel seguente protocollo, eseguiremo un saggio di formazione di sfere per identificare le cellule staminali del cancro del pancreas e valutare l'effetto della metformina.

- Per facilitare la formazione della sfera tumorale per l'arricchimento delle cellule staminali tumorali, diluire le cellule nel volume appropriato di terreno di cellule staminali tumorali a una concentrazione finale di 2 volte 10 per 3 cellule per millilitro e raffreddarle in ghiaccio per alcuni minuti. Quindi, dopo aver aggiunto 500 microlitri di PBS alla prima e all'ultima fila di una piastra a 24 celle a bassissimo attacco, risospendere le cellule con una pipetta e seminare 1 millilitro di cellule per pozzetto nei pozzetti vuoti della piastra.

Trattare quattro pozzetti di cellule con il farmaco di interesse e almeno quattro pozzetti di controllo negativo con veicolo. Quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per una settimana. A giorni alterni, aggiungi un nuovo trattamento o veicolo a ciascuno dei pozzi.

Il giorno 5 o 7, valutare il numero di sfere tumorali formate con un contatore di cellule automatizzato che consente l'identificazione di strutture più grandi. Per il passaggio seriale delle sfere tumorali, il giorno 7, utilizzare un colino cellulare da 40 micrometri per raccogliere le sfere. Successivamente, far girare le sfere e incubarle in 1 millilitro di tripsina per 20 minuti a 37 gradi Celsius per dissociare il pellet in una sospensione a cellula singola. Quindi espandere le celle per altri sette giorni, come appena dimostrato.